专利名称：：超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶囊及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干4分的制备方法以及包含其的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢。这种超浓縮胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢是通过脂质体技术制成的。
背景技术：
：胎盘中药名为紫河车，具有调节人体机能、增强抵抗力、大补元气精血的作用。胎盘素是从胎盘中提取出来的药用成分，含有多种激素和生物酶。以前胎盘素的提取多采用蒸煮浓缩的方法。本发明人通过研究，提供了一种利用二氧化碳超临界萃取提取胎盘素的方法，请参见中国专利200410096974.0,利用该方法提取的胎盘素具有所提取的胎盘素中的活性成分不会流失，而且胎盘中的胎盘素提耳又比4交《切底的优点。本发明人将利用二氧化碳超临界萃取法提取的胎盘素制成了针剂，^旦针剂产品具有给;波注射人带来注射痛苦、使用风险较高，不方便携带的缺点，而原来利用蒸煮工艺方法获得胎盘素具有胎盘中的一些活性基因调控因子和部分代谢调控酶会因高温作用而失活的缺点。因此，对于提供一种更便于使用，没有注射痛苦、使用风险低，方便携带，而且能充分保持活性基因调控因子和代谢调控酶的胎盘素产品具有广泛和迫切的需要。此外，利用二氧化碳超临界流体低温萃取技术(SFE)虽然在胎盘素的提取分离水平上获得了较大突破，使用该技术提取的人体胎盘的成份可较传统工艺提高1100多倍，且其提取成份的分子量專交传统方法更小、更利于人体吸收，该纟支术最大优点是可几乎100%保留提取成份的生理活性。但是，利用SFE技术"活性提取"的胎盘素还存在产品的分子量还不够小，人体最终吸收融合的胎盘素核心成分仍达不到4艮高的水平的问题。因此，针对目前利用SFE技术提取的胎盘素的分子量仍然较大的问题，本发明人4是供了一种利用生物纳米技术(bionanotechnicology)^是取的胎盘素，该月台盘素的冲亥心成分净皮制成粒径为1~1OOnm的超樣i颗粒。实-睑证明，利用生物纳米^支术制备的胎盘素纳米颗粒比现有的胎盘素在以下方面具有显著的提高①提高胎盘素的溶解度与生物有效性；②增强原有功效，增加新的功效；③"R升传统给药途径；④提高胎盘素与人体蛋白的相互作用性。
发明内容为了实现该目的，本发明的一个方面提供一种利用二氧化碳超临界萃取方法以及超低温冷冻干燥提取方法制备超浓缩胎盘素纳米活细力包冻干4分的方法。本发明的另一方面提供一种利用二氧化碳超临界萃取方法以及超低温冷冻干燥提取方法制备的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，这种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千胶嚢是通过脂质体技术制成的。本发明提供了一种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉的制备方法，包4舌a)将胎盘在-5。C-6。C的条件下经过冷冻干燥5-6小时，研制成粉末；b)将得到的胎盘粉末装入萃取釜中，通入30~40MPa的二氧化碳，在304(TC的条件下萃取；c)进行二级减压分离，获得胎盘素，一级减压分离条件为操作压力812MPa,温度为30-35。C;二级减压分离条件为才喿作压力在6MPa,温度为15—25。C;d)将利用二级减压分离所得到的胎盘素产物在无菌条件下于无菌水中匀浆，利用离心才几离心，离心条件为3500~4000rmp;过滤，得到第一清液；e)将第一清液用截留分子量为3000-5000道尔顿的超滤膜超滤1~2次，得到第一超滤液，该第一超滤液的尺寸在1~100nm范围内，即为纳米胎盘素超滤液；f)将所得到的尺寸在1-100nm范围内的第一超滤液在无菌条件下进行超J氐温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉。可选地，该方法还包括h)将被截留的高分子量的大分子产物移出，利用限制性或半限制性内切酶在30~40°C下对胎盘素中大分子量的核酸或多肽进行限制性酶内切反应；i)将经限制性酶内切反应之后得到的胎盘素产物在无菌条件下利用离心才几离心，离心条件为3500-4000rmp;过滤，得到第二清液；j)将第二清液用截留分子量为3000-5000道尔顿的超滤膜超滤1-2次，得到第二超滤液，该第二超滤液的尺寸在1~100nm的范围内，即为纳米胎盘素超滤液；k)将所得到的第二超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干#分。优选地，进一步包括g)将由步骤f)或步骤k)得到的所述超浓缩的纳米胎盘素冻干粉在无菌条件下按一定的单位剂量封装于胶嚢包衣内，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶囊。优选地，本发明的胶嚢是利用脂质体技术制得的。优选地，本发明的胶嚢包衣选自由聚乙烯醇、改性壳聚糖、明胶、海藻酸钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡卩各烷酮、聚乙烯吡p各烷酮-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯醇缩乙醛-二乙氨基醋酸共聚物、二乙氨基乙基丙烯酸甲酯-曱基丙烯酸甲酯共聚物、邻苯二曱酸醋酸纤维素，邻苯二曱酸羟丙基甲基纤维素、六氢邻苯二甲酸醋酸纤维素、六氢邻苯二甲酸羟丙基曱基纤维素、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚曱基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟丙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸4-羟丁酯、聚甲基丙烯酸4-羟丁酯，及其共聚物或掺和物构成的组中。优选地，本发明的胶嚢包衣是胃溶性的或肠溶性的。本发明还提供了一种利用上述方法制备的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，包括由上述超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千粉制备方法制4寻的超浓缩胎盘素纳米活细力包冻干4分以及力交嚢包衣。优选地，本发明的胶嚢是通过脂质体技术制成的。优选地，本发明采用的限制性内切酶为Mmel,TCCRAC(20/18);Eco571，CTGAAG(16/14);Eco57MI，CTGRAG(16/14);或Bce831,CTTGAG(16/14)。其中，Mmel，TCCRAC(20/18)是指Mmel酶识别的片断为TCCRAC，其酶切位点则位于该片断下游第20个核苷酸，在互补链上的酶切位点则位于该片断下游第18个核苷酸，其它的限制性内切酶具有类似的含义。可选地，本发明的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，还包括药用I武形剂。具体实施例方式以下根据具体实施方式对本发明进行具体描述，其仅仅是为了更清楚地理解本发明，而不应用来限制本发明的保护范围，所有的等同替换均应包括在发明的范围内。在本发明的一个具体实施方式中，提供了一种利用二氧化^友超临界萃取方法以及超低温冷冻干燥提取方法制备超浓缩胎盘素纳米活细力包冻干4分的方法，i亥方法包4舌a)将胎盘在-5t:-6"的条件下经过冷冻千燥5~6小时，研制成粉末；b)将得到的胎盘粉末装入萃取釜中，通入30~40MPa的二氧化碳，在304(TC的条件下萃取；c)进行二级减压分离，获得胎盘素，一级减压分离条件为操作压力8-12MPa,温度为30-35°C;二级减压分离条件为操作压力在6MPa,温度为1525。C;d)将利用二级减压分离所得到的胎盘素产物在无菌条件下于无菌水中匀浆，利用离心才几离心，离心条件为3500-4000rmp;过滤，4f到第一清液；e)将第一清液用截留分子量为3000-5000道尔顿的超滤膜超滤1~2次，得到第一超滤液，该第一超滤液的尺寸在1~100nm范围内，即为纳米胎盘素超滤液；f)将所得到的尺寸在1-100nm范围内的第一超滤液在无菌条件下进4于超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉。在一优选具体实施方式中，该方法还包括h)将被截留的高分子量的大分子产物移出，利用限制性或半限制性内切酶在30~4(TC下对胎盘素中大分子量的核酸或多肽进行限制性酶内切反应；i)将经限制性酶内切反应之后得到的胎盘素产物在无菌条件下利用离心机离心，离心条件为3500-4000rmp;过滤，得到第二清液；j)将第二清液用截留分子量为3000-5000道尔顿的超滤膜超滤1~2次，得到第二超滤液，该第二超滤液的尺寸在1-100nm的范围内，即为纳米胎盘素超滤液；k)将所得到的第二超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉。在另一具体实施方式中，进一步包括g)将由步骤f)或步骤k)得到的所述超浓缩的纳米胎盘素冻千粉在无菌条件下按一定的单位剂量封装于胶嚢包衣内，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干月交嚢。在一具体实施方式中，本发明的胶嚢是利用脂质体技术制得的。在另一具体实施方式中，本发明的胶嚢包衣选自由聚乙烯醇、改性壳聚糖、明胶、海藻酸钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙晞酯共聚物、聚乙烯醇缩乙醛-二乙氨基醋酸共聚物、二乙氨基乙基丙烯酸甲酯-曱基丙烯酸曱酯共聚物、邻苯二曱酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、六氬邻苯二甲酸醋酸纤维素、六氢邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚曱基丙烯酸曱酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟丙酯、聚曱基丙烯酸羟丙S旨、聚丙烯酸4-羟丁酯、聚甲基丙烯酸4-羟丁酯，及其共聚物或捧和物构成的组中。在一具体实施方式中，本发明的胶嚢包衣是胃溶性的。而在另一具体实施方式中，本发明的胶嚢包衣是肠溶性的。在本发明的一具体实施方式中，提供了一种利用二氧化碳超临界萃取方法以及超^f氐温冷冻干燥^是取方法制备的超浓缩的纳米胎盘素胶嚢，这种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢是通过脂质体技术制成的。在本发明的一具体实施方式中，提供了一种利用上述方法制备的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，包括由上述超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉制备方法制得的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉以及力交嚢包衣。在另一具体实施方式中，本发明的胶嚢是通过脂质体技术制成的。除非有明确的限定，所有现有技术公开的脂质体l支术都可以应用本发明中。在一优选具体实施方式中，本发明采用的限制性内切酶为Mmel，TCCRAC(20/18);Eco571,CTGAAG(16/14);Eco57MI，CTGRAG(16/14);或Bce831，CTTGAG(16/14)。其中，Mmel，TCCRAC(20/18)是指Mmel酶识别的片断为TCCRAC，其酶切位点则位于该片断下游第20个核苷酸，在互补链上的酶切位点则位于该片断下游第18个核苷酸，其它的限制性内切酶具有类似的含义。在一具体实施方式中，本发明的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，还包括药用赋形剂。除非有明确的限定，所有现有技术公开的药用赋形剂只要与本发明的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉相容的药用赋形剂都可以应用本发明中。实施例1超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉的制备方法及其制得的胶囊a)将新鲜的胎盘在-5°C~-6°C的条件下冷冻干燥5~6小时，研制成粉末；b)将得到的胎盘粉末装入11的萃取釜中，通入大约30MPa的二氧化碳，在30-40。C的条件下萃取；c)进行二级减压分离，一级减压分离条件为才乘作压力8~12MPa，温度为30~35°C;二级减压分离条件为操作压力为大约6MPa,温度为15~25°C,从而获得胎盘素；d)将利用二级减压分离所得到的胎盘素产物在无菌条件下于无菌水中匀浆，利用离心机离心，离心条件为3500-4000rmp;过滤，得到第一清液；e)将第一清液用截留分子量为大约3000道尔顿的超滤膜超滤1~2次，得到第一超滤液，该第一超滤液的尺寸在1~lOOnm范围内，即为纳米胎盘素超滤液；f)将所得到的尺寸在1-100nm范围内的第一超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉。g)将由步骤f)得到的所述超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千粉在无菌条件下按一定的单位剂量封装于由邻苯二曱酸羟丙基甲基纤维素制成的胶嚢包衣内，得到肠溶性的超浓缩的纳米胎盘素胶嚢。h)将被截留的分子量大于3000的大分子产物移出，利用限制性或半限制性内切酶Mmel,TCCRAC(20/18)在3040。C下对月台盘素中大分子量的核酸或多肽进4亍限制性酶内切反应；i)将经限制性酶内切反应之后得到的胎盘素产物在无菌条件下利用离心才几离心，离心条件为3500-4000rmp;过滤，^寻到第二清液；j)将第二清液用截留分子量为大约5000道尔顿的超滤膜超滤1~2次，得到第二超滤液，该第二超滤液的尺寸在1~100rnn的范围内，即为纳米胎盘素超滤液；k)将所得到的第二超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩的纳米胎盘素冻干粉。1)将由步骤k)得到的所述超浓缩的纳米胎盘素冻干粉在无菌条件下按一定的单位剂量封装羟乙基纤维素的胶嚢包衣内，得到胃溶性的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢。实施例2浓缩胎盘素纳米活细;!^嚢的^吏用效果本实验是以轻度早衰者为观察对象进行的。第一阶段在受试者服用按一定的单位剂量封装的超浓缩胎盘素纳米活细力包冻干力交嚢10~20天后(每天一次，每次一粒)。在此第一阶4爻受试者的外观表现为面部有光泽、红润，容光煥发，皮肤开始湿润、有水分，用手摁皮力夫有弹性，斑痕初步淡化，皱紋变浅。*受试者的生理表现为疲劳感消除、体力增强、精力旺盛、食名夂增加、睡眠改善并有深度睡眠、性功能明显增强。第二阶)殳在受试者服用服用按一定的单位剂量封装的超浓缩胎盘素纳米活细"包冻干"交嚢30~50天后。在此第二阶_歐*受试者的外》见表现为容光煥发，皮肤质地明显改善，主要是肌肤光泽度、水分度、弹性度显著增加，毛孔缩小，黑眼圏消失，色素开始消失，面部深层皱紋变浅、逐步々包满，细小皱紋消失，色斑变淡至消失，部分老年斑可消失，头发再生、乌黑发亮，大小腿脂肪减少，腹部脂肪减少，体态外形变美，臀部脂肪减少，乳房丰满，胸围增大，重塑丰韵形体。參受试者的生理表现为身体抵抗力增强，睡眠质量明显提高，精力充沛，身体素质整体提高。患疾病者会出现更年期综合症症状改善、消失，关节疼痛消失，风湿明显改善，高血压眩晕者症状消失，无心慌，无气短，血压平稳，顽固性头疼者得到改善，腰肌劳损明显改善，感冒不复发，呼吸道疾病明显好转，心血管疾病好转，血压、血糖血脂持续维持正常，尿糖转阴，肝功能好转或正常，肿瘤控制或缩小。第三阶段受试者在服用服用按一定的单位剂量封装的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢60-80(或120)天及以后。在此第三阶段*受试者外，见表现为皱紋舒展消失，色J&消失，"几力夫白里透红、白皙柔嫩，润泽有弹性、靓丽光泽，容光煥发，神采奕奕，体态变得匀称，延緩衰老。受试者在服用IO个月后的外观表现的结果总结在表1中。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*附注出现两项或以上即为有效。因个体的差异，本产品对不同个体的表现存在差别。*受试者的生理表现为体质全面上升，免疫功能大幅^提高，人体新陈代谢正常，神经内分泌协调，妇科疾病明显减少，精力充沛，人体充满健康活力，部分过早绝经的女性能恢复行经。本发明的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千胶嚢，其是采用二氧化碳超临界萃取技术进行提取，并利用生物内切酶技术进行分子的酶内切反应，使得被酶内切的胎盘素成为纳米级的胎盘素分子，并利用超低温冷冻干燥以及脂质体技术得到的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千力交嚢。利用本发明方法得到的超浓缩胎盘素纳米活细^^东干月交嚢，最大限度地保持了胎盘的活性成份，并采用脂质体技术得到的胶嚢，更能帮助人体吸收胎盘素。从而改善力良用者的皮力夫状况，健胸美乳，增强皮肤弹性，促进造血机能，延緩衰老，提高机体免疫力，增强i己忆，调节内分泌，？文善妇女生J里才几能。经才企—验，通过本发明方法得到的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢含有各种氨基酸、活性肽、矿物质、核酸、各种蛋白酶、细胞分裂素、维4也命，如VB1、VB2、VB6、VE、VC等。利用本发明得到的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干月交嚢月良用方便，避免了注射剂的缺点，更便于使用，没有注射痛苦、使用风险低，方便携带，而且能充分保持活性基因调控因子和代谢调控酶。利用本发明提供的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉制备方法，能够1、能揭JF又胎盘中富含的8000多种活性物质，4是取率可高达99%以上。2、利用该方法提取的胎盘活性成份的分子量可纯化分离到最4氐3000道尔顿；3、利用该方法获得的超浓缩纳米胎盘素的活性程度和活性物质含量4妻近胎盘素注射液；4、实验证明利用该方法提取的胎盘成份的活性可较单纯利用二氧化碳超临界萃取得到的胎盘素产品提高约67.73%。权利要求1.一种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉的制备方法，包括a)将胎盘在-5℃～-6℃的条件下经过冷冻干燥5～6小时，研制成粉末；b)将得到的所述胎盘粉末装入萃取釜中，通入30～40MPa的二氧化碳，在30～40℃的条件下萃取；c)进行二级减压分离，获得胎盘素，一级减压分离条件为操作压力8～12MPa，温度为30～35℃；二级减压分离条件为操作压力在6MPa，温度为15～25℃；d)将所述经二级减压分离得到的胎盘素产物在无菌条件下于无菌水中匀浆，利用离心机离心，离心条件为3500～4000rmp；经过滤，得到第一清液；e)将所述第一清液用截留分子量为3000～5000道尔顿的超滤膜超滤1～2次，得到第一超滤液，所述第一超滤液的尺寸在1～100nm范围内；f)将所述得到的尺寸在1～100nm范围内的第一超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉。2.根据权利要求1所述的制备方法，进一步包括h)将被截留的高分子量的大分子产物移出，利用限制性或半限制性内切酶在30~40。C下对胎盘素中大分子量的核酸或多肽进行限制性酶内切反应；i)将所述经限制性酶内切反应之后得到的胎盘素产物在无菌条件下利用离心冲jL离心，离心条件为3500~4000rmp;过滤，得到第二清液；j)将所述第二清液用截留分子量为3000~5000道尔顿的超滤膜超滤1-2次，得到第二超滤液，所述第二超滤液的尺寸在1~100nm的范围内；k)将所述得到的第二超滤液在无菌条件下进行超低温冷冻干燥处理，得到超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千粉。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，进一步包括g)将由步骤f)或步骤k)得到的所述超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千粉在无菌条件下按一定的单位剂量封装于胶嚢包衣内，得到超浓缩胎盘素纳米活细^9包冻干"交囊。4.才艮据权利要求3所述的制备方法，其中所述超浓缩胎盘素纳米活细胞冻千胶嚢是利用脂质体技术制得的。5.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述胶嚢包衣是肠溶性的。6.根据权利要求3所迷的制备方法，其中所述胶嚢包衣是胃溶性的。7.根据权利要求2所述的制备方法，其中所述限制性内切酶为Mmel,TCCRAC(20/18);Eco571,CTGAAG(16/14);Eco57MI，CTGRAG(16/14);或Bce831，CTTGAG(16/14)。8.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述胶囊包衣选自由聚乙烯醇、改性壳聚糖、明胶、海藻酸钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基曱基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮-乙酸乙晞酯共聚物、聚乙烯醇缩乙醛-二乙氨基醋酸共聚物、二乙氨基乙基丙烯酸甲S旨-曱基丙埽酸甲酯共聚物、邻苯二曱酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、六氢邻苯二甲酸醋酸纤维素、六氢邻苯二曱酸羟丙基曱基纤维素、聚丙烯酸曱酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚曱基丙晞酸甲酯、聚曱基丙烯酸乙酯、聚丙烯酸丁酯、聚丙烯酸羟乙酉旨、聚曱基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟丙酯、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸4-羟丁酯、聚曱基丙烯酸4-羟丁酯，及其共聚物或掺和物构成的组中。9.一种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，所述胶嚢包括才艮据4又利要求1~8所述的方法制备的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干4分以及力交嚢包衣。10.根据权利要求9所述的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶嚢，所述月交嚢进一步包括赋形剂。全文摘要本发明提供了一种超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉的制备方法，以及包括由该方法制备的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干粉的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶囊。在本发明的制备方法中采用了二氧化碳超临界萃取、超低温冷冻干燥技术以及生物纳米技术。本发明的超浓缩胎盘素纳米活细胞冻干胶囊是利用脂质体制备技术得到的。文档编号A61K47/36GK101306019SQ20071010791公开日2008年11月19日申请日期2007年5月15日优先权日2007年5月15日发明者陈包容申请人:陈包容