专利名称：化合物梅花参皂苷Ananaside C的制备方法及其抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种皂苷类化合物及其制备方法，尤其是从海洋动物梅花参(Thelenota ananas Jaeger)中分离到一种皂苷类化合物及其抗肿瘤的用途。
背景技术：
梅花参(Thelenota ananas J.)，又名“凤梨参”，为海洋棘皮动物(Echinodermata)海参纲(Holothuriae)刺参科(Stichopodidae)动物，其体形很大，长一般为700mm，宽约100mm，高约80mm，广泛分布于我国西沙群岛和台湾南端，具有补肝肾，益精血的功效。
皂苷是梅花参的主要次生代谢产物之一，是其化学防御的主要物质基础，具有抗真菌，抗凝血、抗病毒及免疫调节等各种生物活性。在体外细胞毒活性筛选中，发现梅花参的乙醇提取物具有强烈诱导稻瘟霉(Pyricularia oryzae)菌丝体变形，最小变形浓度MMDC＝8μg/ml，但迄今为止尚不清楚其主要的有效成分，也未见有关其所含的皂苷类成分的化学结构及抗肿瘤活性的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供化合物梅花参皂苷Ananaside C及其制备方法。
本发明还发现了梅花参皂苷Ananaside C用于抗肿瘤的用途。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为
化合物梅花参皂苷Ananaside C，该化合物为无色结晶性粉末，溶点m.p.185～187℃(MeOH-H2O)， Liebermann-Burchard反应和Molisch反应均呈阳性。由电喷雾质谱信号m/z 905[M+Na]+和m/z 859[M-Na]-，推测化合物1的分子量为882。由高分辨质谱HRESI-MS+中准分子离子峰提供的精确分子量m/z 905.3319[M+Na]+(Calc.Mass 905.3316)，结合13CNMR谱，确定该化合物的分子式C41H63O17SNa。红外光谱(KBr)cm-1max-3423，强宽峰(羟基)，1764(羰基)，1637(双键)，1257，1072(υs，磺酸基)。1H-和13C-NMR数据见表1。
用三氟乙酸水解后得到组成皂苷糖链的单糖，衍生得到糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Ananaside C的糖链由木糖、奎诺糖组成，比例为1∶1。
由上述分析得到，梅花参皂苷Ananaside C的化学结构式如下
表1 化合物Ananaside C的的1H和13C核磁共振数据
Xyl木糖，Qui奎诺糖上述梅花参是生长于中国福建海域的梅花参。
本发明还提供制备梅花参皂苷Ananaside C的方法，具体如下将原料梅花参粉碎，用乙醇作为溶剂进行提取，将提取液浓缩得到浸膏，通过大孔吸附树脂柱进行层析分离，收集乙醇洗脱部分，浓缩，得到海参总皂苷；将海参总皂苷应用硅胶柱层析，薄层层析检测，收集含Ananaside C的馏份，浓缩；再经Zorbax SBC18高效液相柱层析进行分离和纯化，得到Ananaside C。
上述Ananaside C应用酸水解，脱硫反应，红外光谱仪，电喷雾质谱仪，高分辨质谱仪，核磁共振氢谱仪，核磁共振碳谱仪，以及多种二维核磁共振谱仪，得到上述海参烷型三萜皂苷化学结构为3-O-{β-D-吡喃奎诺糖(1→2)-4′-O-磺酸钠-β-D-吡喃木糖}-海参烷-9-烯-18，16-内酯环-22，25环氧-3β，12α，17α-三醇。
本发明对梅花参皂苷Ananaside C进行了体外抗肿瘤试验，表明其具有明显的抑制肿瘤的效果。试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即A-549(肺癌)MCF-7(乳腺癌)IA-9(卵巢癌)CAKI-1(肾癌)PC-3(前列腺癌)KB(鼻咽癌)SK-MEL-2(黑色素瘤)HCT-8(肠癌)试验方法为国际通用的SRB法根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl/孔。每个浓度设三复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后用蒸馏水洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定OD值。试验结果见表2。
表2.Ananaside C抗人类肿瘤的疗效试验结果(ED50，μg/ml)
表2的结果表明，Ananaside C对8种不同的肿瘤细胞株均显示明显的抑制作用。
本发明提供了一种新的化合物梅花参皂苷及其制备方法，并发现其有抗肿瘤作用，因此得到了新的治疗肿瘤的药物或为研制新的抗癌药物提供了新的先导化合物，也为开发利用中国的海洋药用生物资源提供了一条重要途径。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1将梅花参(干品)10公斤粉碎，于5倍量(重量)的80％乙醇中浸泡7天，得到乙醇提取液，再重复提取3次，合并提取液，减压回收乙醇后得浸膏；将浸膏混悬于30％乙醇中，以乙醚萃取3～5次，弃乙醚萃取液；下层乙醇液减压回收乙醇后得浸膏；浸膏溶于蒸馏水中，通过DA201-B大孔吸附树脂柱，用水和50％乙醇依次洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得梅花参总皂苷提取物；将总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7.3∶2.7∶1)混合溶剂(下层)洗脱，薄层层析检测，收集含Ananaside C的馏份，再经Zorbax SBC18反相高效液相制备柱分离纯化，以甲醇∶水(65∶35)进行洗脱，得Ananaside C纯品。
实施例2将梅花参鲜品10公斤，分别用5倍量(重量)95％、85％、85％的乙醇依次浸泡浸泡7天后提取乙醇提取液并合并，减压回收乙醇后得流浸膏；将流浸膏溶于3倍量的水中，过滤，滤液通过DA201-B大孔吸附树脂柱，依次用水和50％乙醇洗脱；收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到梅花参总皂苷；将总皂苷进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(7.3∶2.7∶1)混合溶剂(下层)洗脱，薄层层析检测，收集含Ananaside C的馏份，再经Zorbax SBC18反相高效液相制备柱分离纯化，以甲醇∶水(65∶35)进行洗脱，得Ananaside C纯品。
权利要求
1.一种化合物梅花参皂苷Ananaside C，其特征在于具有如下化学结构
2.权利要求1所述的化合物梅花参皂苷Ananaside C的制备方法，其特征在于步骤如下(1)提取将原料梅花参粉碎，用乙醇作为溶剂进行提取，将提取液浓缩得到浸膏，通过大孔吸附树脂柱进行层析分离，收集乙醇洗脱部分，浓缩得到海参总皂苷；(2)分离将上述海参总皂苷应用硅胶柱层析，薄层层析检测，收集含Ananaside C的馏份，浓缩；再经Zorbax SBC18高效液相柱进行分离和纯化，得到Ananaside C。
3.如权利要求2所述的化合物梅花参皂苷Ananaside C的制备方法，其特征在于(1)提取浸泡时乙醇浓度为30～95％、用量为梅花参的2～5倍量(重量)，冷浸提取7天，重复提取2～4次；大孔树脂柱层析时，将浸膏混悬于水中，依次用水和10～90％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇；(2)分离薄层层析以氯仿∶甲醇∶水(7∶3∶1)混合溶剂梯度洗脱，高效液相柱柱层析以甲醇∶水(65∶35)进行洗脱。
4.权利要求1所述化合物梅花参皂苷Ananaside C治疗肿瘤的用途。
全文摘要
本发明涉及一种皂苷类化合物及其制备方法，尤其是从海洋动物梅花参中分离得到一种皂苷类化合物及其抗肿瘤的用途。化合物梅花参皂苷Ananaside C，其分子式C
文档编号A61K31/585GK1986560SQ200610155468
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月26日 优先权日2006年12月26日
发明者巫军 申请人:巫军