专利名称：一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂，通过前列腺素El和锂盐 组合制剂的协同增效作用，诱导热休克蛋白的生成，保护神经细胞，增加细 胞缺氧耐受性，抵抗脑缺血损伤。
背景技术：
脑中风又称脑卒中或脑血管意外，是一组以脑部缺血或出血性损伤症状 为主要临床表现的疾病，主要分为出血性脑中风(脑出血及蛛网膜下腔出血) 和缺血性脑中风(脑梗塞及脑血栓形成)二大类，其中以缺血性脑中风最为 常见。该病发病急，病死率高，是世界上最主要的致死性疾病之一。据统计， 我国每年新发完全性脑中风120-150万人，死亡80-100万人，存活者中约 75%致残，5年复发率高达41%;而美国每年亦有50万人发病，其中15万 人死亡。中风的死亡率和年龄呈正相关，目前我国已ii^老年化社会，其发 病率及对国人的影响将有进一步增加的趋势，因此研究与开发治疗中风尤其 是缺血性脑中风的有效药物是医药界的一个重点课题。
目前对缺血性脑中风尚缺乏有效治疗措施，临床上常见的治疗方法有药 物治疗、导管插入、颈动脉内膜切除等，其中药物治疗是最常见的方法，作 用方式包括溶栓、扩血管或抗血小板聚集等。上述治疗药物的共同特点是 针对性强、作用环节明确、但疗效单一，难以克服缺血性脑中风引起神经细 胞损伤的多种病理学效应，且有不同程度的毒副作用，如溶栓药物4艮难通过 血脑屏障进入受损脑组织发挥作用，因而疗效不肯定，且有引起再灌注损伤 及出血的副作用；扩血管药物可使正常部位血管扩张，造成病变区血液流向 正常脑组织，产生所谓"窃血"现象。因此寻找具有新的作用机理，且疗效 明确、毒副作用小的有效药物是一项亟待探索的工作。
随着近年来对缺血性脑中风引起神经细胞死亡分子机制的探讨，取得了 一些令人瞩目的研究逸艮其中，细胞生存/死亡的重要调节因子一热休克 蛋白具有保护神经细胞，增加细胞缺氧耐受性，抵抗进一步致死性损伤的作 用，引起了人们的广泛重视。
热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs )是一类高度保守的蛋白，广 泛存在于原核生物和真核生物中，在蛋白折叠、转运和代谢中起重要作用。 研究表明，生物体在缺血损伤时，多种HSPs如HSP70、 HSP卯和血红素加 氧酶(hemeoxygenase, HO-l)可被大量诱导产生，参预抑制细胞损伤，调 节细胞生存，因而是治疗脑缺血的重要靶点。
前列腺素El (Prostaglandin El， PGE1，又名前列地尔)是二十碳不饱 和羟基脂肪酸的衍生物，化学结构属于环戊烯酮前列腺素。PGE1的主要作 用是激活腺苷环化酶，升高细胞内3， 5-环腺苷酸(cAMP )浓度，具有扩张 血管，抑制血小板聚集，稳定细胞膜、溶酶体膜，改善微循环，抑制炎症细 胞浸润等作用，临床用途非常广泛，可用于多种心脑血管、神经系统、呼吸 系统、消化系统和生殖系统的疾病，临床上已将PGE1釆用静脉注射的方式 治疗缺血性脑损伤，但是该药在脑缺血常规治疗剂量存在着由于过度扩张血 管引发低血压和休克的不良反应，降低了临床应用效果。最近Matsuo等发 现PGE1在治疗肝脏缺血再灌注损伤时，显著上调HSP70, GRP78和HSP86 蛋白表达，保护肝脏细胞。因此，我们认为PGE1对缺血性脑损伤的保护机 制可能不仅与扩血管有关，也与诱导HSPs表达、保护神经细胞有关。
锂盐(lithium, Li)自1949年应用于临床，主要用于抗燥狂，有时也对抑 郁症有效，临床上有情绪稳定药(mood stabilizing)之称。近年研究发现锂 盐具有神经保护作用，可用于治疗慢性神经退行性疾病如阿尔采末病、帕 金森病、Tau蛋白病变、亨廷顿舞蹈病等，作用机制包括抑制糖原合成激 酶-3 (GSK-3)谷氨酸诱导的兴奋性毒性；上调脑源性神经营养因子的表达 和激活丝裂原激活蛋白激酶信号传导通路等。最近，Ren等发现，大鼠皮下 注射氯化锂(0.5-3mmol/L，低于人等效临床应用剂量)具有保护缺血性脑 损伤作用，作用机制与诱导HSP70表达、抑制神经细胞凋亡有关。申请号 为200710027721.1的中国发明专利公布了鴒酸锂在制药中的应用，特别是在 脑缺血包括脑功能障碍药物的制备中的应用。但是锂盐在临床应用时存在的 主要问题是安全范围狭窄，不良反应多且重，可能诱发消化道反应，心血 管功能抑制和中枢神经系统功能障碍。
发明内容
本发明目的是利用前列腺El与锂盐产生协同作用，增强热休克蛋白 (HSPs)的表达，保护神经细胞，提供一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是 一种治疗缺血性脑损伤的 组合制剂，其特征在于活性成分由前列腺素E1和锂盐组成，前列腺素E1 与锂盐的摩尔剂量比为2.26x105 ~ 9.04x105: 1;所述的锂盐选择氯化锂、 碳酸锂、醋酸锂、溴化钾和枸橼酸锂中的一种。
1、上述方案中，所述前列腺素E1和锂盐混合制成静脉注射或输液合剂。
2、 上述方案中，所述前列腺素El为静脉注射或输液剂，锂盐为皮下注 射剂。
3、 上述方案中，前列腺素El和锂盐的摩尔剂量比为3.16xl(T5 ~ 5.88x10-5:1。
4、 上述方案中，所述的摩尔剂量比是指前列腺素El的摩尔量与锂盐的 摩尔量之比。
本发明工作原理是PGE1和锂盐治疗脑缺血增效作用的机理
HSP70, HSP卯和HO-l都是热休克蛋白(HSPs)家族的重要成员。研 究证实HSP70过表达可以保护实验性大鼠脑缺血模型的神经元损伤， HSP70过表达可以下调核因子-KB(NF-KB),抑制神经细胞凋亡，从而减轻 神经损伤。反之，HSP70基因敲除可以促进线粒体细胞色素c释放，活化 caspase-3，进而加重神经细胞凋亡，并增加局灶性脑缺血的脑梗塞面积。与 HSP70相似，在脑缺血过程中也伴随着HSP卯的激活。HSP卯结合于Akt 激酶，降低细胞对凋亡刺激信号的敏感性，在高等真核生物中，HSP卯存在 两种亚型，即HSP卯a和HSP90P。另外，HO-l也称为HSP32，是一种能 降解血红素的酶，它对局部脑缺血再灌注过程中产生的大量自由基有明显的 拮抗作用，从而产生保护神经元的作用。在本发明的作用中，缺血后24h大 鼠紋状体HSP70， HSP卯卩和HO-l蛋白表达显著上调，单独应用PGE1 (22.6nmol/kg， 45.2nmol/kg)及氯化锂(0.5mmol/kg)对三种蛋白的表达无 显著影响，但是，联合应用PGE1和锂盐显著增加HSP70, HSP90和HO-1 蛋白的表达。因此，PGE1和锂盐对HSPs的协同诱导作用在保护缺血性神 经元损伤中起重要作用。
另外，本发明作用于受试对象后，锂盐对缺血动物的脑血流无明显影响， 虽然大量报道指出PGE1具有扩血管作用，但是在本发明的作用中，PGE1 单独应用以及与锂盐合用均对脑缺血模型大鼠的脑血流无明显影响，这种差 异可能是由于本实验中PGE1的剂量较低。因此，PGE1和锂盐的神经保护 增效作用与改变脑血流，扩张脑血管无关。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果
1、 本发明PGE1和锂盐组合制剂中两药应用剂量均低于临床的两药常规 用量，因此可以降低不良反应，提高疗效。为缺血性脑中风的临床治疗提供 一种新的复方制剂
2、 本发明PGE1和锂盐组合制剂可以显著减少局灶性脑缺血大鼠脑梗塞
面积，改善神经行为障碍，且组合制剂与单用组相比有明显的增效作用。
3、本发明通过PGE1和锂盐组合制剂的协同增效作用，将其施用到需要 治疗的人或动物受试者，诱导热休克蛋白的生成，保护神经细胞，增加细胞 缺氧耐受性，抵抗进一步致死性损伤的作用。
附图1为脑梗塞面积TTC染色(PGE1静脉输液剂和锂盐皮下注射剂)； 附图2为脑梗塞面积定量分析(PGE1静脉输液剂和锂盐皮下注射剂)； 附图3为PGE1输液剂和锂盐注射剂减轻pMCAO致脑水肿； 附图4为PGE1输液剂和锂盐注射剂改善pMCAO致神经行为学损伤； 附图5为脑梗塞面积TTC染色(PGE1和锂盐静脉输液合剂)； 附图6为脑梗塞面积定量分析(PGE1和锂盐静脉输液合剂)； 附图7 PGE1和锂盐静脉输液合剂改善pMCAO致神经行为学损伤； 附图8免疫印迹法显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的HSP70表达； 附图9免疫印迹法显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的HSP90p表达； 附图10免疫印迹法显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的HO-l表达； 附图11免疫印迹法定量分析显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的 HSP70表达；
附图12免疫印迹法定量分析显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的 HSP90卩表达；
附图13免疫印迹法定量分析显示PGE1和锂盐增强pMCAO诱导的 HO-l表达。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一 一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂 一、动物和分组
健康SD大鼠，体重280-310g，分为7组，每组6只，分为j艮手术组、 模型组、PGE1 (L)、 PGE1 (S)、 Li、 PGE1 (L) +Li和PGEl ( S) +Li 共7组。PGEl (S)组缺血后立即给予22.6nmol/kg的PGE1静脉输液剂； PGEl (L)组缺血后立即给予45.2nmol/kg的PGEl静脉输液剂，速度为 lml/h。 Li组给予0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂，分为两次给予，缺血前 24小时给药一次，缺血前半小时给药一次，PGEl( S )+Li组给予22.6nmol/kg 的PGEl静乐^输液剂和分别两次给予0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂；
PGE1 (L) +Li组给予45.2nmol/kg的PGE1静脉输液剂和分别两次给予 0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂。mol/kg中的kg表示的是大鼠的体重。
上述药物剂量为动物试验用的剂量，具体到成人时，成人的剂量标准应 为大鼠剂量的约五~七分之一，儿童用药时使用儿童的剂量标准。
二、 永久局灶性大脑中动脉脑缺血(pMCAO)模型的建立 大鼠4。/。7jC合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，背位固定，颈正中切口，分
离右侧颈总动脉，颈内、颈外动脉，结扎颈外动脉。颈总动脉近心端结扎， 远心端用动脉夹阻断血流，在此之间剪一'J、口，将一端加热成圓珠状，直径 < 0.3mm的尼龙线(4-0)插入，去动脉夹，将尼龙线緩緩推入至前脑动脉 (自颈内外动脉分叉处算起约20mm ),再向回拉2mm至大脑前动脉起始端 (长约17mm)，结扎固定尼龙线，假手术组仅分离动脉但不插线，缝合皮肤。 手术过程中大鼠体温保持37°C 。
三、 脑血流量测定
大鼠右顶部切口，在大鼠前囟后1.5 mm， 中线右侧旁开lmm处钻孑U 插光纤探头到大脑皮层表面，用激光多普勒血流仪监测缺血前，手术中及用 药后30min脑血流量的变化。缺血24h后再检测脑血流。
四、 神经症状评分
脑缺血后24h行为学评分，方法如下(总分为IO分)①提鼠尾观察前 肢有无异常表现。凡有左前肢内收，内旋者，视其轻重评为l-3分；如大鼠 表现为不停的向左側转圏，评分4分。②将动物置于光滑平面上，分别推双 肩向对侧移动，检查推挡阻力，根据向左側推挡阻力下降程度评为1-3分。 ③将动物双前肢置一金属网上，向后轻扯鼠尾，观察大鼠双前肢的肌张力， 根据左前肢肌张力下降程度评为l-3分。分数越高，动物行为障碍越严重。
五、 脑梗塞面积测定
脑缺血术后24h,动物断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，用大鼠脑 ;漠冠状切4刀分为5片，每片厚l,5mm。脑片用红四氮唑(TTC )染色，染 色液成分为1.5ml (4%TTC)、 0.1ml KH2P04 (lmol/L)和3.4ml生理盐 水，37。C避光染色30min，正常组织呈红色，梗死组织为白色。用BioQuant IV Image analysis system软件计算脑梗塞面积比值。
六、 脑含水量测定
脑缺血术后24h，动物断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，称取大脑 湿重，105。C烘烤48h至恒重，精确称量干重，计算含水量。
七、 免疫印迹法
脑缺血术后24h，取缺血侧大脑紋状体，在组织匀浆緩冲液中用超声波将细 胞粉碎，BCA试剂盒测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素膜， 与特异性抗体及相应二抗结合，ECL显影，检测各组HSP70, HSP卯P， HO-l 的表达，以P-actin为上样对照，并用sigma pro 5.0进行定量分析。
八、 数据统计与分析
数据均以均数士SD (Mean士SD)表示，统计分析釆用单因素方差分析 (one-way ANOVA )， PO.05为统计学差异有显著性。
九、 结果
PGE1输液剂、氯化锂注射剂对大鼠pMCAO模型的影响 如附图1和附图2所示，单独应用氯化锂皮下注射剂(0.5mmol/kg)两 次或PGE1静脉输液剂(22.6nmol/kg，45.2nmol/kg)显著降低梗塞面积。但 联合应用氯化锂皮下注射剂(0.5mmol/kg)两次和PGE1静脉输液剂 (45.2nmol/kg )更显著降低梗塞面积(与PGE1 ( 45.2nmol/kg )单用组相 比P〈0.05)。另外，如附图3和附图4所示，虽然单独应用氯化锂皮下注射 剂(0.5mmol/kg)或PGE1静脉输液剂(22.6nmol/kg， 45.2nmol /kg)对脑含 水量和神经症状评分没有明显改善，但联合应用氯化钾皮下注射剂 (0.5mmol/kg)两次和PGE1静脉输液剂(45.2nmol /kg)显著降低脑含水 量和神经症状评分。(与PGE1 ( 45.2nmol/kg)组相比P0.05,)。
附图1、 2、 3和4中，model组为pMCAO模型组；PGE1 (S)组给予 22.6nmol/kg的PGE1静脉输液剂；PGE1 ( L)组给予45.2nmol/kg的PGE1 静脉输液剂；Li组分两次给予0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂；PGE1 ( S) + Li组给予22.6nmol/kg的PGE1静脉输液剂和分别两次给予0.5mmol/kg 的氯化锂皮下注射剂；PGE1 (L) +Li组给予45.2nmol/kg的PGE1静脉 输液剂和分别两次给予0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂；mol/kg中的kg表 示的是大鼠的体重。Mean ± SE, * P<0.05，与pMCAO模型组相比；# P<0.05， 与PGE1 (L)组相比。(n = 6)。 PGE1和锂盐对脑血流量的影响。
pMCAO术后5min，脑血流量(cBF)降低到缺血前20-30 % ，并一直保 持较低水平。PGE1,氯化锂及合用药组在全部监测过程中对脑血流量无显 著影响。
PGE1和锂盐对HSPs的协同诱导作用
如附图8、 9、 10、 11、 12和13缺血后24h，大鼠紋状体HSP70， HSP90p 和HO-l蛋白表达显著上调，单独应用PGE1及氯化锂对三种蛋白的表达无 显著影响；但是，联合应用PGE1和氯化锂显著增加HSP70， HSP卯p和 HO-l蛋白的表达(与单用PGE1组相比，P<0.05 )。
附图8、 9、 10、 11、 12和13中，sham组为假手术组，model组为模型 组；PGE1 (S)组给予22.6nmo1 /kg的PGE1静脉输液剂；PGE1 (L)组 给予45.2nmol /kg的PGE1静脉输液剂；Li组分两次给予0.5mmol/kg的氯 化锂皮下注射剂；PGEl ( S) + Li组给予22.6nmol /kg的PGEl静脉输液剂 和分别两次给予0.5mmol/kg的氯化锂皮下注射剂；PGEl (L) + Li给予 45.2nmol /kg的PGEl静脉输液剂和分别两次给予0.5mmol/kg的氯化锂皮 下注射剂；mol/kg中的kg表示的是大鼠的体重。Mean ± SE, * P<0.05与假 手术组相比；# P<0.05与才莫型组相比；$ P<0.05与PGEl( S )组相比，& P<0.05 与PGEl ( L )组相比。(n = 6 )。
实施例二 一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂
一、 动物和分组
健康SD大鼠，体重280-310g，分为6组，每组8只，即模型组、PGEl (L)用PGEl静脉输液剂45.2nmol/kg、 PGEl ( S )用PGEl静乐滩液剂 22.6nmol/kg、 Li组用氯化锂静脉输液剂0.5mmol/kg、 PGEl (L) +Li MIX (45.2nmol/kg+0.5mmol/kg)静脉输液合剂和PGE1 ( S ) +Li (22.6nmol/kg +0.5mmol/kg)静脉输液合剂共6组，缺血后立即应用PGE1、氯化锂以及 PGE1+Li合剂，合剂为静脉输液剂，速度为lml/h。
上述药物剂量为动物试验用的剂量，具体到成人时，成人的剂量标准应 为大鼠剂量的约五~七分之一 ，儿童用药时使用儿童的剂量标准。
二、 永久局灶性大脑中动脉脑缺血(pMCAO)模型的建立 大鼠4y。水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，背位固定，颈正中切口，分
离右侧颈总动脉，颈内、颈外动脉，结扎颈外动脉。颈总动脉近心端结扎， 远心端用动脉夹阻断血流，在此之间剪一小口，将一端加热成圆珠状，直径 < 0.3mm的尼龙线(4-0)插入，去动脉夹，将尼龙线緩緩推入至前脑动脉 (自颈内外动脉分叉处算起约20mm )，再向回拉2mm至大脑前动脉起始端 (长约17mm)，结扎固定尼龙线，缝合皮肤。手术过程中大鼠体温保持37。C。
三、 神经症状评分
脑缺血后24h行为学评分，方法如下(总分为10分)①提鼠尾观察前
肢有无异常表现。凡有左前肢内收，内旋者，视其轻重评为l-3分；如大鼠 表现为不停的向左侧转圏，评分4分。②将动物置于光滑平面上，分别推双 肩向对侧移动，检查推挡阻力，根据向左侧推挡阻力下降程度评为1-3分③ 将动物双前肢置一金属网上，向后轻扯鼠尾，观察大鼠双前肢的肌张力，根 据左前肢肌张力下降程度评为l-3分。分数越高，动物行为障碍越严重。
四、 脑梗塞面积测定
脑缺血术后24h,动物断头取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，用大鼠脑 模冠状切4刀分为5片，每片厚l.Smm。脑片用红四氮唑(TTC )染色，染 色液成分为1.5ml 4%TTC， 0.1ml lmol/L KH2PO^， 3.4ml生理盐水，37 。C避光染色30min，正常组织呈红色，梗死组织为白色。用BioQuant IV Image analysis system库欠^f牛i十算月亩梗塞面^U匕值。
五、 结果
PGE1+Li静脉输液合剂对大鼠pMCAO模型的影响
如附图5、 6和7单独用氯化锂静乐械液剂(0.5mmol/kg)或PGE1静脉 输液剂(22.6nmol/kg, 45.2nmol/kg)均显著降低梗塞面积，改善行为学障 碍(与模型组相比P<0.05);但PGEl+Li静脉输液合剂(22.6nmol/kg +0.511111101/1^)更显著降低梗塞面积，改善行为学障碍，且合剂与单用药组相 比具有显著的增效作用(与PGEl ( 22.6nmol/kg )组相比P<0.05 )。
附图5、 6和7中，model组为pMCAO模型组；PGEl (S)组给予 22.6nmol/kg , 的PGEl静脉输液剂；PGEl (L)组给予45.2nmol /kg的 PGEl静脉输液剂；Li组给予0.5mmol/kg的氯化锂静脉输液剂；PGEl ( S ) + Li Mix组给予22.6nmol /kg的PGEl和0.5mmol/kg的氯化锂静脉输液合 剂；PGEl ( L) + Li Mix组给予45.2nmol /kg的PGEl和0.5mmol/kg的氯 化锂静脉输液合剂；mol/kg中的kg表示的是大鼠的体重。Mean ± SE, * P<0.05， **P<0.01，与pMCAO才莫型组相比；#P<0.05, ##P<0.01，与PGEl (S)组相比。(n = 8)。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项 技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保 护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明 的保护范围之内。
权利要求
1、一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂，其特征在于活性成分由前列腺素E1和锂盐组成，前列腺素E1与锂盐的摩尔剂量比为2.26×10-5～9.04×10-5∶1；所述的锂盐选择氯化锂、碳酸锂、醋酸锂、溴化钾和枸橼酸锂中的一种。
2、 根据权利要求l所述的组合制剂，其特征在于所述前列腺素E1和锂 盐混合制成静脉注射或输液合剂。
3、 根据权利要求l所述的组合制剂，其特征在于所述前列腺素E1为静 脉注射或输液剂，锂盐为皮下注射剂。
4、 根据权利要求l所述的组合制剂，其特征在于前列腺素E1和锂盐的 摩尔剂量比为3.16xl(T5~ 5.88xl0-s: 1。
全文摘要
一种治疗缺血性脑损伤的组合制剂，活性成分由前列腺素E1和锂盐组成，前列腺素E1和锂盐可以混合制成静脉注射或输液合剂，也可以将前列腺素E1制成静脉注射或输液剂，锂盐制成皮下注射剂。本发明通过前列腺素E1和锂盐组合制剂的协同增效作用，将其施用到需要治疗的人或动物受试者，诱导热休克蛋白的生成，保护神经细胞，增加细胞缺氧耐受性，抵抗缺血脑损伤作用。本发明PGE1和锂盐组合制剂中两药应用剂量均低于临床的两药常规用量，因此可以降低不良反应，提高疗效。为缺血性脑中风的临床治疗提供一种新的复方制剂。
文档编号A61K33/14GK101176735SQ200710190570
公开日2008年5月14日 申请日期2007年12月3日 优先权日2007年12月3日
发明者瑞 盛, 秦正红, 蓉 韩 申请人:苏州大学