Rs7抗体的制作方法

专利名称：：Rs7抗体的制作方法RS7抗体本申请是申请号为03809918.7、发明名称为"RS7抗体"的专利申请的分案申请。1.发明领域本发明涉及单价和多价的，单特异性结合蛋白和涉及多价的，多特异性结合蛋白。这些结合蛋白的一个实施方案含有一个或多个结合位点，其中每个结合位点与靶抗原或靶抗原上的表位结合。这些结合蛋白的另一实施方案含有两个或多个结合位点，其中每个结合位点具本发明还涉及用于在宿主中表达这些功能性结合蛋白的重组载体。更具体地，本发明涉及名为RS7的肿瘤相关抗原结合蛋白。本发明还涉及人源化RS7抗原结合蛋白，以及该结合蛋白在诊断和治疗中的用途。2.发明背景人造结合蛋白，尤其是单克隆抗体和工程化处理抗体或抗体片段已经得到广泛测试并显示出在多种人类疾病，包括癌症、自身免疫病、感染性疾病、炎症疾病和心血管疾病的检测和治疗中的价值(Filpula和McGuire,Exp.Opin.Ther.Patents(1999)9:231-245)。例如放射性同位素标记的抗体已经检测可用于在使用本领域可用的检测剂注射患者后使肿瘤可视化。抗体或抗体来源的试剂的临床应用主要依赖于其与特异性靶抗原的结合能力。选择能力对于在人疾病的检测和治疗期间将诊断剂或治疗剂，如同位素、药物、毒素、细胞因子、激素、生长因子、酶、缀合物、放射性核素或金属递送至靶位，特别是如果诊断剂或治疗剂对体内的正常组织有毒性的情况下是有用的。Goldenberg，TheAmericanJournalofMedicine(1993)94:298-299中公开了抗体系统的潜在局限性。检测和治疗技术中的重要参数是注射剂量特别是靶细胞存在位点的剂量的量和摄取率，即特异性结合的抗体的浓度与周围正常组织中存在的放射性的比率。当将抗体注射至血流中时，其要通过多个区室而被代谢和排泄。抗体在通过身体的其它部分时，必须能够定位和结合靶细胞抗原。控制抗原靶向的因素包括位置，大小，抗原密度，抗原可达性，病理组织的细胞组成和靶向抗体的药代动力学。其它能特别影响抗体对肿瘤靶向的因素包括靶抗原在肿瘤和其它组织中的表达和由放射性标记的抗体的緩慢血液清除率所导致的骨髓毒性。附着于被耙定的肿瘤细胞的靶向抗体的量收到血管化和肺瘤抗体透过屏障，以及瘤内压力的影响。非靶器官如肝、肾或骨髓的非特异性的摄取是该技术，特别是用于发射免疫治疗时的另一个潜在的局限性，其中骨髓的照射通常会导致剂量限制性毒性。一个建议的方法，指直接靶向，是为用携带诊断性或治疗性放射性同位素的抗体靶向抗原而设计的技术。在肿瘤领域中，直接靶向方法使用通过其抗原识别肺瘤的发射性标记的抗-肺瘤单特异性抗体。该技术包括将标记的单特异性抗体注射给患者然后使得抗体定位于靶肿瘤从而获得诊断性或治疗性效果。未结合的抗体被身体清除。该方法可用于诊断或治疗另外的哺乳动物疾病。另一种建议的溶液，指特别为克服携带诊断性或治疗性放射性同位素的抗体靶向肿瘤的缺陷而设计的"亲和力增强系统"(AES)，(US-5，256，395(1993)，Barbet等，CancerBiotherapy&Radiopharmaceuticals(1999)14:153-166)。AES采用放射性标记的半抗原和识别靶肿瘤和放射性半抗原的抗-肺瘤/抗-半抗原双特异性结合蛋白。具有较高效价的半抗原和具有较高特异性的结合蛋白也可用于该方法。该方法包括将将结合蛋白注射给患者然后使其定位于靶肺瘤。在经过足够长的未结合的结合蛋白被从血流中清除的时间后，给予放射性标记的半抗原。半抗原于位于靶细胞位点的抗体-抗原复合物结合从而获得诊断性或治疗性效果。未结合的半抗原被身体清除。Barbet描述了二价半抗原可与双特异性抗体在后者结合在肺瘤表面上时发生交联的可能性，。结果，放射性标记的复合物更稳定且在肿瘤中保持更长的时间。该系统可用于诊断或治疗哺乳动物疾病。本领域中仍需要制备可用于直接靶向系统中的多价，单特异性结合蛋白和制备可用于亲和力增强系统中的多价，多特异性结合蛋白。特别是，仍需要表现出定向抗原处的增强的摄取，血浓度降低，和能最佳保护正常组织和细胞免受毒性药物损害的结合蛋白。发明概述因此，本发明的一个目的是提供识别肿瘤相关抗原，由抗人非小细胞肺癌的鼠MAbRS7-3G11所限定的上皮糖蛋白-1(EGP-1)的单特异性单克隆抗体及其片段。根据第三届国际肺癌研究协会(IASLC)研讨会对肿瘤和分化抗原的建议，已将RS7抗原命名为EGP-1(上皮糖蛋白-l)。至少一种与EGP-1相关的表位在文献中也称为TR0P2。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段结合的表位与Stein(如下)和其它在先研究所披露的鼠RS7抗体结合的表位相同。或者，抗体或片段结合的表位可与Stein所披露的鼠RS7抗体结合的表位不同。在一个优选的实施方案中，抗-EGP-1或抗-TR0P2抗体或其片段是嵌合、人源化或完整人RS7抗体或其片段。例如本发明中涉及了人源化抗体或其片段，其中人源化RS7MAb的轻链可变区的互补决定区(CDR)包括含有KASQDVSIAVA氨基酸序列的CDR1;含有SASYRYT氨基酸序列的CDR2;和含有QQHYITPLT氨基酸序列的CDR3。本发明的另一实施方案是人源化抗体或其片段，其中人源化RS7MAb的重链可变区的CDR包括含有NYGMN氨基酸序列的CDR1;含有WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有GGFGSSYWYFDV氨基酸序列的CDR3。而且优选，人源化抗体或其片段包括鼠RS7MAb的CDR和人抗体的轻链和重链可变区的构架区(FR)，其中人源化RS7MAb的轻链可变区的CDR包括含有KASQDVSIAVA氨基酸序列的CDR1;含有SASYRYT氨基酸序列的CDR2;和含有QQHYITPLT氨基酸序列的CDR3;和人源化RS7MAb的重链可变区的CDR包括含有NYGMN氨基酸序列的CDR1;含有WINTYTGEPTYTDDFKG氨基酸序列的CDR2和含有GGFGSSYWYFDV氨基酸序列的CDR3。还优选，人源化抗体或其片段还包括人抗体的轻链和重链恒定区的FR。在一个优选的实施方案中，人源化RS7抗体或片段包括含有至少一个被在鼠RS7抗体中相应位置上发现的氨基酸残基所替换的氨基酸的轻链和/或重链的FR。例如其中至少一个被替换的氨基酸残基优选位于选自图.3B的鼠重链可变区的氨基酸残基38、46、68和91的位置和/或至少一个被替换的氨基酸残基优选位于选自图.3A的鼠轻链可变区的氨基酸残基20，85和100的位置。本发明还描述了一种包括至少两种抗-EGP-lMAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中MAb或其片段选自本发明的抗-EGP-lMAb或其片段。在相关静脉中，抗体融合蛋白或其片段包括至少一种任何本发明的抗-EGP-1抗体的第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一种本发明的抗-EGP抗体以外的第二MAb或其片段。例如第二抗体或其片段可以是癌-相关抗体或其片段。另一优选的实施方案是包括两个不同表位结合性抗-EGP-l抗体或其片段的融合蛋白或其片段。本发明的一个目的是提供识别多于一个RS7抗原上的表位的或具有对RS7抗原和对半抗原分子亲和力的多特异性抗体及其片段。后一结合蛋白适于预靶定靶抗原。因此，还描述了一种将诊断剂、治疗剂或其组合递送至靶位的方法，包含(i)对个体给予多价，多特异性MAb或其片段；(ii)等待足够长的时间以便使非结合蛋白的量从个体血流中清除；和(iii)对所述个体给予可与所述个体的结合位点结合的诊断剂、治疗剂或其组合。本发明的另一个目的是提供将诊断剂或治疗剂递送至表达EGP-1抗原的定向疾病的方法。例如描述了一种将诊断剂或治疗剂或其组合递送至靶位的方法，包括(i)提供一种包含与至少一种治疗剂和/或诊断剂结合的抗-EGP-1抗体或其片段的组合物和(ii)对有此需要的所述个体给予所述组合物。优选地，诊断剂或治疗剂选自同位素、药物、毒素、免疫调节剂，激素、酶、生长因子、放射性核素、金属、造影剂和检测剂。在本发明的另一实施方案中，将诊断剂、治疗剂或其组合递送至靶位的方法包括(i)对个体给予包含一个或多个具有对EGP-1靼抗原亲和力的抗原-结合位点和一个或多个具有对半抗原分子亲和力的半抗原结合位点的多价，多特异性抗体或片段；(ii)等待足够长的时间以便使非结合蛋白的量从个体血流中清除；和(iii)对所述个体给予包含诊断剂、治疗剂或其组合。本发明的另一目的是提供癌细胞靶向的包括抗-EGP-lMAb或其片段或本发明任一种抗体的抗体融合蛋白或其片段的诊断缀合物或治疗缀合物而其中抗-EGP-1抗体或其片段与至少一种诊断剂或治疗剂结合。适用的治疗剂是具有选自抗有丝分裂，烷化，抗代谢物，抗血管生成，细胞凋亡，生物碱和抗生素药剂及其组合的药理特性的药物。同样优选的治疗剂选自氮芥类，氮丙啶衍生物，烷基磺酸酯类，亚硝基脲类，三氮烯类，叶酸类似物，蒽环类抗生素，紫杉烷类药，C0X-2抑制剂，酪氨酸激酶抑制剂，嘧啶类似物，噪呤类似物，抗生素，酶，表鬼臼毒素类，铂配位络合物，长春花生物碱，取代的脲类，甲肼衍生物，肾上腺皮质激素抑制剂，拮抗剂，内皮生长抑素，紫杉醇，喜树碱，阿霉素，阿霉素类似物，及其组合。优选地，诊断剂选自光活化性放射性核素，优选25~4000keV，和造影剂。在一个优选的实施方案中，DNA序列包含一种核酸，所述核酸编码包含本发明的抗-EGP-lMAb或其片段的MAb或片段；包含至少两种所述MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段；包含至少一种含有本发明的抗-EGP-l抗体和片段的MAb或其片段的第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一种本文所描述的抗-EGP-lMAb或其片段以外的第二MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段；或包含至少一种包含本文描述的任何抗体的所述MAb或其片段的第一MAb或其片段和至少一种本文描述的任何抗体的所述MAb或其片段以外的第二MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段，其中第二MAb可与选自EGP-2、MUC1-4、A33、CSAp、CEA、Le(y)、Tn、Tag-72、PSMA、PSA、EGFR、HER2/織、AFP、HCG、HCG-j3、铁蛋白、PAP、PLAP、EGP-2、组蛋白、细胞角蛋白、腱生蛋白、CanAg、肾癌G250、VGFR1、VGFR2、PAM4-抗原、致癌基因产物，及其组合的抗原反应。第二Mab可替代性地与肿瘤相关性血管内皮抗原，如VEGF(血管内皮生长因子)和P1GF(胎盘生长因子)反应。第二抗体的选择依赖于肿瘤细胞类型。例如抗-PSMA或抗-PSA抗体可用于治疗或诊断前歹'J腺癌，抗一CEA或抗一MUCL，MUC2，MUC3和MUC4抗体用于乳癌、卵巢癌、肺癌和结肠癌，EGFR用于结肠癌和头颈癌，抗-CSAp抗体用于结肠癌和卵巢癌，而抗-HER/neu用于乳癌、卵巢癌和其它癌症。这些仅用以示例性说明，而并非意在限制。含有该DNA序列的表达载体和宿主细胞也是本发明优选的实施方案。本文还提供了诊断和治疗恶性肿瘤的方法。例如诊断和治疗癌症的方法，包括(i)对有此需要的个体给予包含一个或多个具有对EGP-1靶抗原亲和力的抗原-结合位点和一个或多个具有对半抗原分子亲和力的半抗原结合位点的多价，多特异性抗体或片段；(ii)等待足够长的时间以便使非结合蛋白的量从个体血流中清除；和(iii)对所述个体给予包含诊断剂、治疗剂或其组合，可与所述抗体的结合位点结合的半抗原。同样地，诊断和治疗恶性肿瘤的方法可包括施用治疗有效量的抗-EGP-l融合蛋白或其片段或包含EGP-1MAb或其片段的治疗缀合物，其中EGP-1MAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段在药学上适用的赋形剂中与至少一种治疗剂结合。在相关静脉中，棵抗-EGP-l抗体及其片段，包括棵抗-EGP-1融合蛋白及其片段，也可用于治疗恶性肿瘤。棵抗-EGP-1抗体可用于体外诊断恶性肺瘤，例如采用免疫测试法或免疫组织化学法，但不能用于体内诊断，除非其包括预靶向技术，如AES。但是，标记的EGP-1抗体可用于体内诊断和治疗恶性肿瘤。例如本文描述了治疗个体中癌细胞的方法，包括(i)对所述个体给予治疗有效量的包含抗-EGP-lMAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段的组合物，(ii)将所述EGP-lMAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段在药学上适用的赋形剂中配制。相似地，本发明还包括用于诊断和治疗的棵MAb及其片段和缀合的MAb或其片段或融合蛋白或其片段的组合。附图简述图1显示了mRS7，cAb-V"23(cRS7)，和CAB-Vk井1在竟争性结合检测法中的比较。将不同浓度的竟争性Ab用于与生物素化mRS7抗体常量的结合竟争。结果显示Vi^l轻链不结合RS7抗原。图2显示了编码(A)由RACE克隆的RS7Vk和(B)由RT-PCR克隆的RS7VH的DM和氨基酸序列。推定的CDR区用下划线显示。核苷酸残基连续编号。将Kabat'sIg分子编号法用于氨基酸残基。在(B)中，用字母(顶部)对残基的编号是用在前残基的数字加字母，例如N52后的T的编号是52A;182后的N，N和L的编号分别是82A，82B和82C。图3显示了(A)人SA-lA，cl，鼠RS7，和hRS7VK链和(B)人RF-TS3,鼠RS7，和hRS7vh链的氨基酸序列比对。在(A)中，圆点表示RS7中与SA-lA'cl中相应残基相同的残基。短横线表示引入以帮助比对的缺口。框表示CDR区。hRS7的N-和C-末端残基(下划线标出)均由所使用的staging载体固定。因此，RS7的相应的末端残基不能与人序列中的比较。使用Kabat's编号方案。在(B)中，圆点显示RS7中与RF-TS3中的相应残基相同的残基。短横线表示引入以帮助比对的缺口。框表示CDR区。hRS7的N-和C-末端残基(下划线标出)均由所使用的staging载体固定。因此，RS7的相应的末端残基不能与人VH序列中的比较。图4显示了(A)人源化RS7Vk和(B)人源化RS7Vh的DNA和氨基酸序列。氨基酸序列的粗体和下划线部分表示用Kabat's编号方案所确定的CDR。图5显示(A)人源化RS7vk的轻链cDM和氨基酸序列和人源化rs7vh的重链cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下划线部分表示用于分泌的前导肽序列。"*"表示终止密码子。图6显示了mRS7，cRS7和hRS7在竟争性结合检测法中的比较。不同浓度的竟争性Ab用于与生物素化RS7抗体常量对Ag包被的96-孔ELISA板的结合竟争。hRS7显示出与RS7和cRS7相当的阻滞活性。图7显示了人源化RS7vk的轻链cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下划线标出的部分表示用于分泌的前导肽序列。"*，，表示终止密码子。赖氨酸残基也用下划线标出。图8显示了人源化RS7vk的重链cDNA和氨基酸序列。氨基酸序列的下划线标出的部分表示用于分泌的前导肽序列。表示终止密码子。赖氨酸残基也用下划线标出。图9显示剩余部分IMP-R4，IMP-R5和IMP-R8的结构。图10是由于放射性碘化的hRS7在MDA-MB-468肿瘤模型中的剂量确定法的棒形图。图ll提供了表明放射性免疫治疗对乳癌异种移植物在棵鼠中的肿瘤生长的影响的组图。图12是放射性免疫治疗棵鼠中乳癌异种移植物后，评价毒性的组图。图13是表明相对平均肿瘤体积(MTV)的图。优选实施方案详述除非另有特指，术语"a"或"an"是指"一个或多个"。RS7抗体(以前被称为RS7-3G11)是抗人原发肺鳞状细胞癌的粗制膜制备物而产生的鼠IgG!。参见Stein等，CancerRes.50:1330(1990),其全文引入作为参考。RS7抗体识别肿瘤相关抗原，其由抗人非细胞肺癌而产生的鼠MAbRS7-3G11所确定。Stein等披露了识别46-48kDa糖蛋白的RS7抗体，特征为聚簇13。Stein等，Int.J.CancerSupp.8:98-102(1994)。同样参见，Basu等，Int.J.Cancer52:472-479(1995)。根据3"国际肺癌研究协会(IASLC)研讨会对肿瘤和分化抗原的建议，已将该抗原命名为EGP-l(上皮糖蛋白-1)。参见，例如DeLeij等，Int.J.CancerSupp.，8:60-63(1994)。因此，如本文所述，RS7和EGP-1抗原具有相同含义。EGP-1抗原还指现有技术中的TR0P2，但可能是EGP-1和TR0P2二者的多表位。流式细胞仪和免疫组织化学染色研究已经显示出RS7Mab可检测多种肺瘤类型上的抗原，而其仅有限地与正常人组织结合。(Stein等，(1990)，如上)。RS7抗体与可被快速内在化的EGP-1糖蛋白反应。EGP-1主要由癌如肺癌，胃癌，膀胱癌，乳癌，卵巢癌，子宫癌和前列腺癌表达。使用放射性标记的鼠RS7Mab在动物模型中的定位和治疗研究已经证明了肿瘤靶向和治疗的效能(Stein等，(1990)，如上。Stein等，(1991)，如上)。更为近来的研究已证明在来自肺，乳，膀胱，卵巢，子宫，胃和前列腺的肿瘤中存在RS7强染色。参见Stein等，Int.J.Cancer55:938(1993)，将其全文引入作为参考。而且，该研究中的肺癌症病例鳞状细胞癌和腺癌。同前。两种细胞类型均强染色，显示RS7抗体不能从非小细胞肺癌地组织学分类上区分。如上所述，RS7Mab被快速内在化至耙细胞(Stein等(1993)，如上)。RS7MAb的内在化速度常数介于其它两种快速内在化Mab的内在化速度常数之间，所述其它两种快速内在化已经被证明可用于免疫毒素制备。同前。已有大量报道指出免疫毒素缀合物的内在化是抗-肿瘤活性绝对必须的。(PASTAN等，Cell47.641(1986))。药物免疫缀合物的内在化也已经被描述为抗-肿瘤效能中的主要因素。(Yang等，Proc.Nat，l.AcacLSci.USA85:1189(1988))。因此，RS7抗原可能是这些需要治疗剂内在化的免疫治疗类型的重要的靶位。因此，用RS7Mab的研究显示了抗体表现出某些重要的特性，其使其可作为临床诊断和治疗应用的候选。因为RS7抗原提供了诊断和治疗的有用的靶位，就需要获得识别RS7抗原的表位的Mab。而且，嵌合，人源化和人RS7抗体的有效性是双决定子酶联免疫吸附测定(ELISA)发展的根本，所述测定需要在俩那创样品中检测RS7抗原，且是人类体内应用的根本。为此目的，本发明描述了可结合RS7抗原并可用于诊断和治疗方法的嵌合，人源化和人抗体及其片段。人源化抗体和抗体片段已被描述于名为"抗-CD20抗体和其融合蛋白及使用方法"的，代理人巻号18733/1073的美国临时申请，美国临时申请号60/356,132，美国临时申请60/416，232和代理人巻号18733/1155中；hMN-14抗体，如美国申请号5，874，540中公开的那些抗体，其是III类抗-癌胚抗原抗体(抗-CEA抗体)；Mu-9抗体，如美国申请号.10/116,116/>开的那些抗体；AFP抗体，如美国临时申请60/399，707公开的那些抗体；PAM4抗体，如名为"单克隆抗体cPAM4"的美国临时申请，代理人巻号18733/1102/>开的那些抗体；RS7抗体，如美国临时申请60/360，2297^开的那些抗体；和CD22抗体，如美国专利5，789，554和6，187，287和美国申请09/741，843和09/988，013公开的那些抗体，上述全部文件均全文引入此处作为参考。本文所描述的嵌合抗体是一种重组蛋白，其包含含有来源于一种物种的抗体优选是啮齿动物抗体的互补决定区(CDR)的可变区，而抗体分子的恒定区则来源于人抗体。为了兽医学上的应用，嵌合抗体的恒定区可来源于其它物种。人源化抗体是一种重组蛋白，其中将来自一种物种的抗体例如啮齿动物抗体的CDR从啮齿动物抗体的重链和可变轻链转移至人重链和轻链可变区。在一个优选的实施方案中，RS7抗体是人源化的。因为非-人类单克隆抗体可由人宿主作为外源蛋白而识别，而且重复注射会导致有害的过敏性反应，故鼠RS7序列的人源化能降低患者经受的不利免疫应答。对于基于鼠的单克隆抗体，其通常是指人抗-小鼠抗体(HAMA)应答。本发明的另一实施方案是抗-EGF-1抗体或其片段，其是低于人的灵长类抗-EGP-l抗体，鼠单克隆抗-EGP-l抗体(限于兽医应用)，嵌合抗-EGP-l抗体，人抗-EGP-1抗体，和人源化抗-EGP-1抗体。优选地，人源化RS7抗体或其片段的构架区中的某些人残基被鼠的相似物置换。还优选地，联合来自两个不同人抗体的框架序列而用于Vh。抗体分子的恒定区源自人抗体的那些。本发明另一优选的实施方案是人RS7抗体。人抗体是获自已经被"工程化处理，，以响应抗原性激发而制备特异性人抗体的转基因鼠的抗体。在该方法中，将人重和轻链基因座的元件导入源自包含内源重链和轻链基因座的靶向断裂的胚胎干细胞系的小鼠品系中。该转基因鼠能合成特异性针对人抗原的人抗体，该小鼠可用于制备分泌人抗体的杂交瘤。Green等NatureGenet.7:13(1994)，Lonberg等Nature368:856(1994)和Taylor等Int.Immun.6:579(1994)描述了从转基因鼠中获得人抗体的方法。完全人抗体还可以用基因或染色体转染法，以及喧菌体显示技术(phagedisplaytechnology)进行构建，所有这些方法均为本领域已知的。例如参见McCafferty等，Nature348:552-553(1990)从来自未免疫的供者的免疫球蛋白可变区基因库中于体外制备人抗体及其片段。在该方法中，将抗体可变区基因框架内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外膜蛋白质基因，并被显示为噬菌体微粒表面上的功能性抗体片段。因为丝状微粒包含噬菌体基因组的单股DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还会导致选择选择编码表现出这些特性的抗体的基因。在该方法中，噬菌体模拟了B细胞的某些特性。可用多种形式实施噬菌体展现，对其的综述可参见例如Johnson和Chiswell,CurrentOpinioninStructuralBiology3:5564-571(1993)。本发明的抗体及其片段优选抵抗来自人原发鳞状细胞肺癌的粗制膜制备物而产生。还优选，RS7抗体及其片段抵抗来自人卵巢癌细胞系的活细胞的膜制备物而产生。还优选，RS7抗原由活Co10316细胞提供。在相关静脉中，RS7抗体可使用RS7抗原基本上纯的制剂而获得。基本上纯的蛋白是基本上不含在天然状态下与所述蛋白相伴随的污染性细胞成分的蛋白。如此处所述，术语"RS7抗体"还包括嵌合、人和人源化RS7抗体。嵌合，人源化和人RS7抗体的制备可采用本领域技术人员已知的方法获得针对特异性抗原的单克隆抗体。例如参见Kohler和Milstein，Nature256:495(1975)，和Coligan等(eds.)，CURRENTPROTOCOLSIN國U鼠0GY，Vol.l，2.5.1-2.6.7页(JohnWiley&Sons1991)(在下文中"Coligan")。简言之，RS7抗原MAb，如RS7的制备可以通过用包含RS7抗原的组合物注射小鼠，通过取血清样品鉴定抗体制备的存在，取脾获得B-淋巴细胞，融合B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞来制备杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对RS7抗原的抗体的阳性克隆，培养该产生针对RS7抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤培养物中分离RS7抗体。在针对抗原的抗体初始生成后，可对抗体进行测序并随后用重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化是本领域技术人员所熟知的。例如将小鼠互补决定区通过从小鼠免疫球蛋白的重和轻可变链将转移至人可变区中，然后用鼠相似物置换构架区中的人类残基从而制备人源化单克隆抗体。源自人源化单克隆抗体的抗体成分的应用避免了与鼠恒定区免疫原性相关的潜在问题。本发明的用于和人源化、嵌合或人RS7抗体联合治疗的人抗体，即，人EGP-1MAb或其它人抗体，如抗-EGP-2，MUC1-4，CEA，CC49，CSAp，PSMA，PSA，EGFR，A33和腿2/neuMAb，可获自转基因的非人类动物。例如参见Mendez等，NatureGenetics,15:146-156(1997);美国专利5,633,425，其全文引入此处作为参考。本发明的可用于联合治疗的人抗体还可与选自Le(y)、Tn、Tag-72、AFP、HCG、HCG-(3、铁蛋白、PAP、EGP-2、组蛋白、细胞角蛋白、腱生蛋白、CanAg、肾癌G250、VGFR1、VGFR2或其组合的抗原反应。例如人抗体可从含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中回收。通过灭活内源免疫球蛋白基因和导入人免疫球蛋白基因座将该小鼠体液免疫系统人源化。人免疫球蛋白基因座非常复杂且包含大量的不连续区段，其总共几乎占人基因组的0.2%。为确保转基因小鼠能够产生足够抗体库，必须将大部分人重链和轻链基因座导入小鼠基因组。这要用分步法来完成，开始要构建含有以种系构型的或者人重链或者轻链的免疫球蛋白基因座酵母人工染色体(YAC)。因为没插入的大小大约是1Mb，故构建YAC需要免疫球蛋白基因座重复片段的同源重组。将两种YAC，一种含有重链基因座而一种含有轻链基因座，经由含有YAC-酵母球芽与小鼠胚胎干细胞的融合而分别导入小鼠。然后将胚胎干细胞克隆显微注射至小鼠嚢胚。根据经由其生殖腺传输YAC的能力筛选结果得到的嵌合雄性然后将其与鼠抗体制备缺陷的小鼠进行繁殖。培养这两个转基因品系，一个含有人重链基因座而另一个含有人轻链基因座，产生响应免疫而生成人抗体的子代。克隆鼠免疫球蛋白可变区的一般方法描述于，例如Orlandi等Proc.Nat，lAcad.SciUSA86-3833(1989)的公开内容中，其全文引入作为参考。制备人源化MAbs的方法描述于，例如Carter等，Proc.Nat，lAcad.SciUSA89:4285(1992)，和Singer等J.Immun.150:2844(1992)，Mountain等Biotechnol.Genet.Eng.Rev.10:1(1992)，和Coligan10.19.1-10.19.11页，由此将上述每一文件均引入作为参考。通常，RS7抗体的Vk(可变轻链)和(可变重链)序列可通过多种分子克隆方法，如RT-PCR，5'-RACE和cDNA文库筛选获得。具体地，MAbRS7的VH和vk基因通过来自杂交瘤细胞的PCR扩增分别通过RT-PCR和5'-RACE而进行克隆，并用DNA测序确定其序列。为证实其可靠性，将克隆的W和Vh基因在细胞培养物中作为嵌合Ab表达，如0rlandi等，(Proc.Nat，lAcad.SciUSA,86:3833(1989))所述，其引入作为参考。根据V基因序列，然后设计和构建人源化RS7抗体，如Leung等(Mo1.Immunol.，32:1413(1995))所述，其引入作为参考。可从任何已知通过一般的分子克隆技术(Sambrook等，MolecularCloning,Alaboratoryma纖l，2薦(1989))制备鼠或嵌合RS7抗体的杂交瘤系或转染细胞系中制备cDNA。在一个优选的实施方案中，使用RS7杂交瘤系。用于mAb的Vk序列可使用引物VK1BACK和VKI魔(Orlandi等，1989)或如Leung等(BioTechniques，15:286(1993)，其引入作为参考)所描述的扩展引物组进4亍扩增，而Vb序列可4吏用引物对VH1BACK/VH1F0R(Orlandi等，1989above)，或与Leung等(Hybridoma，13:469(1994)，将其引入作为参考)所描述的与鼠IgG恒定区退火的引物进行扩增。将包含10fil第一链cDNA产物，10nl10xPCR緩沖液[500mMKCl，100mMTris-HC1(pH8.3)，15mMMgCL和0.01%(W/V)明胶〗(PerkinElmerCetus，Norwalk，CT)，250fiM各丽P，200nM引物，和5单位Taq腿聚合酶(PerkinElmerCetus)的PCR反应混合物实施30个PCR循环。每个PCR循环优选包括94C变性1分钟，5(TC退火1.5分钟，和721C聚合1.5分钟。扩增的Vk和VH片段可在2%琼脂糖上纯化(BioRad，Richmond,CA)。相似地，可通过长寡核苷酸模板合成和PCR扩增联合(如Leung等(Mol.Immunol,32:1413(1995)所述)构建人源化V基因。可将Vk的PCR产物亚克隆至staging载体，如基于pBR327的staging载体VKpBR，其包含Ig启动子，信号肽序列和便于VkPCR产物的框架内连接方便的限制性位点。可将VH的PCR产物亚克隆至相似staging载体，如基于pBluescript的VHpBS。包含各PCR产物的各克隆可用，被引入作为参考的Sanger等Proc.Nat1.Acad.Sci-USA，74:5463(1977)的方法进行测序。本文所述DNA序列应被理解为包括所有其等位基因，突变体和变体，无论是天然存在的还是诱导的。含有Vk和VH，和启动子和信号肽序列的表达盒分别从VKpBR和VHpBS剪切，经双限制性酶切为HindIII-BamHI片段。然后将Vk和VH表达盒分别连接至适宜的表达载体，如pKh和pGlg中(Leung等，Hybridoma，13:469(1994))。可将表达载体共转染至适宜的细胞中，例如骨髓瘤Sp2/0-Agl4(ATCC，VA)，选择潮霉素抗性的集落，和采用例如ELISA检测法，如下述检测上清液中嵌合抗体或人源化RS7MAb的制备。或者，可将VK和VH表达盒组装至改良的staging载体，VicpBR2和VHpBS2中，分另'J剪切为Xbal/BamHI和XhoI/BamHI片段，然后亚克隆至单个表达载体，如pdHL2，如Gilles等(JImmunol.Methods125:191(1989)所述和还可参加Losman等，癌症，80:2660(1997))而在SP2/0-AGL4细胞中表达。适用于本发明的另一载体是GS载体，如Barnes等，Cytotechnology32:109-123(2000)中所述，所述载体优选在NS0细胞系和CH0细胞中表达。Werner等，Arzneim.-Forsch./DrugRes.48(11)，Nr.8，870-880(1998)中描述了其它适宜的哺乳动物表达系统。然后按下述实施共转染和用ELISA检测分泌抗体的克隆。根据被引入作为参考的Co等JImmunol.，148:1149(1992)的描述，可将约lO^igVKpKh(轻链表达载体)和20ngVHpGIG(重链表达载体)通过电穿孔而用于转染5xl06SP2/0骨髄瘤细胞(BioRad,Richmond,CA)。转染后，可在96-孔微量滴定板上于完全HSFM培养基(LifeTechnologies,Inc.,GrandIsland,NY)中以37匸，5%C02培养细胞。可在加入终浓度500单位/ml潮霉素的潮霉素选择培养基(Calbiochem，SanDiego，CA)2日后开始选择步骤。克隆通常在电穿孔后2~3周出现。然后将培养物扩展以用于进一步的分析。适用的宿主细胞包括微生物的或哺乳动物的宿主细胞。优选的宿主是人细胞系，PER.C6，其为制备Mab而构建，和其它融合蛋白。因此，本发明一个优选的实施方案是包含编码抗-EGP-lMAb、缀合物、融合蛋白或其片段的DNA序列的宿主细胞。PER.C6细胞(WO97/00326)是通过使用含有在人磷酸甘油酸酯激酶(PGK)启动子的控制下Adserotype5(Ad5)E1A和E1B编码序歹'J(Ad5nucleotides459-3510)的质粒转染原代人胚胎视网膜细胞而产生。E1A和E1B分别是腺病毒早期基因活化蛋白1A和1B。该方法和组合物特别适用于生成发生翻译前修饰的，例如通过糖基化修饰的所需人重组蛋白的稳定表达。某些特性使得PER.C6特别适用于作为重组蛋白制备的宿主，如PER.C6是被完全定性的人细胞系且其已经发展了非常好的实验室操作。而且，PER.C6可在无血清缺乏任何人或动物来源的蛋白的培养基中以悬浮培养物生长且其生长适合滚瓶，摇瓶、旋转瓶和生物反应器，其倍增时间为约35小时。最后，ElA的存在导致上调CMV增强子/启动子调控下的基因表达而E13的存在防止了可能由于重组转基因的过表达而增强的p53-依赖的凋亡。在一个实施方案中，细胞能够产生比常规哺乳动物细胞系高2200倍的重组蛋白和/或蛋白性物质。用ELISA测试法鉴别分泌嵌合或人源化重链的阳性转染瘤克隆。简言之，将来自转染瘤培养物的上清样品(100nl)以三份加入用山羊抗-人(GAH)-IgG，F(ab')2片段-特异性抗体(JacksonImm画research，WestGrove,PA)预包被的ELISA微量滴定板上。滴定板室温下孵育1小时。用洗涤緩冲液(含0.05%聚山梨醇酯-20的PBS)洗板三次以除去未结合的蛋白质。将辣根过氧化物酶(HRP)缀合的GAH-IgG，Fc片段-特异性抗体(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)加入孔内，(100jil抗体稀释储存液x104，用未结合的抗体补充至终浓度1.0g/ml)。孵育1小时后，通常洗板三次。每孔加入反应液[100fi1含有167ng邻笨二胺(OPD)(Sigma,St.Louis,M0)，0.025%过氧化氢的PBS]。在黑暗中显色30分钟。在每孔中加入50nl4MHC1溶液终止反应，然后用自动化ELISA读数仪(Bio-Tekinstruments,Wi画ski，VT)测定490nm处吸光度。然后相对于无关联嵌合抗体标准(可获自Scotgen，Ltd.,Edinburg,Scotland)测定结合的嵌合抗体。抗体可按下述方法从细胞培养基中分离。转染瘤培养物适于无血清培养基。为制备嵌合抗体，利用HSFM在滚瓶中将细胞生长为500ml培养物。将培养物离心使细胞成团，上清液经0.2nm膜过滤。使过滤的培养基以lml/分的速度通过A蛋白柱(1x3cm)。然后用约10个柱体积的PBS洗柱，用含lOmMEDTA的0.1M甘氨酸的緩冲液(pH3.5)从柱上洗脱蛋白A结合的抗体。在lOjil3MTris(pH8.6)的存在下，搜集lml洗脱级分，测定280/260nm处吸光度确定蛋白质浓度。将峰值洗脱级分集中，对PBS透析，用例如Centricon30(Amicon，Beverly,MA)浓缩蛋白质。用ELISA测定抗体浓度，如前，用PBS将其浓度调整至约1mg/ml。在样品中益于加入0.01%(w/v)的叠氮化钠作为保存剂。用于制备RS7抗体的引物的核苷酸序列如下述实施例2所列。在一个优选的实施方案中，人源化RS7抗体或抗体片段包括鼠RS7Mab的互补决定区(CDRS)和人抗体轻链和重链可变区的框架区(FR)和人抗体的轻链和重链恒定区，其中人源化RS7的轻链可变区的CDR包括含有氨基酸序列KASQDVSIAVA的CDR1;含有氨基酸序列SASYRYT的CDR2;和含有氨基酸序列QQHYITPLT的CDR3;而人源化RS7MAb的重链可变区的CDR包括含有氨基酸序列NYGMN的CDR1;含有氨基酸序歹'JWINTYTGEPTYTDDFKG的CDR2和含有氛基酸序列GGFGSSYWYFDV的CDR3。同样优选的，人源化抗体轻链和重链可变区的FR包括至少一种被鼠RS7Mab的所述相应FR置换的氨基酸。可采用多种已良好建立的方法从杂交瘤培养物中分离和纯化MAb。所述分离方法包括使用A蛋白琼脂糖凝胶的亲和层析，大小排阻层析和离子交换层析。例如参见Coligan2.7.1-2.7.12页和2.9.1_2.9.3页。还可参见，METHODSINMOLECULARBIOLOGY,VOL.10，79-104页(TheH画naPress,Inc.1992)中的Baines等"PurificationofImmunoglobulinG(IgG)，，。RS7MAb可采用本领域技术人员众所周知的多种方法进行特征描述。例如可使用非直接免疫荧光检测，流式细胞计数分析或Western分析鉴别RS7MAb结合RS7抗原的能力。RS7抗体片段的制备本发明涉及RS7和hRS7抗体片段的用途。识别特异性表位的抗体片段可用已知方法制备。抗体片段是抗体的抗原结合部，如F(aV)2，Fab、Fab，Fv，sFv等。其它抗体片段包括，但不限于通过抗体分子的胃蛋白酶消化制备的F(ab)。片段，和可通将F(ab)。片段的二硫键还原而制备的FaV片段。这些方法描述于，例如Goldenberg，美国专利4，036，945和4，331,647和本文所包含的参考文献中，将所述专利全文引入此处作为参考。同样，参见Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J73:119(1959)，Edelman等，METHODSINENZYM0L0GYVol.1，422页(AcademicPress1967)，和Coligan2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。或者，可构建Fab'表达文库(Huse等，1989，Science,246:1274-1281)从而可以快速且简便地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab'片段。本发明包括抗体和抗体片段。单链Fv分子(scFV)包括VL区和VH区。VL和VH区联合形成耙位结合位点。这两个区还可通过肽连接子(L)而共价相连。scFV分子可被表示为或者VL-L-VH若VL区是scFV分子的N-末端部分，或者VH-L-VL若VH区是scFV分子的N-末端部分。制备scFV分子和设计适用的肽连接子的方法描述于美国专利4,704,692，美国专利号4,946,778，R.Raag和M.Whitlow,"SingleChainFvs."FASEBVol9:73-80(1995)和R.E.Bird和B.W.Walker,"SingleChainAntibodyVariableRegions,"TIBTECH，Vol9:132-137(1991)中。这些参考文件全文引入此处作为参考。可通过全长抗体的蛋白水解作用或编码片段的DNA在大肠杆菌(E.coli)中或另一宿主中的表达来制备抗体片段。可采用常规方法用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化全长抗体而获得抗体片段。例如抗体片段可通过用胃蛋白酶酶法裂解抗体而提供表示为F(at/)2的5S片段而制备。该片段还可用巯基还原剂，和可任选地由二硫键的裂解而产生的巯基的阻断剂进一步裂解，以产生3.5SFaV单价片段。或者，使用木瓜蛋白酶的酶性裂解可直接产生两个单价Fab片段和Fc片段。这些方法描述于，例如Goldenberg，美国专利4,036,945和4，331，647，和本文包括的参考文件，所述专利全文引入此处作为参考。并且，参见Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959)，EDELMAN等，METHODSINENZYM0L0GYVol.1,422页(AcademicPress1967)，和Coligan2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。抗体片段的另一形式是编码单个互补决定区(CDR)的肽。CDR是抗体的可变区的片段，其与抗体结合的表位在结构上互补且比可变区的其它部分更具可变性。因此，CDR有时是指高可变区。可变区包括三个CDR。可通过构建编码所需要抗体的CDR的基因而获得CDR肽。例如可通过采用多聚酶链反应从产生抗体的细胞的RNA合成可变区制备所述基因。例如参见Larrick等，Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106(1991)^Courtenay-Luck，"GeneticManipulationofMnonoclonalAntibodises，，，MONOCLONALANTIBODIES:廳UCTIONENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION中，Ritter等(eds.)，166-179页(CambridgeUniversityPress1995);和Ward等，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies,"MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATIONS中，Birch等，(eds.),137-185页(Wiley-Liss，Inc.1995)。其它裂解抗体的方法，如分离重链以便形成单价轻链-重链片段，片段的进一步裂解，或其它酶，化学或遗传技术也是可以使用的，只要片段能与被完整抗体识别的抗原结合。嵌合、人源化和人RS7抗体融合蛋白的制备抗体融合蛋白及其片段可通过多种常规方法制备，所述方法包括两个官能团间的戊二醛连接直至更特别的连接。抗体和/或抗体片段优选彼此直接或经由连接部分，经由抗体或片段上的一个或多个官能团例如胺基、羧基、苯基、巯基或羟基而共价结合。可以使用戊二醛以外的多种常规连接剂，例如二异氰酸酯，二异硫氰酸酯，二(羟基琥珀酰亚胺)酯，碳二亚胺，马来酰亚胺鞋基琥珀酰亚胺酯等。制备嵌合，人源化和人RS7抗体融合蛋白的简单方法是将抗体或片段在存在戊二醛的条件下混合以形成抗体融合蛋白。初始希夫碱连接基团可通过例如硼氢化物还原成仲胺而被稳定。二异氰酸酯或碳二亚胺可用于代替戊二醛而作为非位点特异性连接子。抗体融合蛋白被预期含有高于Mab的结合特异性，因为融合蛋白包括结合RS7抗原的至少两种表位的部分。因此，抗体融合蛋白是RS7抗原结合蛋白用于治疗的优选形式。在本文中，抗体融合蛋白包括至少两种嵌合、人源化或人RS7MAb，或其片段，其中至少两种MAb或片段与RS7抗原的不同表位结合或抗RS7表位和完全不同的抗原的表位。例如双特异性RS7抗体融合蛋白可包括CEA抗体或其片段和RS7MAb或其片段。所述双特异性RS7抗体融合蛋白可以，例如通过从CEA获得F(aV)2片段如上述而得以制备。抗体F(aV)2片段的链间二硫键被半胱氨酸轻微还原，谨慎地以便避免轻-重链连接，从而形成Fab'-SH片段。巯基被过量二马来酰亚胺连接剂活化(1,1，-(亚甲基二-4，1-亚苯基)双马来酰亚胺)。将RS7Mab转变为FaV-SH然后与活化的CEAFab'-SH片段反应从而获得双特异性RS7抗体融合蛋白。多特异性RS7抗体融合蛋白可通过将RS7抗原结合部分加至双特异性嵌合、人源化或人RS7抗体融合蛋白获得。例如双特异性抗体融合蛋白可与2-亚氨基硫杂环戊烷反应而导入一个或多个用于将双特异性融合蛋白偶连至第三个RS7抗原MAb或片段的巯基，其中使用上述双马来酰亚胺活化方法。这些用于制备抗体复合物的技术是本领域技术人员熟知的。例如参见美国专利4，925，648，其全文引入作为参考。双特异性抗体可通过多种常规方法制备，例如二硫化物裂解和完整IgG混合物的重建或，优选F(ab')2片段，融合多于一个杂交瘤从而形成能产生具有多于一种特异性的抗体的多瘤，和通过遗传工程。已经通过对来自不同抗体还原裂解的Fab'片段的氧化裂解而制备双特异性抗体融合蛋白。其可方便的通过如下方法实施，通过混合两种不同的用胃蛋白酶消化两种不同抗体而制备的F(ab')2片段，还原裂解从而形成FaV片段的混合物，然后氧化重建二硫键从而制备包括含有特异性针对每个原始表位的Fab'部分的双特异性抗体融合蛋白的F(ab')2片段的混合物。制备抗体融合蛋白的一般方法可见于，例如Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.93:470(1961)，Hammering等，J.Exp.Med.128:1461(1968)，和美国专利4,331,647中。本发明涉及包含至少一种第一抗-EGP-1MAb或其片段和至少一种除外本发明的抗-EGP-lMAb或其片段的第二MAb或其片段的抗体融合蛋白或其片段。通过使用异双功能连接剂如马来酰亚胺羟基琥珀酸亚胺酯可实现高选择性连接。酯和抗体或片段的反应将在抗体或片段衍生胺基，然后将该衍生物与，例如抗体Fab片段具有游离巯基(或，采用例如添加了巯基的较大片段或完整抗体的Traut氏试剂)反应。所述连接剂不太可能在相同抗体内交联基团并提供了连接的选择性。将抗体或片段在远离抗原结合位点的位点连接是有益的。其可通过，例如连接至裂解的链内巯基而实施，如上述。另一方法包括将具有氧化糖部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的另一抗体反应。这形成了希夫碱(亚胺)键，其优选通过还原成仲胺，例如通过硼氢化物还原，形成最终的缀合物而稳定。对于小分子，所述位点特异性连接描述于美国专利4,671,958中，而对大附加物则见美国专利4,699,784-引入作为参考。具有长度多于12个氨基酸残基的连接子(例如15-或18-残基连接子)的ScFv能产生同链上VH和VL区间的相互作用而通常形成单体、二聚体(称为双抗体)和少量高分子量多聚物的混合物(Kortt等，Eur.J.Biochem.(1994)221:151-157)。然而，具有长度多于5个或少于5个氨基酸残基的连接子的ScFv，阻止了同链上VH和VL区的分子内配对，强制不同链上VH和VL区的配对。3-12个残基的连接子主要形成二聚体(Atwell等，ProteinEngineering(1999)12:597-604)。用0~2个残基的连接子，会形成scFv的三聚体(称为三抗体)，四聚体(称为四抗体)或更高的低聚体；然而，低聚反应的精确模式显示出除了连接子长度以外还依赖组成和V-区的方向。例如用0个残基的连接子，抗-神经氨酸酶抗体NC10的scFv主要形成三聚体(VH至VL方向)或四聚体(VL至VH方向)(Dolezal等，ProteinEngineering(2000)13:565-574)。对于用卜和2-残基连接子从NC10构建scFV，VH至VL方向主要形成二聚体(Atwell等，ProteinEngineering(1999)12:597-604);相反地，VL至VH方向形成四聚体，三聚体，二聚体和更高分子量多聚体的混合物(Dolezal等，ProteinEngineering(2000)13:565_574)。对于抗-CD19抗体HD37以VH~VL方向构建scFV，0-残基连接子只形成三聚体而1-残基连接子只形成四聚体(LeGall等，FEBSLetters(1999)453:164-168)。本发明的RS7抗体及其片段还可用于制备抗原-特异性双抗体，三抗体和四抗体，其是多价的但具有单特异性。两个或多个scFv分子的非共价联合可形成功能性双抗体，三抗体和四抗体。单特异性双抗体相同scFv的同型二聚体，其中每个scFv包括来自选择的抗体的VH区，所述选择的抗体通过短连接子而与相同抗体相连。二体是通过非共价联合两个scFV形成的二价二聚体，产生两个Fv结合位点。三体来自三个scFv的三价三聚体的形成，产生三个结合位点，而四体来自四个scFvs的四价四聚体，产生四个结合位点。某些单特异性二体是通过使用包含重组基因构建体的表达载体而制备的，所述重组基因构建体包含VH1-连接子-Vu。参见Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993);Atwell等，MolecularImmunology33:1301-1302(1996);Holliger等，NatureBiotechnology15:632-631(1997);Helfrich等，Int.J.Cancer76:232-239(1998);Kipriya磨等，Int.J.Cancer77:763-772(1998);Holiger等，CancerResearch59:2909-2916(1999))。构建scFVs的方法7>开于US-4,946,778(1990)和US-5，132，405(1992)中。根据scFV而制备多价，单特异性结合蛋白的方法公开于US-5，837，242(1998)，US-5，844，094(1998)和WO-98/44001(1998)中。本发明的优选实施方案是包含一个或多个具有对EGP-1靶抗原亲和力的抗原结合位点和一个或多个具有对半抗原分子亲和力的半抗原结合位点的多价，多特异性抗体或其片段。测定抗体结合亲和力由此分离的mRS7，cRS7和hRS7抗体的相对结合亲和力可通过直接放射免疫法测定。RS7可用'3'1或mI以氯胺-T法进行标记(例如参见Greenwood等，Biochem.J.，89:123(1963)，其引入作为参考)。通常将碘化抗体的比活调整至约10fiCi/[ig。未标记的和标记的抗体用反应培养基(添加了1。/。马血清和lOOjig/ml庆大霉素的HSFM)稀释至适宜浓度。将适宜浓度的标记的和未标记的抗体一起加入反应管，总体积为100nl。取样ME180细胞(人颈癌细胞系)并测定细胞浓度。离心培养物然后收集于反应培养基中洗涤一次的细胞，然后在反应培养基中混旋至终浓度约10'细胞/ml。所有步骤均在41C冷条件下实施。将lOOjil细胞悬液加入反应管。4"C冷条件下实施反应2小时，期间定期轻微震荡反应管以便使细胞重悬。反应期后，每管加入5ml洗涤緩冲液(含有1%BSA的PBS)。离心悬液然后用5ml洗涤緩沖液第二次洗涤细胞片状沉淀物。离心后，在Y计数器(Minaxi，PackardInstruments,Sterling,Va.)中计数残留在细胞片状沉淀物中的残留放射性的量。表达载体表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，将基因表达置于包括组成型或可诱导启动子，组织-特异性调节元件和增强子的特定调节元件的调控之下。所述基因被称为"操作性连接于"调节元件。启动子是引导结果基因转录的DNA序列。结构基因是转录成信使RNA(mRNA)，后者然后翻译成特定多肽的特征性氨基酸序列的DNA序列。典型地，启动子位于基因的5'区，近似于结构基因的转录起始位点。如果启动子是一个可诱导启动子，那么响应诱导剂转录速率增加。相反，如果启动子是一个组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调控。增强子是一种DNA调节元件，其可提高转录效率，而不论增强子相对于转录起始位点的距离或方向如何。分离的DNA分子是未整合至生物体的基因组DNA中的DNA片段。例如克隆的RS7抗原基因是从哺乳动物细胞基因组DNA中分离的DNA片段。分离的DNA分子的另一实例是未整合至生物体的基因组DNA中的化学合成,分子。互补DNA(cDNA)是通过酶逆转录酶从mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，与mRNA的部分互补的引物用于启动反转录。本领域技术人员还使用术语"cDM"来指由所述单链DNA分子和其互补DNA链组成的双链DNA分子。克隆化载体载体是一种DNA分子，如质粒、粘性质粒或噬菌体，其具有在宿主细胞中自主复制的能力。克隆化载体典型地包含一个或少量限制性内切酶识别位点，在该识别位点，外源性DNA序列可以可确定的方式插入而不失去载体的基本生物功能，还包含一个标记基因，其适用于鉴别和选择用克隆化载体转化的细胞。标记基因典型地包括提供四环素抗性或氨千西林抗性的基因。重组宿主可以是含有克隆化载体或表达载体地任何原核或真核细胞。该术语的意义还包括经i核细胞。术语表达是指基因产:"生物合成。例如在i构基因^i青况下，表达涉及结构基因转录为mNA和mRNA翻译为一个或多个多肽。人源化、人和嵌合RS7抗体在治疗和诊断中的用途本发明涉及一种诊断或治疗个体中恶性肿瘤的方法，包括对个体给予治疗有效量的包含EGP-1MAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段的治疗缀合物，其中EGP-1MAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段与至少一种治疗剂结合并随后在药学上适用的赋形剂中配制。其还预期了未缀合的(棵)EGP-1MAb或与其它抗原-结合部分的融合构建体还可用于治疗表达EGP-1的癌细胞。这些未结合的抗体可方便地与其它治疗模式，如化疗，放疗和/或免疫治疗，或一起或与多种次序和程序联合。还优选的是一种诊断或治疗癌症的方法，包含对有此需要的个体给予包含一个或多个针对EGP-1抗原的抗原结合位点和一个或多个半抗原结合位点的多价，多特异性抗体或其片段，等待足够长的时间以便使非结合蛋白的量从个体血流中清除；然后对所述个体给予包含诊断剂、治疗剂或其组合，与所述抗体的结合位点结合的载体分子。在一个优选的实施方案中，癌症是肺癌、乳癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌或结肠癌。用于制备单克隆抗体(MAb)的杂交瘤技术已经通过了一种用于制备能定位或杀死癌细胞的分子探针的方法。使用放射性标记的MAb的肿瘤显像技术已经被用于描述多种恶性肿瘤中的癌浸润。在实验动物和人类中，抗体和其它靶向抗体已被用于在多种表达癌胚的肺瘤中癌胚抗原的放射免疫测定，以及肿瘤如黑素瘤，结肠癌和乳癌。Goldenberg等，CancerRes.40:2984(1980);Hwang等，CancerRes.45:4150(1985);Zalcberg等，J.Nat，l.CancerInst.71:801(1983)5Colcher等，CancerRes.43:736(1983);(Urson等，J.Nucl.Med.24:123(1983)jDeUnd等，CancerRes.40:3046(1980)JEpenetos等，Lancet2:999(1982)。MAb在体外诊断中的用途是众所周知的。例如参见Carlsson等，Bio/Technology7(6):567(1989)。例如MAb可用于检测生物样组织中肿瘤相关抗原的存在。MAb还可采用如放射性免疫测试法，酶中肿瘤相关抗原的量。肺瘤-靶向MAb和毒素的缀合物可用于选择性在体内杀死癌细胞(Spalding,Bio/Technology9(8):701(1991)^Goldenberg，ScientificAmericanScience&Medicine1(1):64(1994))。例如实验动物模型中的治疗研究已经证实了携带细胞毒性放射性核素的抗体的抗-肿瘤活性。(Goldenberg等，CancerRes.41:4354(1981)，Cheung等，J.Nat"lCancerInst.77:739(1986)，和Senekowitsch等，J.Nucl.Med.30:531(1989))。还参见Stein等，AntibodyImmunoconj.Radiopharm.4:703(1991)，其全文引入作为参考。而且，已经开始关于治疗淋巴瘤，黑素瘤，和其它恶性肿瘤的使用某些该Mabs的I期治疗试验。例如参见DeNardo等，Int.J.CancerSuppl.3:96(1988)，和Goldenberg等，J.CIin.Oncol.9:548(1991)。人源化，嵌合和完整人抗体及其片段适用于诊断方法和治疗方法中。因此，本发明包括将诊断剂或治疗剂，或其组合递送至靶位的方法，包括(i)提供包括抗-EGP-1抗体的组合物和(ii)对有此需要的个体给予诊断性或治疗性抗体缀合物。优选地，将本发明的嵌合，人源化和完整人类RS7抗体及其片段用于治疗恶性肿瘤的方法中。本文还描述了靶向癌细胞的诊断缀合物或治疗缀合物，其包含含有可与癌细胞结合的抗-EGP-lMAb或其片段或抗体融合蛋白或其片段的抗体成分，其中抗体成分与至少一种诊断剂或至少一种治疗剂结合。优选地，诊断缀合物至少包括光活化性诊断剂或MRI造影剂。更优选地，诊断剂是能量为60~4，000keV的放射性标记物。用于治疗的组合物包含至少一种单独棵或结合的人源化、嵌合或人RS7抗体，或与本发明的其它棵或结合的人源化，嵌合，人类或其它抗体联合，或与本文未公开的其它棵或结合的人源化、嵌合或人抗体联合。本发明还包括将结合的或棵抗体与不与抗-EGP-1抗体结合的治疗剂如免疫调节剂，或诊断剂一起给药。针对相同或不同的表位或抗原的棵或结合的抗体还可与一种或多种本发明的抗体联合。因此，本发明涉及单独施用抗-EGP-1抗体及其片段，作为棵抗体或抗体片段，或作为多元治疗的施用。优选地，抗体是人源化、嵌合或完整人RS7抗体或其片段。部分的多元治疗还包括增加了以棵抗体，融合蛋白，或免疫缀合物的形式施用其它抗体的使用棵抗-EGP-l抗体的免疫治疗。例如人源化，嵌合或完整人RS7抗体可与另一棵人源化，嵌合RS7或其它抗体，或与同位素、一个或多个化疗剂、细胞因子、毒素或其组合结合的人源化，嵌合RS7或其它抗体位素联合。例如本发明预期了棵或结合的EGP-1或RS7抗体或其片段在其它实体肿瘤/癌相关的抗体如抗-EGP-2，CEA，CSAp，MUCl-4，EGFR，HER2/廳，PSA，CC49(抗-Tag72抗体)和PSMA抗体的施用之前，与之联合或之后的治疗。这些实体癌抗体可以是棵或与尤其，药物、酶、激素、毒素，同位素或免疫调节剂缀合的。人源化，嵌合或完整人RS7抗体和毒素的融合蛋白或也可用于本发明。可构建多种不同的抗体组合，或作为棵抗体或作为部分棵和部分与治疗剂或免疫调节剂结合的。或者，不同的棵抗体组合可用于与其它治疗剂，如细胞毒类药物或与放射联合施用。所述抗体的组合还可用，有利地，如本领域已知的反义寡核苷酸制备。照这样，治疗缀合物还包括优选可用于对B-细胞恶性肿瘤的抗癌基因和致癌基因产物的寡核苷酸，尤其是反义寡核苷酸。例如抑制bcl-2表达的反义分子，其被描述于美国5，734，033(Reed)，将其全文引入作为参考，其也缀合于或形成抗体融合蛋白的治疗剂部分或与本发明的人源化RS7抗体一起施用。本文所描述的连于诊断剂或治疗剂的单特异性结合蛋白的直接靶向RS7阳性肿瘤。单特异性分子选择性结合靶定抗原并且随着分子上结合位点数目的增加，对靶细胞亲和力就增加并在所需位置观察到更长的停留时间。而且，非-抗原结合的分子可快速从体内清除而将正常组织暴露量最小化。多特异性结合蛋白的使用为随后的诊断剂或治疗剂的特异性递送预靶定了RS7阳性肿瘤。药剂由含有肽的琥珀酰甘氨酰组胺(HSG)携带。名为679(IgGl，K)鼠单克隆抗体以高亲和性与含有三肽部分HSG结合(Morel等，Molecularimmunology,27，995-1000，1990)。679MAb可以和可结合HSG和靼抗原的hRS7结合而形成双特异性结合蛋白。也可使用选择性半抗原。这些结合蛋白选择性地与靶定抗原结合以便产生增高的亲和力和在所需位置上较长的停留时间。而且，非-抗原结合的二抗体可从体内快速地清除而将正常组织暴露量最小化。RS7抗体及其片段可用于治疗哺乳动物病症如癌症。癌症包括，但不限于肺癌、乳癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌和结肠癌症。根据本发明将诊断剂或治疗剂递送至靶位用于诊断或治疗包括提供含有诊断剂或治疗剂的抗-EGP-l抗体或其片段并将结合蛋白给予有此需要的个体。诊断还需要采用已知技术检测结合蛋白的步骤。本发明的抗体及其片段和诊断剂或治疗剂施用可采用静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、胸膜内、鞘内、经区域性导管的输注或直接伤口内注射施用于哺乳动物。当注射施用结合蛋白时，可以连续输注或单次或多次快速浓注。用于治疗，20~800mg/m2的剂量是适宜的，优选100-500mg/m2，而同量低剂量为诊断成4象推荐的，如0.5mg-100mg/患者。所述剂量可按不同的频率重复，这依赖于临床情况和患者的耐受程度。抗体和诊断剂或治疗剂可作为试剂盒在药学可用的载体中，优选磷酸盐緩冲生理盐水(PBS)以生理pH和浓度而提供给人类或哺乳动物治疗和诊断用途。制剂优选是无菌的，特别是如果其意在用于人类时。所述试剂盒的可选的组分包括稳定剂，緩冲液，标记剂，放射性同位素，顺磁性化合物，用于增强清除率的第二抗体和常规的注射器，柱，瓶等。棵抗体治疗治疗有效量的棵嵌合，人源化和完整人RS7抗体，或其片段，可在药学可用的赋形剂中配制。棵嵌合，人源化和完整人RS7抗体的效能可通过对这些棵抗体补充一种或多种其它棵抗体，一种或多种嵌合，人源化和完整人RS7抗体与如药物，毒素，免疫调节剂、激素、生长因子、酶、寡核苷酸或治疗性放射性核素的治疗剂缀合的免疫缀合物，或一种或多种包含药物、毒素、免疫调节剂、激素、生长因子、酶、寡核苷酸或治疗性放射性核素的治疗剂，与RS7抗体或其片段同时或次序或根据处方剂量方案施用，而得以增强。在一个优选的实施方案中，本发明的棵或结合的RS7抗体与至少一种癌症药物联合。所述联合治疗能提高药物或需要的较低药物剂量的效能。例如测定Dox-RS7和2P-Dox-RS7分别对肺癌细胞系，Calu3，和两种乳癌细胞系，MDA468和T47D的ICs。值。Calu3和T47D细胞具有EGP-1抗原阳性而具有CEA抗原阴性，而MDA468对EGP-1和CEA抗原均是阳性的。结果显示Dox-RS7的ICs。值是0.04ng/ml而2P-Dox-RS7的ICs。值是0.023jtg/ml。因此，将本发明的棵、人类、人源化或嵌合抗-EGP-l抗体或片段与特定药物，如2P-Dox缀合可帮助克服多药物抗性。但抗体与特定药物联合时，如上述，其也是可能的。RS7免疫缀合物本发明还涉及人源化，嵌合和人RS7抗体及其片段用于治疗的用途。免疫治疗的目的是对靶细胞递送细胞毒性剂量的放射、毒素、细胞因子、酶、或激素或药物，同时要将非靶位组织的暴露量最小化。本发明的RS7抗原结合蛋白可用于治疗多种肿瘤，如肺，乳腺，膀胱，卵巢，子宫，胃和前列腺的胂瘤。本发明的任何抗体或抗体融合蛋白及其片段都可以和一种或多种治疗剂或诊断剂缀合。通常，一种治疗剂或诊断剂与每种抗体或抗体片段结合而超过一种治疗剂或诊断剂可与相同的抗体或抗体片段缀合。如果Fc区不存在(例如当用作免疫缀合物抗体成分的抗体是抗体片段时)，可能会将糖部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。例如参见Leung等，RImmunol.154:5919(1995);Hansen等，美国专利5，443，953(1995)，Leung等，美国专利6,254,868，其均全文引入此处作为参考。工程化处理的糖部分可用于缀合治疗剂或诊断剂。将肽经由抗体糖部分而与抗体成分缀合的方法是本领域技术人员熟知的。例如参见Shih等，Int.J.Cancer41:832(1988)jShih等，Int.J.Cancer46:1101(1990);和Shih等，美国专利5，057，313，其均全文引入此处作为参考。一般方法包括将含有氧化糖部分的抗体成分与含有至少一种游离胺官能团的载体聚合物反应然后加载多种肽。该反应形成了希夫碱(亚胺)键，其可通过还原成仲胺形成最终的缀合物而稳定。且，可将抗体与螯合剂如DTPA(如Mx-DTPA)、D0TA、TETA或丽A缀合。本发明的抗体融合蛋白包括两种或多种抗体或其片段且构成该融合蛋白的每种抗体或片段可包含治疗剂或诊断剂。此外，一种或多种抗体融合蛋白的抗体或片段可含有多于一种的缀合的治疗剂或诊断剂。此外，治疗剂无须相同而可以是不同的治疗剂，例如可将药物和放射性同位素与相同的融合蛋白结合。特别地，IgG可以是用13'1放射性标记的并结合至药物。"'I可被掺至IgG的酪氨酸和与IgG赖氨酸的s氨基连接的药物。治疗剂和诊断剂均还可与还原的巯基结合和与糖侧链结合。多种诊断和治疗试剂可方便地与本发明的抗体结合。此处引用的治疗剂是也可用于与上述棵抗体分开施用的那些试剂。治疗剂包括，例如化学治疗药物如长春花生物碱，蒽环类抗生素，表鬼臼毒素，紫杉烷类，抗代谢物，烷化剂，抗生素，Cox-2抑制剂，抗有丝分裂物，抗血管生成剂和调亡剂，特别是阿霉素，甲氨蝶呤，紫杉醇，CPT-ll，喜树碱和来自这些及其它类抗癌药等的其它药物，曱肼衍生物，肾上腺皮质抑制剂，拮抗物，内皮生长抑素，紫杉醇等。其它适用于制备免疫缀合物和抗体融合蛋白癌症化学治疗药物包括氮芥类，氮丙啶衍生物，烷基磺酸酯类，亚硝基脲类，三氮烯类，叶酸类似物，蒽环类抗生素，紫杉烷类药，C0X-2抑制剂，嘧啶类似物，噪呤类似物，铂配位络合物，激素，酪氨酸激酶抑制剂如抑制EGF-受体酪氨酸激酶，BCRABL酪氨酸激酶或VEGF-体酪氨酸激酶等的那些。适用的化学治疗剂描述于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,19THEd。(MackPublishingCo.1995)，在GOODMAN和GILMAN'STHEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS，7thEd.中(MacMillanPublishingCo.1985)中以及这些出版物的子务订版。其它适宜的化学治疗剂，如实验药物，是本领域技术人员已知的。还可将毒素，如假单胞菌外毒素复合于或形成本发明的RS7和hRS7抗体的免疫缀合物的治疗剂部分。其它适用于制备所述缀合物或其它融合蛋白的的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNase)、DNaseI，葡萄球菌肠毒素-A，美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。例如参见Pastan等CELL47:641(1986)，和Goldenberg，CA-ACancerJournalForClinicians44:43(1994)。适用于本发明的其它毒素是本领域技术人员已知的并被描述于美国专利6,077,499中，所述美国专利全文引入作为参考。还可将免疫调节剂，如细胞因子结合于或形成EGP-1，RS7和hRS7免疫缀合物的治疗剂部分，或不与本发明的嵌合、人源化或人RS7抗体或其片段结合而施用。如本文所使用的，术语"免疫调节剂"包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素，如肿瘤坏死因子(TNF)和造血因子，如白细胞介素(例如白细胞介素-l(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18和IL-21)，集落刺激因子(例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF))，干扰素(例如干扰素-a、-P和-y)，促红细胞生成素、促血小板生成素或其组合。适宜的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL_21，及其组合，和干扰素-y，TNF-a等。或者，个体可接受棵EGP-1或RS7抗体和单独施用的细胞因子，其可在施用棵RS7抗体之前、同时或之后进行施用。如上所述，RS7抗体还可与免疫调节剂结合。免疫调节剂还可以与含有可与不同抗原结合的一个或多个抗体的杂合抗体结合。治疗剂或诊断剂可通过二硫键的形成在还原抗体成分的铰链区连接。作为一种选择，还可利用异双官能交联剂，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)将所述肽合抗体连接。Yu等，Int.J.Cancer.，56:244(1994)。用于所述结合的一般方法是本领域众所周知的。例如参见Wong，CHEMISTRYOFPROTEINCONJUGATIONANDCROSS-LINKING(CRCPress1991);Upeslacis等，"ModificationofAntibodiesbyChemicalMethods，"在MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,Birch等(eds.)中，187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995);Price,"Production和CharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies,M0N0C固ALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGI羅R-INGANDCUNICALAPPLICATION中，Ritter等(eds.)中，60-84页(CambridgeUniversityPress1995)。或者，治疗剂或诊断剂可经由抗体Fc区中的糖部分进行结合。糖基团可用于增加肽与巯基结合的相同肽的加载，或糖基团可用于结合不同的肽。此外，放射性标记的抗体，免疫缀合物，或其片段可包括用于诊断性影像学的y发射性同位素或正电子发射体。适用的放射性同位素，特别是能量为25~4，000keV，包括'311，'231，124I，86Y，"Cu，"Cu，67Ga，68Ga，"mTc，94mTc，18F，HC，13N，150,76Br等。例如参见名为"LabelingTargetingAgentswithGallium-68"发明人为G.L.Griffiths和W.J.McBride的美国专利申请(美国临时申请号60/342，104)，其公开了为了成像目的的正电子发射体，如18F，68Ga，99mTc等，所述申请全文引入作为参考。优选地，诊断性和治疗性放射性核素的能量为25-4，OOOkeV。其它适用的放射性核素包括9°Y，"'In，125I,3H，35S,14C，'86Re，mRe，'"Re,'"Lu，67Cu，212Bi，2l3Bi，川At，mAu，"4Ac，126I，l33I，"Br，''3mIn，95Ru，"Ru，'。3Ru，'。5RU，'。7Hg，2。3Hg，9"Tc，m，e，122mTe，，25mTe，"5Tm，"7Tm，，"Tm，lllAg，mpt，，pd，"p，33P，47Sc，'"Sm，177Lu，'。5Rh，'42Pr，"3Pr，l61Tb，166Ho，199Au，"CO，58Co，5'Cr，59Fe，58F,75Se，2"T1，225Ac，76Br，86Y，169Yb，166Dy，212Pb和223Ra。例如"Cu，由于61.5小时半衰期和丰富的p粒子和y射线的供应而被认为是一个更佳的用于免疫治疗的放射性同位素，可用螯合剂对溴乙酰氨基-节基-四乙基胺四乙酸(TETA)而与RS7抗原结合蛋白结合。Chase,如上。或者，发射高能(3粒子的90Y可用二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)与RS7抗原结合蛋白偶联。而且，用于直接用'3'I放射性标记RS7Mab的方法描述于Stein等(1991)，如上，和Govindan等，WO9911294A1名为"StableRadioiodineConjugates和MethodsforTheirSynthesis,"的专利，其全文引入此处作为参考。含有用于热中子活化治疗的硼附加物-加载的载体的本发明的RS7抗体或其片段将以相似的方式受到正常的作用。然而，在实施中子辐照前等待直至为靶定的免疫缀合物清除将是有益的。使用与RS7抗体结合的抗体能够加速清除。参见美国专利4,624,846对该一般原理的描述。例如硼附加物如碳硼烷可与RS7抗体连接。碳硼烷可利用侧链上的羧基官能团而制备，如本领域所熟知的。碳硼烷与载体，如氨基葡聚糖的连接可通过活化碳硼烷的羧基并与载体上的胺缩聚产生中间体缀合物而获得。然后该中间体缀合物与RS7抗体结合。在给予RS7抗体缀合物之后，硼附加物被惹中子辐照活化而转化放射性原子，其通过a发射而衰变从而产生高毒性，短程的作用。此外，本发明包括在个体中诊断癌症的方法。可通过施用诊断上有效量的在药学上适用的赋形剂配制的诊断缀合物，然后检测所述标记物实施诊断。例如放射性和非放射性试剂可用作诊断剂。适用的非放射性诊断剂是适用于磁共振成像，计算机控制断层扫描术或超声的造影剂。磁成像剂包括，例如非放射性金属，如锰，铁和钆，当与本发明的抗体一起使用时，其与包括2-千基-DTPA及其一甲基和环己基类似物的金属-螯合剂组合物复合。参见与2001年10月10日提交的美国序号09/921，290，其全文引入作为参考。因此，描述了在个体中诊断恶性肺瘤的方法，包括(i)用包含棵抗-EGP-lMAb或其片段或棵抗体融合蛋白或其片段的组合物对来自个体的样品实施体外诊断。例如RT-PCR和免疫检测体外诊断方法可作为有用的诊断/检测方法用于检测组织，血液和其它体液中EGP-1瞬间量的存在。免疫组织化学可用于检测细胞或组织中EGP-1的存在。优选地，进行诊断的恶性肿瘤是癌症。最优选地，癌症选自肺癌、前列腺癌、卵巢癌、乳癌、结肠癌和膀胱癌。此外，可检测的标记，如荧光分子、或细胞毒害剂，如重金属或放射性核素可结合于螯合剂如DTPA、D0TA、TETA或N0TA或适用的肽。例如治疗有效的免疫缀合物可通过使光活化剂或染料与抗体融合蛋白结合而得到。荧光组合物，如焚光染料，和其它色原，或染料，如对可见光敏感的外啉已经通过将适宜的光对准损害处而用于检测和治疗损害。在治疗中，其被称为光辐射，光照疗法或光动力疗法(Jori等(eds.)，PH0T0DYNAMICTHERAPYOFT腦RSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985);vandenBergh，Chem.Britain22:430(1986))。此外，单克隆抗体还可与光活化的染料偶联以实施光治疗。Mew等，J.Immunol.130:1473(1983);idem.,CancerRes.45:4380(1985);Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:8744(1986);idem.，Photochem.Photobiol.46:83(1987);Hasan等，Prog.Clin.Biolres.288:471(1989);Tatsuta等，LasersSurg.Med.9:422(1989);Pelegrin等，Cancer67:2529(1991)。然而，这些早期的研究未包括内窥镜疗法的使用，特别是抗体片段或亚片段的使用。因此，本发明涉及含光活化剂或染料的免疫缀合物的治疗用途。本发明还预期了造影剂如MRI造影剂，顺磁来自和超声增强剂。例如钆离子、镧离子、锰离子或其它可比的标记物，CT造影剂，和超声造影剂适用于本发明。在一个优选的实施方案中，超声增强剂是包括人源化RS7IgG或其片段的脂质体。同样优选地，脂质体被气体填充。为了治疗的目的，将本发明的RS7抗体及其片段以治疗有效量施用于病人。如果所施用的量具有生理学上的显著意义，则抗体被称为以"治疗有效量，，进行施用。如果一种药剂的存在导致受体哺乳动物生理学上可检测的变化，则该药剂具有生理学上的显著意义。体外诊断本发明涉及RS7抗体，包括RS7和hRS7抗体及其片段，用于体外检测生物样品的RS7抗原存在的用途。在所述免疫测定中，RS7抗体可用在液相中或与固相载体结合，如下述。同样，参见Stein等(1993)，如上，和Stein等，CancerRes.49:32(1989)，期全文引入作为参考。测定生物样品释放包含RS7抗原的检测方法的一个实例是放射免疫测定(RIA)。例如在RIA的一个形式中，将测试物在存在放射性标记的RS7抗原的情况下与RS7抗原混合。在该方法中，测试物浓度将与结合Mab的标记的RS7抗原的量成反比并直接相关于游离标记的RS7抗原的量。其它适用的检测方法对本领域技术人员是显而易见的。或者，可实施包含与固相载体结合的RS7抗原结合蛋白的体外测定。例如可将Mab连接于聚合物，如氨基葡聚糖，以便将Mab连至不溶性支持物如多聚物包被的珠、平板或管。其它适用的体外测定法对本领域技术人员是显而易见的。可检测地标记的RS7抗原结合蛋白和RS7抗原的具体浓度，孵育温度和时间，已经其它测定条件可根据包含样品中的RS7抗原浓度，样品的性质等的多种因素而改变。RS7抗原结合蛋白样品的结合活性可根据熟知的方法进行测定。本领域技术人员通过使用常规实验将能确定用于每一测定的操作性和最佳的条件。根据习惯或特定环境需要，可将其它如洗涤，搅拌，震荡，过滤等的步骤加入测定法。可使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定生物样品中RS7抗原的存在。在直接竟争性ELISA中，将纯的或半纯的抗原制剂结合于在液体或欲检测的细胞提取物中不溶解的固体支持物然后加入一定量的可检测:^也标i己的可溶性抗体以4更检测和/或定量固相抗原和标i己的抗体间形成的二元复合物。相反地，"双决定子"ELISA，还已知为"两位点ELISA"或"三明治测定法"，需要少量抗原且该测定法不需要抗原的大量纯化。因此，用于检测临床样品中抗原的直接竟争性ELISA优选双决定子ELISA。例如参见"theuseofthedouble-determinantELISAforquantitationoftheC-MYConcoproteninbiopsyspecimens"，Field等，Oncogene4._1463(1989);Spandidos等，AnticancerRes.9。821(1989)。在双决定子ELISA中，将一定量的未标记的MAb或抗体片段("俘获抗体")结合于固体支持物，将测试样品与俘获抗体接触，然后加入一定量的可检测地标记的可溶性抗体(抗体片段)以便检测和/或定量抗体，抗原，和标记的抗体之间形成的三元复合物。抗体片段是抗体的部分如F()2，F(ab)2，Fab'，Fab等。在本文中，抗体片段是与RS7抗原的表位结合的RS7Mab的部分。术语"抗体片段"还包括任何合成的或遗传工程化处理的通过与特定抗原结合形成复合物而以类似抗体的方式发挥作用的蛋白。例如抗体片段包括包含轻链可变区，含有重或轻链的可变区的"Fv"片段，和重组单链多肽分子，其中轻链和重链可变区经由肽连接子相连，的分离的片段。抗体融合蛋白是包含至少两种基本上单特异性抗体或抗体片段的多特异性抗体组合物，其中至少两种抗体或抗体片段与RS7抗原不同的表位结合。RS7融合蛋白还包括抗体融合蛋白与诊断剂或治疗剂的缀合物。术语RS7抗体包括人源化，嵌合，人和鼠抗体，其抗体片段，免疫缀合物及其片段和抗体融合蛋白及其片段。实施双决定子ELISA的方法是熟知的。例如参见Field等，如上，Spandidos等，如上，和Moore等，"Twin-SiteELISAsforfosandmycOncoproteinsUsingtheAMPAKSystem",METHOSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.10，273-281页(TheHumanaPress,Inc.1992)。例如在一种使用双决定子ELISA检测RS7抗原的方法中，就来自活组织样品的细组织糜冻干然后在含有l%nonidet-p40(NP40),0.6nl/ml抑酞酶，0.2mM苯基曱基磺酰氟，0.lfig/ml亮肽酶素和1mMEDTA的裂解緩冲液(100mMNaCl，50mMTris-HCl，pH7.4)中以10~20mg组织(湿干)/500nl溶液的浓度重悬。悬液于冰上孵育60分钟，然后对其进行约6次10-秒间隔的声波处理。通过离心除去不溶性物质。就可溶性提取物加入微量滴定板的含有吸收的RS7抗原Mab作为俘获抗体的孔中。然后通过已经与碱性磷酸酶偶联的第二RS7抗原MAb识别俘获的RS7抗原。结合的碱性磷酸酶的量，与提取物中RS7抗原的比例，可采用显色底物如对硝基苯基磷酸酯以颜色计量的方法进4亍检测。或者，可采用辣根过氧化物酶实施用于RS7抗原的双决定子ELISA。样品制备和双决定子ELISA的其它变化可由本领域^支术人员根据例行实验进行设计。在双决定子ELISA中，可溶性抗体或抗体片段必须与和被俘获抗体识别的表位不同的RS7表位结合。例如可溶性抗体可以是RS7MAb，而俘获抗体可以是MR23。或者，可溶性抗体可以是MR23，而俘获抗体可以是RS7MAb。可实施双决定子ELISA以^更确定RS7抗原是否存在于活组织样品中。或者，可实施该分析以便定量存在于体液的临床样品中的RS7抗原的量。可通过包括稀释纯化的RS7抗原而实施定量分析。下面描述了纯化RS7抗原的方法。本发明的RS7MAb及其片段还适用于检测试剂盒的制剂。所述试剂盒可包含被区分为紧密接受的一个或多个容器工具如瓶，管等的载体，每个所述容器工具包含免疫测定的各元件。例如可有一个含有固定在固相支持物上的俘获抗体的容器工具，和另一个含有溶液中可检测地标记的抗体的容器工具。另一个容器工具可包括含有系列稀释RS7抗原的标准溶液。RS7抗原的标准溶液可用于产生标准曲线，其中RS7抗原的浓度标绘于横坐标而和检测信号位于纵坐标。从含有RS7抗原的样品获得的结果可以从所述曲线中以内插值替换从而给出生物样品中RS7抗原的浓度。本发明的RS7抗体及其片段还可用于检测从免疫组织化学样品制备的切片中RS7抗原的存在。所述原位检测可用于确定RS7抗原的存在和用于确定RS7抗原在受试组织中的分布。原位检测可通过将可检测地-标记的RS7抗原结合蛋白用于对冷冻样品切片的而实施。研究显示RS7抗原不能在石蜡包埋的切片中保存。Stein等(1993)，如上。原位检测的一般技术是本领域技术人员熟知的。例如参见Ponder，"CellMarkingTechniquesandTheirApplication",MAMMALIANDEVELOPMENT:APRACTICALAPPROACH中113-38Monk(ed.)(IRLPress1987)，和Coligan5.8.1-5.8.8页。还可参见Stein等(1989)，如上，和Stein等(1993)，如上。RS7抗体及其片段可用任何适宜的检测剂例如放射性同位素，酶，焚光标记，化学发光标记，生物发光标记和顺磁标记进行可检测地标记。制备和检测所述可检测地-标记的RS7抗原结合蛋白的方法是本领域技术人员熟知的，并在下面给出更详细的描述。标记物部分可以是通过使用y计数器或闪烁计数器或放射自显影的方式而检测的放射性同位素。在一个优选的实施方案中，诊断缀合物是Y发射性、P发射性或正电子发射性同位素。本说明书中的标记物部分涉及在预先确定的条件下将产生信号的分子。标记物部分的实例包括放射性同位素，酶，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记和顺磁标记。如本说明书所使用的，诊断剂或治疗剂与抗体结合从而产生能用于诊断和治疗的缀合物的分子和原子。诊断剂或治疗剂的实例包括药物，毒素，螯合剂，染料，发色团，硼化合物和标记物部分。特别适用于本发明目的的同位素是311，131I，31S，14C，和优选的1251。其它放射性核素的实例是，例如"Y，mInN，99mTc，186Re,188Re，'"Lu，67Cu，2'2Bi，213Bi，和"lt。其它放射性核素也可用作诊断剂和治疗剂。适用的诊断性成〗象的同位素通常为25~4，000keV，而适用的治疗性放射性核素通常为60-700keV。本发明的RS7抗体及其片段还可用荧光化合物进行标记。通过将RS7抗原结合蛋白暴露于适宜波长的光下和检测生产的荧光来确定焚光标记的Mab的存在。萸光标记化合物包括异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二曱醛和荧胺。荧光标记的RS7抗原结合蛋白特别适用于流式细胞术。或者，将RS7抗原结合蛋白与化学发光化合物偶联而就RS7抗体及其片段进行可检测的标记。通过检测在化学反应中产生的发光来确定化学发光标记的Mab的存在。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺，异氨基苯二酰肼，芳香族吖啶酯，咪唑，吖啶酯盐和草酸酯。相似地，生物发光化合物可用于标记本发明的RS7抗体及其片段。生物发光是一类在生物系统中发现的生物发光物，其中催化蛋白增加化学发光反应的效能。通过检测发光来确定生物发光蛋白的存在。用于标记的生物发光化合物包括萤光素，萤光素酶和水母素。或者，RS7抗体及其片段通过将RS7抗体与酶连接而被可检测的标记。当RS7抗体-酶缀合物在存在适宜底物的情况下孵育时，酶部分与地物反应从而产生可被检测的化学部分，例如被光镨光度测量、荧光计或视觉工具检测。可用于可检测地标记RS7抗体的酶的实例包括苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，5-V-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，a-磷酸甘油脱氢酶，磷酸丙糖异构酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，门冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，p-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，过氧化氢酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶，葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。RS7抗体，融合蛋白，及其片段还可用顺磁性离子标记为了体内诊断的目的。特别适用于磁共振成像的造影剂包括Gd、Mn、Dy或Fe离子。RS7抗体及其片段还可与超声造影剂/增强剂结合。例如超声造影剂是包含人源化RS7IgG或其片段的脂质体。更优选地，超声造影剂是被气体填充的脂质体。在相关静脉中，双特异性抗体可与造影剂缀合。例如双特异性抗体可包括多于一种用于超声成像的影像-增强剂。在一个优选的实施方案中，造影剂是脂质体。优选地，脂质体包括与脂质体外层面共价结合的二价DTPA-肽。更优选地，脂质体被气体填充。本领域技术人员将可知晓其它可根据本发明应用的适用的标记。记物部分与RS7抗体的结合可采用本领域已知的标准方法实施。与其有关的典型方法描述于Kennedy等，CIin.Chim.Acta70:1(1976),Schurs等，Clin.Chim.Acta81:1(1977),Shih等，Int'1J.Cancer46:1101(1990)，Stein等(1990)，如上，和Stein等(1993)，如上。同样，一般参见，Coligan。上述体外和原位检测方法可用于辅助病理装体的诊断和分期。例如所述方法可用于检测表达RS7抗原的肺瘤，包括肺，乳腺，膀胱，卵巢，子宫，胃和前列腺的肿瘤。体内诊断本发明还预期了RS7抗体在体内诊断中的用途。使用放射性标记的Mab的诊断性成像的方法是众所周知的。在免疫闪烁成像术中，例如用y发射性同位素标记抗体并导入患者。使用y照相机检测y放射性同位素的定位和分布。例如参见Srivastava(ed.)，RADIOLABELED誦OC固ALANTIBODIESFORIMAGINGANDTHERAPY(PlenumPress1988)，Chase,"MedicalApplicationsofAadioisotopes"，在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition,Ge纖ro等(eds.)中，624-652页(MackPublishingCo.，1990)，和Brown，"ClinicalUseofM議oclonalAntibodies",BIOTECHNOLOGY和PHARMACY227-49，Pezzuto等(eds.)(Chapman&Hall1993)。为了诊断性成像，放射性同位素可与RS7抗体或直接地，或使用媒介官能团间接地结合。适用的媒介官能团包括螯合剂如乙二胺四醋酸和二亚乙基三胺五乙酸。例如参见Shih等，如上，和美国专利5,057，313。经由选择最小半衰期，体内的最少保留和能允许检测和准确测定的同位素的最低量最佳组合的同位素而将递送给患者的辐射剂量保持尽可能低的水平。放射性同位素可与RS7抗体结合并适宜于诊断成像的实例包括^TC和"'In。药学上适用的赋形剂可使用额外的药学方法控制RS7抗体在治疗应用中的作用时间。通过使用聚合物来复合或吸收RS7抗体可制成控释剂。例如生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology10:1446(1992)。Sherwood等，BiolTechnology10:1446(1992)。RS7抗体从所述基质中释放的速率取决于RS7抗体的分子量、基质内RS7抗体的量和分散的颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，如上。其它固体剂型描述于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THed.(1990)中。将被递送给个体的人源化，嵌合和人RS7抗体可仅包含mAb，免疫缀合物，抗体融合蛋白或可包含一种或多种药学上适用的赋形剂，一种或多种附加成分，或这些的某些组合。本发明的免疫缀合物、棵抗体、融合蛋白及其片段可按已知方法配方制成药学上有用的组合物，由此免疫缀合物或棵抗体和药学上适用的赋形剂在混合物中组合。磷酸盐緩冲无菌盐水是药学上适用的赋形剂的一个实例。其它适用的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如参见Ansel等PHARMACEUTICALDOSAGEFORMS和药物DELIVERYSYSTEMS,5THEditionUea&Febiger1990)，和GENNAR0(ed.)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition(MackPublishingCompany1990)和其修订版。本发明的免疫缀合物或棵抗体可被配制成借助，例如弹丸注射或连续输注的静脉内给药。用于注射的配方可以是单位剂型，例如安瓿中或多剂量容器中，和附加的保存剂。组合物可采用所述剂型如在油性或水性在中的悬液，溶液或乳液，并可包含配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，使用前，活性成分可以是在用于与适宜的载体，例如无热原灭菌水组成的粉剂形式。可使用额外的药学方法控制治疗性或诊断性缀合物或棵抗体的作用时间。通过使用聚合物来复合或吸收免疫缀合物或棵抗体可制成控释剂。例如生物相容性聚合物包括聚(乙烯-共聚-乙酸乙烯酯)基质和硬脂酸二聚物和癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology10:1446(1992)。免疫缀合物或抗体从所述基质中释放的速率取决于免疫缀合物或抗体的分子量、基质内免疫缀合物，抗体的量和分散的颗粒的大小。Saltzman等，Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等，如上。其它固体剂型描述于Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSAND药物DELIVERYSYSTEMS,5THEdition(Lea&Febiger1990)和Ge纖ro(ed.),REMINGT0『SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEdition(MackPublishingCompany1990)和其修订版中。免疫缀合物，抗体融合蛋白，棵抗体及其片段还可采取皮下或甚至是其它胃肠外途径而施用于哺乳动物。在一个优选的实施方案中，将抗-EGP-l抗体或其片段以10-2000毫克蛋白/每剂的剂量进行施用。而且，可采取连续输注，或单次或多次快速浓注进行施用。通常，免疫缀合物，融合蛋白或棵抗体对人的施用剂量根据诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和既往医学史等因素而改变。典型地，合乎需要的是将免疫缀合物，抗体融合蛋白或棵抗体以剂量约1mg/kg-20mg/kg，单次静脉内输注提供给受者，但也可以根据环境需要施用较低或较高的剂量。该剂量可按需重复施用，例如一周一次持续4~10周，优选一周一次持续8周，更优选地，一周一次持续4周。其还可以以较低频率给予，如隔周一次持续数月。剂量可用多种胃肠外途径给予，可对剂量和方案进行适宜的调整。本发明的RS7抗体可按已知方法配制成药学上有用的组合物，由此RS7抗体和药学上适用的赋形剂在混合物中组合。如果组合物的施用可被接受治疗的患者耐受，则这种组合就被称为"药学上可用的载体，，。无菌磷酸盐-緩冲盐水是药学上适用的赋形剂的一个实例。其它适用的赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如参见REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,18THEd.(1990)。为了治疗的目的，将免疫缀合物、融合蛋白或棵抗体以治疗有效量施用于哺乳动物。本发明所针对的适宜个体一般是人类，但非人类的动物个体也是可预期的。如果所施用的量是生理学上显著的，则抗体制剂被称为以"治疗有效量，，进行施用。如果一种药剂的存在导致受体哺乳动物生理学上可检测的变化，则该药剂就是生理学上的显著的。对本领域技术人员来说，可对本发明的组合物和方法作出多种修饰和改变是显而易见的。因此，应当理解本发明涵盖了所述修饰和改变，只要其落在所附权利要求和其等效形式的范围之内。上面所引用的所有出版物，专利和专利申请均以其全部引入此处作为参考，其全文引入的程度与若将其单独引入作为参考时的程度相同。下述实施例是对本发明实施方案的说明，而并非在任何形式上用于限制权利要求的范围。实施例1.构建嵌合RS7抗体RS7Vk和VH基因的分子克隆从产生RS7的杂交瘤细胞中制备总细胞质RNA和mRNA。采用RT-PCR和5'RACE克隆编码Vic和VH序列的基因然后用DNA测序法确定序列。对多个克隆测序以消除由PCR反应导致的可能误差。序列分析显示存在两个Vk(#1和#23)和一个VH(RS7VH)转录物。联合各潜在鼠VK与VH，生成两个含有人恒定区的嵌合Ab(cAb)，然后通过转染将其在Sp2/0细胞中表达。通过用ELISA筛选转染的细胞克隆的细胞培养物上清液从而鉴定产生cAb的克隆。扩大阳性克隆然后从细胞培养物上清中纯化cAb。Ag-结合测定显示cAb由Vk#23和VH组成，cAb-vk井23结合在用ME180，人颈癌细胞(ATCC，Rockville，MD)的粗制膜部分包#_的微孔上(图1)。cAb联合Vk#1和VH,cAb-Vk#1未显示出与Ag-包被的孔结合。因此，将免疫反应的cAb(含有Vk23)命名为cRS7。将作为PCR产物的克隆的鼠VH和功能性Vk(#23)序列产物分别命名为RS7Vk(图2A)和RS7VH(图2B)。RS7Ab结合活性检测将竟争性ELISA结合测定用于评价工程化处理的cRS7的结合亲和力。简言之，将恒量的生物素化鼠RS7与变化浓度(0.01~10(Hig/ml)的检测Ab(RS7或cRS7)混合，然后加至Ag-包被的微孔，然后在室温下孵育l小时。洗涤后，加入HRP缀合的链霉抗生物素蛋白然后然后在室温下孵育1小时。在加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐和0.04%H2(L的底物溶液后通过读取OD"。而显示出HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白与Ag-结合的生物素化RS7结合的量。通过该类竟争性Ag-结合检测，显示出cRS7和鼠RS7对生物素化鼠RS7与抗原包被孔的结合的竟争完全相同，因此证实了所获得的Vk和VH序列的可靠性(图.l)。实施例2.hRS7抗体的构建方法hRS7V基因的序列设计通过研究Kabat数据库中人VK和VH序列，发现RS7Vk和VH的FRs分别表现出与人SA-lA'clVk和RF-TS3VH高度的序列同一性。一个例外是RS7VH的FR4，其显示出与NEWMVH最高的同一性。因此将人SA-lA'cl框架序列用作移植RS7Vk的CDR的支架(图3A)，并将RF-TS3和NEWM框架序列联合用于RS7Vh(图4)。当与起始人抗体框架比较时，在每个链CDR区外都存在大量的氨基酸改变。鼠FR中側接潜在CDR的某些氨基酸残基保留在基于由Qu,Z.，Losman，M.J.，Eliassen，K.C.，Hansen,H.J.，Goldenberg，D.M.，和Leung，S.0.(1999)Humanzizationofmmu31，alpha-fetoprotein-specificantibody。Clin.CancerRes.5，3095s-3100s在先建立的指导而重建的hRS7Fv中。这些残基是S20,D60，V85，和RS7Vk和K38的AIOO，RS7VH的K46，A78和F91(图3A和3B)。hRS7V序列的构建Leung等Leung，S.0.，Shevitz，J.，Pellegrini,M.C.，Dion,A.S.，Shih，L.B.，Goldenberg，D.M.，和Hansen,H.J.(1994)Chimerizationof1X2arapidlyinternalizingantibodyspecificforBcelllymphoma.Hybridoma，13:469-476)公开了一种修饰策略，采用如图4所示的长寡核苷酸合成和PCR，将该策略用于构建为hRS7所-没计的VL和VH基因。为了构建hRS7VH区，两个长寡核苦酸，hRS7VHA(176-MER)和hRS7濯(168-MER)在自动化DNA合成仪(AppliedBiosystem)上合成。hRS7VHA代表hRS7VH区的23~198nt5,-GGTCTGAGTTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTTAAATGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATACTGATGACTTCAAGGGA-3，hRS7VHB代表与174~340nt互补的hRS7VH区的负链。5'-ACCCTTGGCCCCAGACATCGAAGTACCAGTAGCTACTACCGAACCCCCCTCTTGCACAGAAATACACGGCAGTGTCGTCAGCCTTTAGGCTGCTGATCTGGAGATATGCCGTGCTGACAGAGGTGTCCAAGGAGAAGGCAAACCGTCCCTTGAAGTCATCAGTATATG-3'hRS7VHA和B的3，末端序列(23nt残基)彼此互补。在所述PCR条件下，hRS7VHA和B3'-末端退火而形成由长寡核苷酸的剩余部分所侧接的短双链DM。每个退火的末端均作为单链DNA转录的引物，结果得到包含hRS7VH的23~340nt的双链DNA。该DNA在存在两个短寡核苷酸，hRS7VHBACK和hRS7VHF0R下进一步扩增以形成全长hRS7VH。hRS7VHBACK5，-GTGGTGCTGCAGCAATCTGGGTCTGAGTTGAAGAAGCC-3，hRS7VHF0R5，-TGAGGAGACGGTGACCAGGGACCCTTGGCCCCAGACAT-3，以10nl10xPCR緩冲液(500mMKC1，100mMTris.HCL緩冲液，pH8.3，15mMMgCL)，2,1hLLl濯ACK和hLLlVHFOR,和2.5单位TaqDNA聚合酶(PerkinElmerCetus，Norwalk，Ct)扩增hRS7VHA和B的最小量(经验确定的)。将该反应混合物进行3个循环的PCR反应94。C变性l分钟，45X:退火l分钟，和72X:聚合1.5分钟，然后进行27个循环的PCR反应94X:变性l分钟，55'C退火1分钟，和72"C聚合1分钟。凝胶纯化hRS7VH的双链PCR-扩增的产物，用Pstl和BstEII限制性酶切然后克隆至重链staging载体，VHpBS2的互补Pstl/BstEI1位点。为构建人源化VK序列的全长DNA，如上述合成hRS7VKA(156-mer)和hRS7VKB(155-mer)。通过上述短寡核苦酸hRS7VKBACK和hRS7VKF0R扩增hRS7VKA和B。hRS7VKA代表證S7Vk区的20-175nt。5，-CTCCATCCTCCCTCTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCAGCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTGAGTATTGCTGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACTCGGCATCCTACCGGTACACTGGAGTCC-3,hRS7VKB代表与155-320nt互补的hRS7VK区的负链。5，-CCTTGGTCCCAGCACCGAACGTGAGCGGAGTAATATAATGTTGCTGACAGTAATAAACTGCAAAATCTTCAGGTTGCAGACTGCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTATCAGGGACTCCAGTGTACCGGTAG-3'hRS7VKBACK5，-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTG-3，hRS7VKFOR5，-ACGTTAGATCTCCACCTTGGTCCCAGCACCG-3'凝胶纯化hRS7VK的双链PCR-扩增的产物，用PvuII和BGLIII限制性酶切然后克隆至轻链staging载体，VKpBR2的PvuI/BcII的互才卜位,泉。通过将HRS7Vk和VH的XBAI-BAMHI和XhoI/BamHI片段分另'J次序亚克隆至pdHL2如上述而构建最终的表达载体。hRS7抗体的转染和表达将约30pg的用于hRS7的表达载体通过Sail酶切消化而线性化然后用电穿孔(450V和25PF)转染至SP2/0-AGL4细胞。将转染的细胞铺于96-孔板2日然后通过加入MTX至终浓度为0.025jiM而选择药物抗性。MTX-抗性集落在2-3周内出现于孔中。用ELISA测试法检测来自存活于用于筛选人Ab分泌的选择的克隆的上清。简言之，将100nl上清样品加入用GAH-IgG，F(ab')2片段-特异性Ab预包被的ELISA微量滴定板上，然后孵育l小时。用洗涤緩冲液(含O.05%聚山梨醇酯20的PBS)洗板三次以除去未结合的蛋白质。将HRP-结合的GAH-IgG，Fc片段-特异性Ab加入孔。在孵育1h后，洗涤平板。在加入含有4mM0PD和0.04%H202的底物溶液后通过读取A憎而显示结合HRP-结合。扩展阳性细胞克隆然后通过A蛋白柱亲和层析从细胞培养物上清中纯化hRS7IgG。人源化RS7抗体的结合活性使用ME180细胞膜提取物包被平板将ELISA竟争性结合测定用于评价hRS7的免疫反应性如所述(Stein等，Int.J.Cancer55:938-946(1993))。ME180细胞膜部分通过声裂法和离心制备。通过离心用粗制膜提取物包被96孔平底PVC板然后用0.1%戊二醛固定。将恒量的生物素化鼠RS7与变化浓度的mRS7，cRS7或hRS7混合，然后加至包被的微孔，然后在室温下孵育l小时。洗涤后，加入HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白，然后在室温下孵育l小时。在加入含有4mM邻苯二胺二盐酸盐和0.04%H202的底物溶液后通过读取A"。而显示与膜结合的生物素化mRS7结合的HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白的量。如图6中的竟争性分析所示，hRS7IgG表现出与mRS7和cRS7相当的结合活性，证实了RS7的结合亲和力在人源化中得以保存。实施例3.使用残留性标记物的人源化RS7的放射性碘标记残留性部分(IMP-R4，IMP-R5或IMP-R8)进4亍放射性碘标记，并与二硫化物还原的hRS7按别处所述方法偶联(GovindanSV，等.BioconjugateChem.1999;10:231-240)。参见图9。在残留性放射性硪标记中，使用1251，制备'"I-IMP-Rx-hRS7其中x=4，5或8)，分别使用IMP-R4，IMP-R5和IMP-R8获得总产率和比活性(括弧内)的87.1%(3.38mCi/mg)，34.3%(0.97mCi/mg)，和76.6%(2.93mCi/mg)。在大规模1311标记中，使用13'1-IMP-R4体，获得下述结果。使用20.4mCi'3'1，35.7mnolIMP-R4和3.22mgDTT-还原的RS7，获得60°/。总产率(3.80mCi/mg)。使用30.3mCi1311，IMP-R4和还原的hRS7另一操作得到69.7%产率(3.88mCi/mg)。13.97mCi'311的第三次操作得到71.8%掺合度(4.42mCi/mg)。用13.6mCi'3'1和非特异性人源化抗体，hLL2标记的'3'I-IMP-R4得到64.4%产率(3.67mCi/mg)。实施例4.乳癌动物模型中的临床前实验为了肿瘤靶向实验，通过皮下注射约2.3xl(T个培养的MDA-MB-468细胞在5~8周龄雌性棵鼠中繁殖肿瘤，在1个月后，当肿瘤大小达到~0.1至~0.2cm3时使用动物。对小鼠静脉注射-10fiCi1251-[IMP-Rx]-hRS7其中x=4、5或8,和20-25jiCi1311-Mab(CT法)。因此，每个实验都是用1251广'I配对标记的实验。在所示时间，测定多种器官和血液中的生物分布，然后表示为。/。注射剂量/g。在确定'251生物分布时，校正'"I反散射入'"I窗的量。为治疗研究，研究多种形式下的肿瘤生长模式以便确定用于肿瘤稳定生长的最佳方法。总结出肿瘤生长约8-周后用于靶向实验的方法是最佳的，并30-50"/。的动物可根据肿瘤生长模式而使用。为治疗研究，对带有肿瘤的动物静脉注射是检测药剂的131I_IMPR4-hRS7,并与直接放射性碘化的物质l31I-hRS7进行比较。将基线体重与每周检测的体重和肿瘤体积比较。当肿瘤达到3cm3时处死动物。根据IACUC-批准的方法实施所有动物实验。动物体内生物分布在NIHSwiss棵鼠的生长的胂瘤中使用双-标记的hRS7制剂(1251-IMP-Rx-hRS7其中x=4、5或8，每个试剂与直接标记131I-hRS7混合)实施这些实验。表1A，1B和1C描述了具体的生物分布显示出使用残留性标记具有非常好的表现。例如'"I-IMP-IMP-R4-RS7,'25I-IMP-R5-hRS7和'"I-IMP-R8-hRS7在第7日的°/。注射剂量/每克肺瘤分别是41.6±3.0%，32.2±11.6%和24.7±8.5%，而对于直接标记的131I-HRS7在各双-标记的实验中相同时间点为5.9±0.9%,6.2±2.1%和6.7±2.3%。在相同时间点，肿瘤-比-非肺瘤的比率是125I-IMP-R4-hRS71.7-7.6倍，125I_IMP-R5-hRS71.7~6.0倍和'25I-IMP-R8-hRS72.04.8倍高于"'I-hRS7(数据未显示)。表1.用'25I_IMP-R(R4或R5或R8)和"'I-hRST(CT法)双_标记的人源化RS7在载有MDA-MB-468肿瘤异种移植物的NIHSwiss棵鼠中的生物分布<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表1C:'"I-IMP-R8-hRS7对131I-hRS7(CT法)<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>放射量测定计算，根据生物分布使用1251替换'311，使用Siegel，JA和Stabin，MG(JournalofNuclearMedicine1994;35:152-156)的方法实施。表-2比较了残留性和常规放射性捵标记，而图10用图形描述了数据。发现所有残留性药剂以递送给肿瘤剂量和肿瘤-比-非肿瘤比例的方式表现最佳；考虑到有益放射化学产生和相同药剂可获得的比活性而选择13'I-IMP-R4-HRS7用于治疗实验。表2:在MDA-MB-468肿瘤模型中由于变化放射性碘化的hRS7而计算的辐射剂<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>棵鼠中MDA-MB-468人乳癌异种移植物的治疗最大耐受剂量(MTD):从剂量确定数据(表-2，1组)中，131I-IMP-R4-hRS7和'3'I-hRS7的mCi量，对血液产生辐射剂量1500cGy(估计的MTD)分别计算为0.231mCi和0.285mCi。在Swiss棵鼠中采用增加的每个药剂的剂量实施MTD的实验确定。对于'31I-IMP-R4-HRS7，给予动物组200，225，250，275，300和325jiCij250jiCi的剂量组的5只动物中的1只在4个月后死亡，而300fiCi的剂量组的4只动物中的3只在2周~4周间死亡。虽然275和325fiCi的剂量组中的动物在第5周均存活是未料到的，我们仍总结了231jiCi(从剂量确定数据中计算的)和250nCi给药剂量组间的MTD。对于131I-HRS7(基于"CT"的放射性碘标记)，用250，280，310，340,370和彻nCi注射动物组；2周-3周间，340pCi剂量组的6只动物中的6只，370pCi剂量组的6只动物中的3只，和400^Ci剂量组的4只动物中的4只死亡。才艮据这些，将MTD设为280-310^Ci。治疗研究-1对于该用于将'311-IMP-R4-hRS7的效能与131I-hRS7(CT法)的效能相比较的第一治疗实验，每种试剂使用其最大耐受剂量的~70%。单剂175nCi残留性试剂显示出效能显著高于200pCi的常规放射性碘剂。在该包括未治疗对照的实验中，每组使用lO或ll只动物，全部三组为随机分组以便使其起始肿瘤大小非常相似。在治疗前(第2曰)三个组的平均肿瘤体积为0.312±0.181，0.308±0.203和0.303土0.212。在该实验中，第49日的过渡数据显示于图-11下方。图-11中上方的图显示了每组中各动物的肿瘤体积(CM3)，而下方的图显示了两种格式的平均肿瘤体积。未治疗组中死亡三只动物。残留性标记组的肺瘤生长控制要显著好于传统标记和未治疗组，如对平均肿瘤体积(MTV)直至49日的曲线下面积(AUC)的student-t检验所测定的。在49日，由于用'311-IMP-R4-hRS7治疗，MTV的AUC出现的显著性差异(p值)，括弧内给出治疗前(第2日)各肿瘤体积差异p值，如下。对于未治疗0.05(0.78);对于'311—hRS7(CT):0.03(0.98);对于131I-hRS7(CT)对未治疗0.14(0.81)。在49日，平均肺瘤体积在常规的和残留性放射性碘组间出现持续的离散，后一组导致持续的降低。在治疗后8-周，在用'3'1-IMP-R4-hRS7治疗的组中11只小鼠中5只完全緩解，MTV为起始值的20。/。。未治疗的和13'1-hRS7-治疗的小鼠在8周的MTV分别为各起始值的280%和163%，131I-hRS7组中11只小鼠中1只完全緩解。治疗被良好耐受。IMP-R4组在第2日时的平均体重为21.93±2.03和而在第49日时为23.68±1.81;对于"CT，，组，平均体重在第2日和49日分别为21.77±2.21和23.90±2.64。治疗组的骨髓中毒性，如通过血细胞计数所确定的，显示于图-12中。简言之对于使用131I-IMP-R4-HRS7，在施用药剂1周后对于WBC，淋巴细胞和中性白细胞计数，达到分别为对照水平的34°/。，7%和61%的最低值。在第5周，这些分别恢复到对照水平的74%,58°/。和92%，并在第49日保持在对照水平的45%，36%和51%;而对于131I-hRS7(CT):在施用药剂l周后对于WBC，淋巴细胞和中性白细胞计数，达到分别为对照水平的41%,13%和67%的最低值。在第5周，这些分别恢复到对照水平的85%,67%和103%，并在第49日保持在对照水平的42%,32%和49°/。。治疗研究-2在MDA-MB-468肿瘤模型中使用131I-IMP-R4-hRS7的RAIT的特异性将"'I-IMP-R4-hRS7的效能与非特异性用'3'1-IMP-R4标记的对照人源化抗体，hLL2(抗-CD-22MAb)的效能进行比较。在该实验中，施用175fiCi的各试剂。这代表mI-IMP-R4-hRS7最大耐受剂量的~70%。在该包括未治疗的对照的实验中，每组使用7~8只动物，如治疗实验1参照起始肿瘤体积分布而随机分组。图13，显示了三个组的相对平均肿瘤体积(MTV)(治疗前MTV:IOO)，显示出特异性的生长调节。实施例5.用Y-90人源化RS7mAb和棵人源化RS7mAb治疗乳癌患者某女，56岁，有乳腺癌复发史，表现为颈部淋巴结和左侧肺转移的。该患者在化疗和激素治疗后复发两次。该患者随后接受了两次治疗性注射(间隔2周)Y-90-缀合的人源化RS7mAbi.v.，每次的剂量为抗体蛋白剂量IOOmg中20mCiY-90。治疗后四周，该患者白血细胞和血小板计数降低了约50%，但在治疗后9周恢复。在治疗后12周的再肿瘤分类，计算机断层摄影检测到肺和淋巴结转移降低30%。此后，该患者接受了4次一周一次的输注(每次超过3小时)被良好耐受的棵人源化RS7，除了某些短暂的僵直和寒战，没有对其血液计数或血液化学产生任何不良作用。每次输注的棵抗体为400mg/m2。大约8周后，经由计算机断层摄影的再肿瘤分类显示出在可检测的损害中的额外降低了约20%。在随访检测3个月后，该患者的疾病表现稳定(即，没有表现出附加的或进展性的生长)。序列表〈110〉IMMUNOMEDICS,INC.<120〉RS7抗体<130〉018733/1164<140〉PCT/GB02/00885<141〉2003-03-03<150〉60/360,229〈151〉2002-03-01〈160〉28〈170〉PatentlnVer.2.1〈210〉1<211〉324〈212〉DNA〈213〉Mussp.〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(324)〈400〉1gacattcagctgacccagtctcacaaattcatgtecacateagtagga48AsplieGinLeuThrGinSerHisLysPheMetSerThrSerValGly151015gacagggtcageateacctgcaaggecagtcaggatgtgagtattget96AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530gtagectggtatc幼cagaaaccaggacaatctcctaaaetactgatt144ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinSerProLysLeuLeulie354045tactcggcatectaceggtacactggagtccctgatcgcttcactggc192TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGly505560agtggatctgggacggatttcactttcaccateageagtgtgcagget240SerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrlieSerSerValGinAla65707580gaagacctggcagtttattactgtcagcaacattatattactccgetc288GluAspLeuAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095acgttcThrPheggtGlygetAla100gggGlyaccThr肌gctggagLysLeuGlu105ctgLeuaaaeggLysArg324〈210〉2<211〉108〈212〉PRT〈213〉Mussp.〈■〉2AsplieGinLeuThrGinSerHisLysPheMetSerThrSerValGly151015AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyGinSerProLysLeuLeulie354045TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheThrGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrPheThrlieSerSerValGinAla65707580GluAspLeuAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095ThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLysArg100105〈210〉3<211〉360<212〉腿〈213〉Mussp.〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(360)〈400〉3gtgaagctgcaggagteaggacctgagctgaagaagcctggsg3gaca48ValLysLeuGinGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThr151015gtcaagatetectgcaaggettctggatataccttcacaaactatgga96ValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGly202530atg肪ctgggtgaagcaggetcc3ggaaagggtttaaagtggatgggc144MetAsnTrpValLysGinAlaProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGly354045tggata朋cacctecactggagsgccaacatatactgatgacttcaag192TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPheLys505560ggaeggtttgccttctctttggaaacctctgccaccactgcctatttg240GlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaThrThrAlaTyrLeu65707580cagateaacaacetcaaaagtgagg￡icatggetacatatttctgtgca288GinlieAsnAsnLeuLysSerGluAspMetAlaThrTyrPheCysAla859095agaggggggttcggtagtagetactggtacttcgatgtctggggccaa336ArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGlyGin100105110gggaccacggtcaccgtctectea360GlyThrThrValThrValSerSer115120〈210〉4〈211〉120〈212〉PRT〈213〉Mussp.<40()〉4ValLysLeuGinGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThr151015ValLyslieSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyrGly202530MetAsnTrpValLysGinAlaProGlyLysGlyLeuLysTrpMetGly354045TrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPheLys505560GlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaThrThrAlaTyrLeu65707580GinlieAsnAsnLeuLysSerGluAspMetAlaThrTyrPheCysAla859095ArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGlyGin100105110GlyThrThrValThrValSerSer115120<210>5〈211〉106〈212〉PRT〈213〉人类〈400〉5AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrAlaA]aSerSerLeuGinSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinSerTyrSerThrProLeu859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysValGlulie100105<210>6〈211〉119<212〉PRT<213〉人类〈400〉6ValGinLeuValGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAlaSer151015ValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyrAla202530MetAsnTrpValArgGinAlaProGlyGinGlyLeuGluTrpMetGly354045TrplieAsnThrAsnThrGlyAsnProThrTyrAlaGinGlyPheThr505560GlyArgPheValPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyrLeu65707580GinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgGluAspSerAsnGlyTyrLysliePheAspTyrTrpGlyGinGly100105110SerLeuV'alThrValSerSer115〈210〉7〈211〉324〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述人源化hRS7Vk序列〈220>〈221〉CDS〈222〉(1)..(324)〈400〉7gacatecagctgacccagtctccatectecctgtctgcatctgtagga48AsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015gacagagtcageateacctgcaaggccagtcaggatgtgagtattget96AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530gtagcctggtatcagcag犯accagggaaagcccctaagetcctgate144ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045tactcggcatectaceggtacactggagtccctgataggttcagtggc192TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheSerGly505560agtggatctgggacagatttcactetcaccateageagtctgcaacctSerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580240gaagattttgcagtttattactgtcagcaacattatattactccgetcGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095288acgttcThrPheggtGlygetAla100gggaccGlyThrLysgtgValg恥Glu105ateliea肌cgtLysArg324〈210〉8〈211>108<212>PRT〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7Vk氨基酸序列〈400〉8AsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspValSerlieAla202530ValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLysLeuLeulie354045TyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSerLeuGinPro65707580GluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrlieThrProLeu859095ThrPheGlyAlaGlyThrLysValGlulieLysArg100105〈210〉9〈211〉363〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述人源化hRS7VH序列〈220〉〈221〉CDS〈222〉(1)..(363)<400>9caggtccaactgcagcaatctgggtctgagttgaagaagcctggggcc48GinValGinLeuGinGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015teagtgaa.ggtttectgcaaggettctggata.caccttca_ca肌ctat96SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530ggaatgaactgggtgaagcaggcccctggacaagggcttaa_atggatg144GlyMetAsnTrpValLysGinAlaProGlyGinGlyLeuLysTrpMet354045ggctggataaacacetacactggagagccaacatatactgatgacttc192GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPhe505560aagggaeggtttgccttctecttggacacctctgtcageacggcatat240Lys〔;lyArgPheA〗.aPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580etccagateageageetaaaggetgacgacactgccgtgtatttctgt288LeuGinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrPheCys859095gca卿ggggggttcggtagtagetactggtacttcgatgtctggggc336AlaArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGly100105110caagggtecctggtcaccgtctectea363G]nGlySerLeuValThrValSerSer115t20〈210>10〈211〉121〈212〉PRT<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7VH氨基酸序列〈400〉10GinValGinLeuGinGinSerGlySerGluLeuLysLysProGlyAla151015SerValLysValSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrAsnTyr202530GlyMetAsnTrpValLysGinAlaProGlyGinGlyLeuLysTrpMet354045GlyTrplieAsnThrTyrThrGlyGluProThrTyrThrAspAspPhe505560LysGlyArgPheAlaPheSerLeuAspThrSerValSerThrAlaTyr65707580LeuGinlieSerSerLeuLysAlaAspAspThrAlaValTyrPheCys859095AlaArgGlyGlyPheGlySerSerTyrTrpTyrPheAspValTrpGly100105110GinGlySerLeuValThrValSerSer115120<210>11〈211〉702〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述人源化hRS7k序列<220>〈221〉CDS〈222〉(1).(699)〈400〉11atgggatggagetgtsiteateetcttcttggtagcaacagetacaggt48MetGlyTrpSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly151015gtccactecgacatecagctgacccagtctccatectecctgtctgca96ValHisSerAsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAla202530tctgtsggsgsc3g3gtc3gc3tcseetgcMggcc3gtC3gg3tgtg144SerValGlyAspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspVal354045agtattgetgtagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaag192SerlieAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys505560etcctgatetactcggcatectaceggtacactggagtccctgatagg240LeuLeulieTyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArg65707580ttcagtggcagtggatctgggacagatttcactetcaccateageagt288PheSerGlySerGlySer*GlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer859095ctgcaacctgaagattttgcagtttattactgtcagcaacattatatt336LeuGinProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinHisTyrliel()O105110actccgetcacgttcggtgetgggaccaaggtggagateaaacgtact384ThrProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysValGlulieLysArgThr115120125gtggetgcaccatctgtcttcatettcccgccatctgatgagcagttg432ValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeu130135140aaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc480LysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrPro145150155160Eigagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccetccaatcgggt528ArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGly165170175aacteccaggagagtgtcacagagcaggacageaaggacageacctac576AsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyr180185190ageetcageageaccctgacgctgageaaagcagactacgagaaacac624SerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHis195200205aaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagetcgcccgtc672LysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProVal210215220已caa已gagettcaacaggggagagtgttag702ThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys225230〈210〉〈211〉〈212〉〈213〉<220〉〈223〉12233PRT人工序列〈柳〉MetGly1人工序列的描述人源化hRS7k氨基酸序列12TrpSerCyslielieLeuPheLeuValAlaThrAlaThrGly51015ValHisSerAsplieGinLeuThrGinSerProSerSerLeuSerAla202530SerValGlyAspArgValSerlieThrCysLysAlaSerGinAspVal354045SerlieAlaValAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys505560LeuLeulieTyrSerAlaSerTyrArgTyrThrGlyValProAspArg65707580PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSerSer859095LeuGinProGluAspPheAlaValTyrTyrCysGinGinH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工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸<400〉24tgaggagacggtgaccagggacccttggccccagacat38〈210〉25<211>156〈212〉醒〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈■〉25ctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcagcatcacctgcaaggccagtc60aggat,gtgagtattgctgtagcctggtatcagcagaaacc3gggaaagcccctaagctcc120tgatctactcggcatcctaccggtacactggagtcc156〈210〉26〈211〉155<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉26ccttggtcccagcaccgaacgtgagcggagtaatataatgttgctgacagtaataaactg60caaaatcttcaggttgcagactgctgatggtgagagtgaaatctgtcccagatccactgc120cactgaacctatcagggactccagtgtaccggtag155〈210〉27〈211〉37〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400〉27gacattcagctgacccagtctccatcctccctgtctg37〈210〉28〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成寡核苷酸〈400>28acgttagatctccaccttggtcccagcaccg3111权利要求1.嵌合、人源化或人抗-EGP-1抗体或其片段在制备用于治疗其中患病细胞表达EGP-1抗原的疾病的药物中的应用，其中所述抗体或片段是裸抗体或其片段或者与除Rnase之外的治疗剂缀合。2.权利要求1的应用，其中所述抗-EGP-1抗体或其片段是棵抗体或其片段。3.权利要求1的应用，其中所述抗-EGP-l抗体或其片段与除Rnase之外的治疗剂缀合。4.权利要求3的应用，其中所述治疗剂选自药物、毒素、放射性核素、免疫调节剂、激素、酶、生长因子和反义寡核苦酸。5.权利要求4的应用，其中所述毒素是假单胞菌内毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒素、DNaseI、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素或假单胞菌外毒素。6.权利要求4的应用，其中所述免疫调节剂是细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、肺瘤坏死因子(TNF)、造血因子、白细胞介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-21、集落刺激因子、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-a、干扰素-(3、干扰素-y、称为"S1因子，，的干细胞生长因子、促红细胞生成素、血小板生成素或其组合。7.权利要求3的应用，其中所述治疗剂具有选自抗有丝分裂、烷化、抗代谢物、抗血管生成、细胞凋亡、生物碱、抗生素剂及其组合的药理特性。8.权利要求3的应用，其中所述治疗剂选自氮芥类、氮丙啶衍生物、烷基磺酸酯类、亚硝基脲类、三氮烯类、叶酸类似物、蒽环类抗生素、紫杉烷类药、C0X-2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、嘧啶类似物、噤呤类似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素类、铂配位络合物、长春花生物碱、取代的脲类、曱肼衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、拮抗剂、内皮生长抑素、紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿霉素类似物及其组合。9.权利要求4的应用，其中所述放射性核素选自1311、1231、1241、86Y、62Cu、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、90Y、mIn、125I、186Re、188Re、189Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Ag、mAg、197Pt、109Pd、32P、33P、47Sc、153Sm、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、21^1)和223^。10.权利要求l的应用，其中所述抗-EGP-l抗体或其片段是融合蛋白的一部分。11.权利要求10的应用，其中所述融合蛋白包括笫二抗体或其片段或治疗性蛋白或肽。12.权利要求10的应用，其中所述第二抗体或其片段与包含一个或多个半抗原的靶向构建体结合。13.权利要求ll的应用，其中所述第二抗体或其片段与除EGP-l之外的肺瘤相关抗原结合。14.权利要求ll的应用，其中所述肿瘤相关抗原是CD20、CD22、CEA、CSAp、AFP或MUC-1，或者其中所述第二抗体或其片段是hMN-14、Mu-9、Immu31或PAM4。15.权利要求l的应用，其中所述抗-EGP-1抗体或其片段与第二抗体或其片段共价相连。16.权利要求1的应用，其中所述抗-EGP-l抗体或其片段是嵌合、人源化或人RS7抗体或其片段。17.权利要求16的应用，其中所述嵌合、人源化或人RS7抗体或其片段包括RS7抗体轻链可变区CDR1(KASQDVSIAVA，SEQIDNO:28);CDR2(SASYRYT，SEQIDNO:29);和CDR3(QQHYITPLT，SEQIDNO:30)和RS7重链可变区CDR1(NYGMN，SEQIDNO:31);CDR2(WINTYTGEPTYTDDFKG，SEQIDNO:32)和CDR3(GGFGSSYWYFDV，SEQIDNO:33)的互补决定区(CDR)。18.权利要求l的应用，其中所述抗-EGP-l抗体或其片段包括人IgGl恒定区序列。19.权利要求l的应用，其中所述疾病是癌症。20.权利要求l的应用，其中所述癌症是肺、乳腺、膀胱、卵巢、子宫、胃或前列腺的肿瘤。21.权利要求l的应用，其中所述肺肿瘤是鳞状细胞癌或腺癌。22.与治疗剂缀合的嵌合、人源化或人抗-EGP-l抗体或其片段在制备用于治疗其中患病细胞表达EGP-1抗原的疾病的药物中的应用，其中所述抗-EGP-l抗体或其片段包括人IgGl恒定区。23.权利要求22的应用，其中所述治疗剂选自同位素、药物、毒素、免疫调节剂、激素、酶、Rnase、抗体、抗体片段、生长因子、放射性核素和反义寡核苷酸。24.权利要求23的应用，其中所述放射性核素选自1311、1231、1241、86Y、62Cn、64Cu、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、90Y、mIn、125I、186Re、188Re、189Re、177Lu、67Cu、212Bi、213Bi、211At、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Ag、mAg、197Pt、109Pd、32P、33P、47Sc、153Sm、105Rh、142Pr、"3Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、、和2、。25.权利要求23的应用，其中所述Rnase是o歸nase。全文摘要本发明涉及单价和多价的，单特异性结合蛋白和涉及多价的，多特异性结合蛋白。这些结合蛋白的一个实施方案含有一个或多个结合位点，其中每个结合位点与靶抗原或靶抗原上的表位结合。这些结合蛋白的另一实施方案含有两个或多个结合位点，其中每个结合位点具有对靶抗原上不同表位的亲和性或具有对靶抗原或半抗原的亲和性。本发明还涉及用于在宿主中表达这些功能性结合蛋白的重组载体。更具体地，本发明涉及名为RS7的肿瘤相关抗原结合蛋白和其它EGP-1结合蛋白。本发明还涉及人源化，人和嵌合RS7抗原结合蛋白，以及该结合蛋白在诊断和治疗中的用途。文档编号A61K51/10GK101264325SQ20071018516公开日2008年9月17日申请日期2003年3月3日优先权日2002年3月1日发明者D·M·戈登伯格,H·J·汉森,S·戈文丹,Z·屈申请人:免疫医疗公司