专利名称：：一种表达抑制细胞生长多肽的腺病毒的构建及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含有编码由25个氨基酸构成的能抑制细胞生长的多肽(甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)核酸序列的腺病毒。同时，本发明还涉及这一腺病毒的制备和纯化，在制备抗肿瘤药物中的用途以及在肿瘤及其它增殖性疾病治疗中的应用，属于医学生物工程药物领域。二
背景技术：
：肿瘤是-种严重危害人类健康的疾病，目前其死亡率在国内已成为仅次于心脑血管疾病的第二位致死病因。临床中主要应用化疗、放疗及手术治疗，这些方法形成了比较成熟的治疗体系，取得了较好的效果。然而，由于这些方法选择性低，难以避免毒副作用强、正常细胞和肿瘤之间治疗窗口小等缺点，因此亟待研发新的有效治疗方法。近来肿瘤细胞生物学的快速发展，为满足这一社会需求提供了现实的可能性，其中，随着细胞的信号转导途径(Signalingtransductionpathways)的阐明，发现了越来越多可川作治疗肿瘤的药靶。有一些已经成功的应用于临床，取得了非常好的效果。比如在许多乳腺癌细胞中ErbB2(—种能促进蛋白磷酸化的上皮生长因子受体)过度表达，并且其蛋白激酶活性也增强，应用一种特异性针对这-蛋白单克隆抗体能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，亂断这一蛋白介导的信号转导。这--抗体目前已进入临床使用。细胞生长的信号由细胞内外促进生长的因子经过--系列蛋白参与传递到细胞核，引起细胞周期的许多调节蛋白结构和功能变化而导致细胞分裂。在这些调节细胞生长周期的蛋白中，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是—个具有脂磷酸化激酶和蛋白磷酸化激酶活性的酶蛋白，其激酶活性受到许多信号传递分子的影响。由于磷脂酰肌醇-3-激酶在细胞生长调节中的极重要的作用，这一蛋白是目前研究开发治疗肿瘤新药的重要靶标之一。至今为止，已发现多个磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的抑制剂，但由于磷脂酰肌醇-3-激酶的酶活性也是体内--些宽要生理功能所必需的(比如胰岛素调节人体内血糖和其它物质和能量代谢过程)，而这些抑制剂在抑制磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的同时，往往也阻断了这些生理功能，具有很强的毒性，所以在治疗疾病中的应用受到较大限制。2003年，我们发现了细胞生长周期的调节蛋白一视神经母细胞瘤蛋白(Rb)和磷脂酰肌醉-3-激酶的一个调节亚基的相互作用。磷脂酰肌醇-3-激酶由调节亚基和催化亚基组成，催化亚基催化某些脂类及蛋白质上的丝氨酸和苏氨酸磷酸化的活性是磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白的核心效应组成部分，然而，催化亚基的活性受调节亚基的调控，调控通过以下两个机制实现(1)催化亚基的活性本身受调节亚基影响；(2)调节亚基通过和其他蛋白的相互作用把催化亚基定位于目标蛋白。我们研究发现，视神经母细胞瘤蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶的相互作用是由磷脂酰肌醇-3-激酶中的55千道尔顿的调节亚基(p55PIK)中氨基端1-25号氨基酸(序列为甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)参与的，该多肽片段被称为Rb结合功能区(以下称为N25)，它把PI3K和Rb相互连接在一起，PI3K的蛋白激酶活性导致了Rb的磷酸化，从而引起了细胞分裂。我们进一步的实验结果证明在细胞中表达P55PIK中N25的多肽，这一多肽能有效地结合于Rb，竞争性抑制细胞内PI3K和Rb的结合，由于这个多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽结合Rb将抑制Rb的磷酸化过程，保持Rb抑制细胞生长的功能，从而阻止肿瘤细胞分裂。除Rb外，我们新的的实验结果也证实N25多肽在细胞内还能阻止p55PIK和其他细胞周期调节分子的结合，也能有效地抑制细胞的分裂过程。
发明内容虽然试验结果证明在细胞中表达的N25多肽能有效抑制细胞生长，但由于N25多肽自身不能穿过细胞膜，导致直接应用N25多肽作为药物的疗效并不理想，另外采用化学合成N25多肽的成本较髙，所以N25多肽药物的临床应用受到了一定的限制。大量实验证实，自然界中存在一些病毒能感染人体细胞。这些病毒进入细胞后能有效地使用宿主细胞合成病毒颗粒自身所需蛋白质，如果在这些病毒基因组插入编码其它外源蛋白的核酸序列，那么，重组病毒进入细胞后，这些外源蛋白也能得到表达。因此，人们研发了一些能在细胞内表达外源蛋白的重组病毒，利用这些病毒把治疗^症多肽或药物带到肿瘤细胞内。复制缺陷型(r印lication-deficient)的腺病毒(adenovirus)是目前最常用的细胞内表达外源蛋白的病毒之一。这种病毒载体的受体广泛存在于各种不同的人类细胞中，这些细胞都能被腺病毒感染。另外在复制缺陷型的腺病毒中，野生型腺病毒的基因组中某些有关病毒裂解宿主细胞的序列已被去掉，失去了裂解细胞的能力，大大降低了腺病毒的毒性。世界上首个利用这种腺病毒表达抑癌翠白p53用于治疗头颈部肿瘤的药物已在中国投入临床使用，证明了这种腺病毒作为投送治疗癌症多肽到肿瘤细胞中在临床使用的有效和低毒性。为了提髙N25多肽抑制细胞生长的效率，本发明利用分子生物学技术，将编码N25多肽的核酸序列插入到复制缺陷型腺病毒基因组中，构建了在细胞中有效表达N25的腺病毒。我们在几种不同的人类肿瘤细胞培养系中加入这种腺病毒，这些细胞的DNA合成及其他几个证明细胞生长的观察指标都显著降低，证明了这一腺病毒具有抑制细胞生长的能力。更重要的是，该腺病毒能有效地抑制多种肿瘤动物体内生长模型中的肿瘤生长。与现有抑制细胞生长的方法相比，本发明有以下特点(1)表达N25多肽的腺病毒感染细胞或注射到肿瘤中，能够抑制细胞的增殖及肿瘤的生长。证明用腺病毒表达N25是一种有效的投送方式。类似的其它病毒栽比如类腺病毒(Adenovirus-AssociatedVirusAAV)，逆转录病毒(Retrovirus)等也预期是有效地投送编码N25核酸的载体，应用各种病毒载体投送N25多肽在肿瘤药物的开发领域有极大的前景。(2)N25多肽的序列存在于人类细胞的蛋白质序列中，毒副作用低，抗原性弱，实验结果也表明其对细胞凋亡或死亡没有明显影响，对正常细胞没有明显的杀伤作用。表达N25的腺病毒加入培养细胞和应用于动物体内，也没有观察到明显的毒性。(3)应用表达N25多肽的腺病毒能有效抑制多种人类和鼠类肿瘤细胞在体内和体外培养系统中的生长，证明该腺病毒在肿瘤等细胞生长异常疾病的治疗方面具有高效、广谱等优点。(4)腺病毒生产过程比较简单，生产效率高，而且生产成本低，便于大规模生产，有利直接应用于临床。具体实施例方式例l:在复制缺陷型腺病毒基因组中引入编码p55PIKN25组成的融合多肽的cDNA序列。含有复制缺陷型腺病毒DNA(亚型5，Subtype5)pAd-Easyl和pShuttle-CMV质粒由美国刘岳群博士惠赠。pShuttle-CMV质粒用fcoAV酶切，酶切后的质粒在琼脂糖胶中分离、纯化，用于以后的连接反应。从胶中回收DNA片段的试剂盒来自德国Qiagen公司(产品目录号为28704)。编码小鼠p55PIK全长蛋白的cDNA来源于小鼠睾丸组织cDNA文库(美国Stratagene公司，目录号为937308)，克隆到pcDNA3(购于Invitrogen公司，目录号为V79020),用于扩增N25cDNA的PCR引物序列为引物1:TTTTTGATACTAGTGMCCGTCAGATCCG引物2:TTTTTGATACTCTACAACAAATGTGGTATGGCTGAPCR条件9化2分钟94TCl分钟、551Cl分钟、72t2分钟共25个循环；72"延伸5分钟。PCR试剂盒来自美国Promega公司(目录号为M1861)，PCR产物经过纯化后(纯化用的试剂盒来自德国Qiagen公司，产品目录号为28704)，用五co^V醵切；再用琼脂糖胶纯化，然后和酶切纯化后的载体进行连接反应(连接试剂盒来自美国Promega公司，目录号为M1801)。转化细菌后(感受态细菌g自美国Promega公司，目录号为L2001)，克隆用常规菌落PCR进行筛选。选出阳性克隆，其cDNA序列的正确性通过核酸序列测定得到证实后，大规模纯化制备质粒(大规模纯化试剂盒来自美国Promega公司，目录号为A7270)，用于以后的实验。质粒用化el酶切和pAd-EasylI质粒共同转化BJ5183感受态细菌，克隆用常规菌落PCR进行筛选编码GFP-N25序列重组到Ad-Easy基因组中的克隆，把这些克隆扩大培养，并进行质粒提取，得到含有编码GFprN25序列的腺病毒质粒。腺病毒质粒由尸acl酶线性化，再转染到人肾胚细胞293中。在293细胞中，重组腺病毒核酸和构成病毒的蛋白质形成能裂解细胞的腺病毒颗粒，收集293细胞培养的上清液，即得到表达GFP-N25的腺病毒制备液。腺病毒颗粒经过扩增放大和氯化铯(CsCl)超速离心纯化后，用生理盐水透析去掉氯化铯(具体过程见有关的出版物)。纯化后的腺病毒贮存于-701C冰箱。例2:表达N25的腺病毒影响细胞生长及细胞周期的实验。用HT29细胞(人直肠癌细胞系，购自美国ATCC)检测表达N25多肽的腺病毒(以下称为Ad-GFP-N25)对细胞生长的影响。HT29细胞在含l(Mb胎牛血清的DMEM培养液，37X:，5%C02/95%空气培养条件下培养于IO厘米细胞培养皿，将细胞培养至对数生长期后，加入Ad-GFP-N25腺病毒(50个腺病毒/细胞)，另外，只表达GFP的腺病毒(以下称为Ad-GFP)用作对照，腺病毒孵育细胞6小时后，去掉腺病毒，加入新培养液到细胞中，培养48小时后收取细胞，利用流式细胞仪分析分析这些细胞的细胞周期分布。实验结果表明在这一剂量下Ad-GFP-N25腺病毒对细胞凋亡没有明显影响，增加G0/G1期细胞数，其作用见下表。表l:TAT-N25对细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>DNA合成是细胞增殖的标志。下一个实验中，我们检测Ad-GFP-N25腺病毒对细胞DNA合成的影响。因为BrdU为胸腺嘧啶类似物，在DNA合成的S期可掺入到DNA中，掺入到DNA的BrdU经过免染色后,利用荧光显微镜确定有BrdU掺入到了DNA的细胞，以确定表达GFP-N25对DNA合成的影响。结果显示加入Ad-GFP-N25腺病毒后，肿瘤细胞中有DM合成的S期的细胞数目大量减少(见表2)，这说明N25多肽抑制了DNA的合成，减少了肿瘤细胞的增殖。表2:Ad-GFP-N25抑制细胞DNA合成<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>例3:Ad-GFP-N25腺病毒抑制HT29.在小鼠内形成肿瘤的实验在小鼠的皮下注射HT29细胞(5xl06)后，将小鼠随机分成三组。当小鼠皮下能够观察到肿瘤后，向肿瘤中分别注射0.1毫升生理盐水，Ad-GFP腺病毒(10-病毒)，Ad-GFP-N25腺病毒(10'病毒)，注射后每隔两天测量小鼠皮下肿瘤的大小。14天后杀死小鼠，取出鼠内肿瘤称重，进行其他检测。结果显示，与注射生理盐水和Ad-GFP对照组相比，注射Ad-GFP-N25治疗的小鼠皮下的肿瘤明显要小，同时切片分析和其他测试的结果也证明Ad-GFP-N25有效抑制了HT29细胞在小鼠内形成的肿瘤,，表3:Ad"GFP-N25腺病毒抑制HT29在小鼠内生长的肿瘤<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>氨基酸和核苷酸序列表<110>夏献民<120〉表达抑制细胞生长多肽的腺病毒的构建及其在肿瘤等与细胞生长异常相关的疾病治疗中的用途<160>2<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homosapiens)<220><400>1MetAspArgAspAspAlaAspTrpArgGluValMetMetProTyr151015SerThrGluUuliePheTyrlieGluMet2025<210>2<211>75<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(l)...(75)<400>2ATGGACCGCGATGACGCAGACTGGAGGGAG30MetAspArgAspAspAlaAspTrpArgGlu1510GTGATGATGCCCTATTCGAiCAGAACTGATA60ValMetMetProTyrSerThrGluLeulie1520TTTTATATTGAAATG75PheTyrlieGluMet2权利要求1.一种含有表达抑制细胞生长多肽的核酸序列腺病毒构建体。2.权利要求1所述的多肽，其特征在于抑制细胞生长的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基p55PIK中氨基端25个氨基酸残基组成的多肽，其序列为甲硫氨酸-天门冬氨酸-精氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-异亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-异亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸(MDRDDAD冊EVMMPYSTELIFYIEM)，或是从该多肽氨基端连续或间断地缺失或取代自然数1一12中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，或是将所述多肽的序列经过一个或几个氨基酸残基的添加得到的具有抑制细胞生长活性的多肽之3.编码权利要求l中多肽和另外一段核酸序列的多聚核酸。4.含有权利要求3中的核酸载体是一个病毒衍生的载体。5.含有权利要求4的宿主细胞。6.包括权利要求1至4之一项所述核酸、权利要求1至4所述载体或权利要求5所述细胞的药物组合物。7.权利要求6所述的药物组合物，其进一步包括药物学上可接受的载体、赋形体或佐剂。8.权利要求6或7所述的药物组合物在治疗疾病中的用途。其特征是该药物组合物在结肠癌、食管癌、胃癌和胃肠道其他肿瘤、肝癌、肉瘤，内分泌活化肿瘤，白血病，何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤，头颈部和耳鼻喉部肿瘤，肺癌、乳腺癌和其他妇科肿瘤、前列腺癌和其他泌尿生殖器官肿瘤等肿瘤及其它与细胞生长异常有关的疾病治疗中的应用。全文摘要本发明公开了一种表达磷脂酰肌醇-3-激酶的调节亚基p55PIK中氨基端25个氨基酸(N25)的多肽的腺病毒。本发明还提供了这一腺病毒构建方法、生产工艺和流程、以及该腺病毒治疗多种疾病特别是各种肿瘤疾病中的具体作用，属于医学生物工程药物领域。文档编号A61P35/00GK101100679SQ200710052268公开日2008年1月9日申请日期2007年5月24日优先权日2007年5月24日发明者周剑峰,夏献民,程爱武,胡俊波申请人:夏献民