专利名称：：重组人血管内皮抑制素组合物缓释微球的制备方法
技术领域：
：一种重组人血管内皮抑制素组合物缓释微球的制备方法，包括将含有亲水性的重组人血管内皮抑制素的组合物直接分散在含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂中，挥发有机溶剂得到缓释微球制剂。
背景技术：
：研究发现，实体瘤在生长和转移过程中，需要血管的生成来提供营养，此时肿瘤细胞会发出一些信号来促进血管向肿瘤组织增生，一些内源性血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin能够阻碍血管在肿瘤组织中的生长，使肿瘤的生长和转移处于停滞(O'Rdly,M.S.,Wa/.Ce〃.79:315-328,1994;O，Relly,M.S.,"a/.CW/.88:277-285,1997),美国哈佛医学院的Folkman教授在上世纪七十年代提出了用血管内皮抑素(Endostatin)来抑制肿瘤生长的"饿死肿瘤疗法"理论。但由于Endostatin在表达制备过程中存在着易于沉淀和复性困难等问题，限制了其在肿瘤患者中的大规模应用。罗永章教授等人通过修饰人血管内皮抑制素的核苷酸编码序列，生产出N末端带有9个附加氨基酸序列的重组人血管内皮抑制素(取名为Endostar，中文名恩度)(ZL00107569.1)，其氨基酸序列为VLCIENSFMTASK，其中当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除。重组的人血管内皮抑制素恩度保持内源性Endostatin的所有生物活性，同时解决了Endostatin在生产过程中的难题，纯化过程简单，纯度高，活性保存好，其注射液己经上市销售，临床上联合NP化疗方案用于非小细胞肺癌患者。重组的的人血管内皮抑制素作为外源性蛋白，在体内很容易被免疫系统识别，进而被降解，因此体内半衰期很短，患者需要频繁注射，临床顺应性很差。以乳酸-羟基乙酸聚合物为基质的生物可降解微球在上世纪八十年代已经被利用于多肽药物的注射用缓释制剂，例如如Takeda公司的LupronDepot，士Debiopharm公司的TrelstarDepot禾口Novartis公司的SandostatinDepot等。多肽药物在肌肉或皮下随着聚合物材料不断的生物降解缓慢释放到体内，在较长时间里维持体内有效的血药浓度，释放周期从一周到6个月不等，对于需要长期或终身给药的疾病，病人的顺应性大大提高。随着分子生物学的发展，越来越多的大分子蛋白质药物也需要借助这一缓释平台来克服药物本身的缺陷。缓释微球制剂一般采用水包油包水或者油包油包水的方法制备，虽然方法不同，但是蛋白质药物总是需要先存在于内水相中，与含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂在高速剪切或超声的作用下形成初乳，再分散到外水相或外油相中。既有亲水性部分又有疏水性内核的蛋白在此过程中很容易分布在油水界面上，发生构向的改变，又在有机溶剂的影响下发生降解；而且高浓度的内水相也会导致蛋白的聚集或者絮凝，这些均影响了其在制剂中的生理活性。WO96/07399公开了一种缓释微球的制备方法。该方法包括将水溶性肽类药物和氯化锌水溶液等溶于水的多价金属盐形成复合物，再与可生物降解材料制备缓释制剂。EP-A-0052510记载了采用凝聚剂如矿物油或植物油，利用相分离方法制备微球。虽然采用了很多方法可以保护蛋白质药物的活性。内水相的体积限制了微球制剂的载药量，同时在内水相向外相的迁移过程中，药物及容易泄露，制剂的包封产率降低，同时药物也容易分布在制剂的表面而造成较大的突释。
发明内容本发明的目的是为了解决现有的微球制备方法中存在的问题，提供一种包封产率高，突释小，活性保持良好的重组的人血管内皮抑制素组合物缓释微球制剂的制备方法。本发明中的重组的人血管内皮抑制素组合物缓释微球制剂可以用于可皮下注射、肌肉注射或瘤内注射。该制剂适合在制备用于持续释放重组人血管内皮抑制素的可注射药物中的用途。本发明的制备方法步骤为(a)在重组人血管内皮抑制素溶液中加入亲水性物质冷冻干燥，得到重组人血管内皮抑制素与亲水性物质中的组合物粉末；(b)再将所得粉末混悬在含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂中分散；(c)分散后加入到含有乳化剂的水相中，在常压或减压的条件下搅拌使溶剂挥发形成微球，挥发过程应控制一定的温度；(d)将所得微球洗涤干燥，得缓释微球制剂成品。本发明中重组人血管内皮抑制素组合物缓释微球制剂中组分及重量百分比重组人血管内皮抑制素占l%wt至30%wt、亲水性物质占l%wt至30%wt、乳酸-羟基乙酸聚合物69%wt至98。/。wt，缓释微球体积平均粒径在0.1pm至300nm之间，优选1-200pm。由于重组人血管内皮抑制素只在一定pH值下稳定，根据步骤(a)，其中重组人血管内皮抑制素溶解在缓冲液中，其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种，优选醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。缓冲液的pH值在2至9之间，优选在3至8之间。由于本发明要对药物溶液冻干，因此对药物浓度要求不高，一般重组人血管内皮抑制素在缓冲液中的浓度为0.1至500mg/ml，优选0.1至300mg/ml。蛋白质如果单独冻干，在水分升华过程中，局部浓度的增加会使蛋白发生聚集以及空间构象的变化，在蛋白溶液中加入一些亲水性的糖、多元醇或聚合物，在冻干中起到空间赋形和稳定作用，其中多元醇类物质还可以有效防止蛋白的聚集，减少无活性的多聚体的产生；在释放过程中，这些亲水性物质还能形成亲水性通道，加速药物前期的释放速度。所述亲水性物质包括多元醇(山梨醇、木糖醇、甘露醇)、糖类(海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖)、高分子聚合物(泊洛沙姆188、聚乙二醇、聚乙烯吡咯垸酮)中的一种或几种；其中，亲水性物质与重组人血管内皮抑制素的重量比为1:100至100:1，优选1:30至30:1。其中所述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿；聚乙烯吡咯垸酮分子量范围在2000至20000道尔顿。由于组合物粉末要均匀分散在有机溶剂中，因此组合物浓度应在0.1mg/ml至100mg/ml，优选lmg/ml至50mg/ml。需要采用4000转/分钟至20000转/分钟的高速分散，或者采用50W至200W功率的探针超声，分散或超声的时间控制在IO秒至IO分钟，通过外加能量以使组合物固体在有机溶剂中分散均匀。所述乳酸-羟基乙酸聚合物由羟基乙酸酸和乳酸通过聚合作用形成；聚合物可以是乳酸和羟基乙酸的共聚或均聚物，也可以指单一的聚乳酸；聚合作用可以是无规、嵌段或接枝型，它们可以具有D-，L-或者DL的光学构型。当所用聚合物是乳酸-羟基乙酸的共聚物或均聚物时，乳酸/羟基乙酸的摩尔比为40:60至100:0，优选50:50至85:15;聚合物重均分子量大小为5000-150000道尔顿，优选为5000至50000道尔顿。分子量的大小决定了聚合物在体内的降解速度，进而决定了药物的释放周期，释放周期可选择一周至二月。聚合物在有机溶剂中的浓度为10至400mg/ml。聚合物重均分子量应该根据凝胶透析色谱法测得(GPC)。所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇中的一种或两种混合。两种溶剂混合的组成可以是二氯甲烷+乙酸乙酯、二氯甲烷+乙腈、二氯甲烷+甲醇、乙酸乙酯+乙腈、乙酸乙酯+甲醇，混合体积比例为1:99至99:1。在溶剂挥发，微球形成的过程中，水包油包固的三相系统需要保持相对稳定的状态，这需要三个条件来保证，首先，为了形成水包油型乳剂，外水相与油相应该保持一定的比例，所述有机溶剂与水相的体积比为1:99至30:70。第二，为了使乳剂的表面能降低，外水相中应该添加一定的亲水性乳化剂，所述乳化剂为聚乙烯醇、tween20、tween60、tween80中的一种或多种，亲水性乳化剂占水相的重量比例范围在0.01%wt至5。/。wt,优选0.1%wt至3%wt。这些乳化剂在微球制剂后处理洗涤过程中被除去，并不带入最终的产品。第三，在溶剂挥发过程中，需要采用搅拌的方式分散多相系统，所述方法包括使用叶片式机械搅拌器、磁力搅拌器或者旋转蒸发器，在常压或者减压的条件F蒸发溶剂，压力控制在0.01-01kpa，挥发过程中控制温度范围在0至40摄氏度，可以全过程恒温，也可以采用程序升温的方式，搅拌时间控制在2至24小时。聚乙烯醇重均分子量在100-3000，醇解度范围在85-90%。所述重组人血管内皮抑制素优选重组人血管内皮抑制素Endostar。本发明的优点有一采用本发明的方法制备的重组人血管内皮抑制素组合物缓释微球制剂可以在体内长期缓慢释放重组人血管内皮抑制素，大大减少病人给药次数，提高病人的顺应性。通过选择不同载体聚合物材料的分子量可以方便调节药物的释放速率。二将重组人血管内皮抑制素溶液与亲水性保护剂冷冻干燥，形成细微的组合物粉末，将此粉末分散在含有生物降解材料的有机溶剂中形成固体/油相分散系统，消除了可能发生降解的油水界面，重组人血管内皮抑制素被亲水性物质保护，以固体的形态分散其中，随着有机溶剂的挥发，重组人血管内皮抑制素以相对稳定的形式被有效包裹在其中，制备的微球外观圆整，粒径均匀，重组人血管内皮抑制素的释放行为得到改善，重组人血管内皮抑制素的活性也得以保留。图1实施例一中微球的粒径分布图图2实施例一中微球的SEM扫描电镜照片图3实施例二中微球的粒径分布图图4PLGA(Mw=20000，乳酸:羟基乙酸=75:25)和PLGA(Mw=7000，乳酸:羟基乙酸=50:50)制备的Endostar微球体外释放行为曲线。图5Endostar制成微球前后对HUVEC细胞增殖活性。图6复合溶剂系统制备的微球中Endostar的非还原性SDS-PAGE鉴定。具体实施方式本发明通过以下实施例作更详细的描述，但不能将其解释为限制本发明的保护范围。实施例一精密称取10mgEndostar禾B300mg葡萄糖溶于lmlpH7.0的PBS缓冲液中，将此溶液冷冻干燥得到组合物粉末。将PLGA(Mw=50000，乳酸:羟基乙酸=50:50)4g溶于20ml乙酸乙酯中形成有机相。将上述组合物粉末混悬在有机相中，10000rpm高速分散20s，，形成S/0二相分散系统，然后将此初乳倾倒至化含有3%聚乙烯醇1788(聚合度约为1700，醇解度88%)的外水相中，20摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂6小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，干燥得到微球成品。精密称取微球成品20mg，用lml二氯甲烷溶解，再加入10mlpH:7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)萃取Endostar，将萃取后的PBS溶液用BCA的方法(试剂盒来自于ThermoScientific,名为BCAProteinAssayKit)测定其中的蛋白浓度，其中Endostar占微球总量的0.228%wt，包封产率为98.23%,使用马尔文的Mastersizer2000激光粒度仪测得微球体积平均粒径为25.995pm,粒径分布见图l。将所得微球粘附在铜质小台上，用离子渐射仪(JFC-1600R本电子)包裹铂，在扫描电镜(scanningelectronicmicroscopySEM)(JSM-5610LUR本电子)中观察形态，可见微球粒径均一，微球外观光滑圆整，表面无Endostar结晶。(图2)实施例二精密称取300mgEndostar禾n10mg甘露醇溶于lmlpH3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，将此溶液冷冻干燥得到组合物粉末。将PLGA(Mw=20000，乳酸:羟基乙酸=75:25)3g溶于20ml二氯甲垸中形成有机相。将上述组合物粉末混悬在有机相中，200W探针超声40秒，形成S/O二相分散系统，然后将此初乳倾倒至150ml含有0.02%Tween80的外水相中，0摄氏度下，机械搅拌常压挥发溶剂24小时，使用0.8)am的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，干燥得到微球成品。精密称取微球成品20mg，用lml二氯甲烷溶解，再加入10mlpH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)萃取药物，将萃取后的PBS用BCA的方法测定其中的蛋白浓度，其中Endostar占微球总量的8.81%wt，包封产率为为97.18%,使用马尔文的Mastersizer2000激光粒度仪测得微球体积平均粒径88.488pm，粒径分布见图3精密称取微球成品50mg，平行3份，置于含有10ml磷酸缓冲液(pH二7.0)的试管中，放入37度恒温水浴中振摇。分别在每个时间点取试管中上清液lml，同时补充相同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用BCA法测定。用其累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放14.25%，第14天释放74.卯％，第35天释放90.20%。(图4中实施例二)从数据可以看出，采用本方法制备的微球突释小，随着材料的降解和甘露醇的溶出，Endostar不断的从孔径中释放出来，在约一个月的周期内，Endostar释放均匀，最终释放完全。实施例三精密称取200mgEndostar禾P200mgPEG4000溶于lmlpH8.0的Tris缓冲液中，将此溶液冷冻干燥得到组合物粉末。将PLGA(Mw=7000，乳酸:羟基乙酸=50:50)600mg溶于20ml二氯甲垸中形成有机相。将上述组合物粉末混悬在有机相中，4000rpm高速分散60秒，形成S/0二相分散系统，然后将此初乳倾倒至1L含有1XPVA0486(聚合度约为400，醇解度86%)的外水相中，从Or开始按照rC/min的速度升温，最后保持在3(TC下，机械搅拌挥发溶剂2小时，全过程控制压力在20kpa。使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，干燥得到微球成品。精密称取微球成品20mg，用lml二氯甲烷溶解，再加入lmlpH-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)萃取Endostar，将萃取后的PBS溶液稀释后用BCA的方法测定其中的蛋白浓度，其中Endostar占微球总量的18.64%wt，包封产率为为93.22%，使用马尔文的Mastersizer2000激光粒度仪测得微球体积平均粒径70.15pm。精密称取微球成品50mg,平行3份，置于含有10ml磷酸缓冲液(pH=7.0)的试管中，放入37度恒温水浴中振摇。分别在每个时间点取试管中上清液lml，同时补充相同体积新鲜的磷酸缓冲液。样品中Endostar的含量用HPLC法测定。用其累计释放百分率与释药时间作图。第1天释放19.02%,第14天释放86.58%，第21天释放92.94%，无释放不完全现象。(图4中实施例三)从数据可以看出，釆用本方法制备的微球突释小，较实施例二中的微球制剂释放速度快，14天就释放了近90%，这是因为1采用了低分子量PLGA，羟基乙酸的比例也有所增加，材料的降解速度要快于实施例二中所用的PLGA。2PEG4000在微球的降解过程中形成了亲水性的孔洞，有利于Endostar的溶出。实施例四取实施例三制备的微球进行Endostar的生物活性测定1、HUVEC细胞用添加FBS、ECGS、P/OSolution的ECM培养基于37°C，5%C02的培养箱中培养，待细胞状态良好并进入对数生长期后进行接种。2、细胞用0.25%胰酶消化，IOOOrpm离心5min，弃上清，用培养基重新混悬，显微镜下用血细胞计数板计数活细胞。调细胞密度为5000个/ml，每孔加入16(^1细胞悬液，置37'C5%<:02培养箱中培养。3、将Endostar原液和Endostar微球含量测定时得到的萃取液用pH7.4的磷酸盐缓冲液预稀释至2.5mg/ml，按孔中终浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.625吗/ml，每孔加入4(^1，每个梯度设3个平行，37°C5n/oC02培养箱中培养96h。4、加入5mg/mlMTT工作液，每孔20pl，置37°C5%C02培养箱中培养4h，弃去细胞上清，每孔加入DMSO200pl。放置10min,使用酶标仪490nm波长下QD徵&5、根据OD值求出细胞抑制率，计算公式为抑制率(IR)=(对照组OD值均数-实验组OD值均数)/(对照组OD值均数-空白OD值均数)。(图5)从图中可以看出，微球中的Endostar与原液对细胞增殖的抑制程度相当。实施例五分别精密称取100mgEndostar、30mg海藻糖和10mg泊洛沙姆188(德国巴斯夫公司)溶于lmlpH6.0的醋酸钠缓冲液中，将此溶液冷冻干燥得到组合物粉末。将PLGA(Mw=50000,乳酸:羟基乙酸=50:50)lg溶于20ml的混合溶剂中(表一)形成有机相。将上述组合物粉末混悬在有机相中，50W探针超声120秒，形成S/0二相分散系统，然后将此初乳倾倒至2L含有1%PVA0486(聚合度约为400，醇解度86%)的外水相中，20摄氏度下，磁力搅拌常压挥发溶剂8小时，使用0.8pm的微孔滤膜过滤得到微球，并用纯水洗涤三次，干燥得到微球成品。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>分别精密称取上述微球成品20mg，用lml二氯甲烷溶解，再加入4mlpH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)萃取Endostar，将萃取后的PBS用BCA的方法测定其中的蛋白浓度，其中Endostar的包封产率均在90%以上。取上述提取液与相似浓度的Endostar标准溶液进行非还原性SDS—PAGE鉴定，观察混合溶剂系统制备的微球中蛋白的纯度。(图6)从图中可以看出，采用不同的溶剂系统制备微球中的Endostar,并没有发现多聚体和降解片段。权利要求1、一种重组人血管内皮抑制素缓释微球制剂的制备方法，它包括以下步骤(a)在重组人血管内皮抑制素溶液中加入亲水性物质冷冻干燥，得到重组人血管内皮抑制素与亲水性物质中的组合物粉末；(b)再将所得粉末混悬在含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂中分散；(c)分散后加入到含有亲水性乳化剂的水相中，在常压或减压的条件下，控制温度在0至40摄氏度，搅拌使溶剂挥发形成微球；(d)将所得微球洗涤干燥，得缓释微球制剂成品。2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述缓释微球制剂成品中组分及重量百分比重组人血管内皮抑制素占P/。wt至30y。wt、亲水性物质占1。/。wt至30。/。wt、乳酸-羟基乙酸聚合物占69%wt至98%wt;缓释微球制剂成品的体积平均粒径在O.lnm至300pm之间，优选1-200pm。3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述重组人血管内皮抑制素溶液为重组人血管内皮抑制素溶于缓冲液所得，重组人血管内皮抑制素在缓冲液中的浓度为0.1至500mg/ml，优选0.1至300mg/ml。4、根据权利要求3所述的制备方法，其中缓冲液可以是醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种，缓冲液的pH值在2至9之间，优选在3至8之间。5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述亲水性物质包括山梨醇、木糖醇、甘露醇、海藻糖、壳聚糖、葡聚糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、泊洛沙姆188、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种；组合物粉末中亲水性物质与重组人血管内皮抑制素的重量比为1:100至100:1，优选1:30至30:1。6、根据权利要求5所述的制备方法，其中所述聚乙二醇分子量范围在1000至8000道尔顿；聚乙烯吡咯烷酮分子量范围在2000至20000道尔顿。7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述组合物粉木在含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂中的浓度0.1mg/ml至100mg/ml，优选lmg/ml至50mg/ml。8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述乳酸-羟基乙酸聚合物的乳酸/羟基乙酸的摩尔比为40:60至100:0，优选50:50至85:15;聚合物重均分子量大小为5000至150000道尔顿，优选为5000至50000道尔顿；聚合物在有机溶剂中的浓度为10至400mg/ml。9、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇中的一种或两种，两种有机溶剂的混合体积比例为l:99至99:1;有机溶剂与含有亲水性乳化剂的水相的体积比为1:99至30:70。10、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述亲水性乳化剂为聚乙烯醇、tween20、tween60、tween80中的一种或多种，亲水性乳化剂占水相的重量百分数范围在0.01%wt至5%wt，优选0.1%wt至3%wt。11、根据权利要求IO所述的制备方法，其中聚乙烯醇重均分子量在100至3000道尔顿，醇解度范围在85至89%。12、根据权利要求1至11中任一项所述的制备方法，其特征在于所述重组人血管内皮抑制素为重组人血管内皮抑制素Endostar。全文摘要一种药物
技术领域：
的重组人血管内皮抑制素组合物缓释微球的制备方法，所述缓释微球的组分及重量百分比为重组人血管内皮抑制素占1％wt至30％wt、亲水性物质占1％wt至30％wt、乳酸-羟基乙酸聚合物69％wt至98％wt，制备步骤(a)在重组人血管内皮抑制素溶液中加入亲水性物质冷冻干燥，得到重组人血管内皮抑制素与亲水性物质中的组合物粉末；(b)再将所得粉末混悬在含有乳酸-羟基乙酸聚合物的有机溶剂中分散；(c)分散后加入到含有乳化剂的水相中，在常压或减压的条件下搅拌使溶剂挥发形成微球，挥发过程应控制一定的温度；(d)将所得微球洗涤干燥，得缓释微球制剂成品。本发明的制备方法可以使重组人血管内皮抑制素以相对稳定的形式有效的包裹在微球中，减小其在制备过程中可能发生的降解。文档编号A61K47/36GK101428142SQ20071013510公开日2009年5月13日申请日期2007年11月8日优先权日2007年11月8日发明者刘春晖,孟博宇,玲李,殷晓进,许向阳申请人:江苏先声药物研究有限公司