专利名称：虎杖二苯乙烯总苷在制备治疗风湿性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明是申请号为200410091138.3发明专利的分案申请，原案申请日为2004年11月19日，原案发明名称为一种治疗风湿性疾病的中药组合物及其制剂和用途。
发明领域 本发明属于中药新药研发领域，具体涉及一种治疗风湿性疾病的中药组合物，其主要成分是从我国传统中药虎杖中提取的有效部位二苯乙烯总苷(其中的主要成分为虎杖苷单体)，并提供了该药物的制剂剂型及其制备方法和用途。
背景技术：
祖国医学认为痹症是肌肉经络为风湿邪阻闭，气血运行不畅，临床出现以筋骨、肌肉、关节等处疼痛酸楚，重者麻木、关节肿大、屈伸不利为主证的病症，属常见、多发病。辨证施治方面，根据痹症疼痛的性质、部位及病史兼证对痹症进行综合治疗时，贵在疏通经络，畅达气血、故祛邪、活血、通络为必守常法。西医学研究表明，风湿性疾病是一种以全身结缔组织的炎症、水肿、变性及增生为主要特征的慢性疾病，多系感染或变态反应引起全身结缔组织的非特异性炎性病变。
抗风湿西药分为改善症状药和改善病情药。改善症状药主要是指抗炎镇痛药(如普威、消炎痛、布洛芬、奈普生、莫比可、西乐葆、万络、激素等)，这类药物能够迅速控制患者的疼痛、肿胀，但不能阻止病情的发展；改善病情药(如甲氨喋呤、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金制剂等)作用特点是起效慢，通常1个月起效，达到疗效高峰需半年时间，一般认为此类药物可控制风湿活动。抗风湿西药均存在不同程度的胃肠道副作用、甚至出现肝肾功能损害、性腺抑制、皮疹等。抗风湿中药分为单味药和复方制剂。单味药制剂如雷公藤多甙片、雷络酯片、火把花根片、正清风痛宁、昆明山海棠；复方制剂如通痹灵片、通痹灵合剂等。中药除个别对性腺有抑制外，多数副作用极小，适合长期服用。但中药起效较慢，一般需4-8周才有比较明显的效果。
中药虎杖为蓼科(Polygonaceae)植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.)的根茎。多生于山谷，溪旁或岸边，为多年生灌木状草本。虎杖是常用中药，中医认为它性味苦，平，具有祛风，利湿，破淤，通经的功效。虎杖分布于江苏，浙江，江西，福建，山东，河南等中南部地区，春秋均可采挖。
对于虎杖的药理作用有许多文献报道。虎杖中主要成分有对心血管系统的药理活性；有降血脂作用；对微循环也有影响，可以扩张细动脉，增加心搏出量和脉压差，在脉压差增大的情况下，促进毛细血管血流的恢复和毛细血管的开放；有镇咳平喘作用；对金黄色葡萄球菌和肺炎双球菌有抑制作用；有抗病毒作用，可抑制乙型肝炎抗原阳性，治疗慢性肝炎、急性黄疽性肝炎；对外伤出血有明显的止血镇痛功效，对烫伤、烧伤创面有收敛、消炎作用；内服对上消化道出血也有止血作用。
祖国医学的研究表明中药虎杖出具有上述功效外，还具有祛风利湿，散瘀定痛的功效，用于关节痹痛，水火烫伤，跌扑损伤，痈肿疮毒。《本草拾遗》记载“主风在骨节间及血瘀，煮汁作酒服之。”虎杖是治疗风湿性关节炎的良药，用之可达到三个目的①祛风除湿以祛邪；②清热解毒以疗咽喉红肿疼痛，抗溶血性链球菌感染，使抗链“O”转阴以治本；③活血通经(陈建国“虎杖在风湿性关节炎、糖尿病中的应用”《四川中医》1996，14(6)P15)。这些充分说明虎杖在治疗风湿性疾病方面有良好的开发前景。
从虎杖中提取虎杖提取物(主要成分为虎杖苷)及虎杖苷单体的生产工艺较成熟，有许多文献报道，但未见有与本发明完全相同的制备方法，且将其用于治疗风湿性疾病的报道，也未有申请或获得发明专利的报道。
发明内容
本发明人利用现代工艺及制剂手段对虎杖进行系统化研究，开发出新型的抗炎抗风湿药物，其有效成分为虎杖中的二苯乙烯总苷，本发明具有强有力的中医基础理论支持。在制备工艺上，该药物及其制剂的制备工艺简单，生产成本较低，有效成分损失小，成品率高，工艺路线稳定，易于大规模生产。通过质量标准研究，该制剂的质量可控性强，制剂中的化学成分清楚，质量控制方法操作简单，稳定性及专属性均较强。
本发明的目的在于提供一种治疗风湿性疾病的中药组合物，其中的有效成分是来自中药虎杖中的有效部位二苯乙烯总苷(主要成分为虎杖苷)。
本发明进一步提供了以所述二苯乙烯总苷为活性成分，用于治疗风湿性疾病的纯中药药物制剂和相应的药物剂型。
本发明的另一个目的在于提供用于治疗风湿性疾病的纯中药药物的制备方法，特别是二苯乙烯总苷的制备方法。
本发明的创造性在于首次将二苯乙烯总苷用于治疗风湿性疾病，且治疗效果较好。
本发明所采用的药材为将蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎，所用药材经鉴别为法定标准合格药材，可以用于投料。
本发明提供的二苯乙烯总苷可通过如下方法得到 取虎杖药材，粉碎成过10-30目筛的粗粉，用8-16倍药材重量体积的水或不同浓度乙醇提取，提取液减压浓缩至相对密度为1.05～1.08(60℃时)的浸膏，加3-10倍药材重量的去离子水溶解，离心(3000转/分，8分/次)，上清液大孔吸附树脂柱，用去离子水除杂，然后再用10％以下浓度乙醇除杂，最后用20％-40％的乙醇以0.8L/kg.h流速解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩并真空干燥(60℃，-0.09Mpa)，粉碎得虎杖提取物，其有效部位为二苯乙烯总苷，有效单体为虎杖苷。
本发明的特征在于虎杖药材粉碎后可以采用回流、渗漉或其它可行的操作方法提取，其中优选方法为渗漉，所用的提取溶剂可以是8～16倍药材重量体积的水或不同浓度的乙醇溶液以0.2～1L/kg.h流速提取，其中优选提取溶剂为乙醇溶液，优选乙醇浓度为60％，且渗漉的最佳速度为0.6L/Kg.h。
本发明的特征在于所用树脂重量为药材重量的1.5倍，这样可以保证二苯乙烯总苷被充分吸附，而且不会超过吸附载量。
本发明的特征在于选用大孔树脂分离纯化二苯乙烯总苷，包括D-101型大孔吸附树脂、Dm301型大孔吸附树脂、AB-8型大孔吸附树脂等，其中优选树脂型号为D-101型。
本发明的特征在于树脂解吸条件为用4～8倍于树脂体积且乙醇浓度大于或等于20％的溶液，流速为0.2～1.0L/Kg.h，其中优选乙醇浓度为20％，优选流速为0.8L/Kg.h。
本发明的特征还在于所提取的二苯乙烯总苷中主要含有两种化合物，分别为白藜芦醇(Resveratrol)和虎杖苷(Polydatin)，其中主要成分为虎杖苷。二者化学结构式如下
本发明的特征在于采用上述方法得到的虎杖提取物，其中二苯乙烯总苷的含量在55％以上，虎杖苷含量在55％以上，二苯乙烯总苷的转移率在65％以上。
为了进一步验证该工艺条件的合理性、稳定性、重复性以及放大生产后的匹配性和可操作性，为质量标准研究、稳定性研究、药理毒理及临床研究提供样品；以及为进一步的试制生产提供参考。我们按上述工艺条件进行了三批中试生产，结果表明中试样品经质量控制均符合标准，有效部位含量已经达到中药新药第五类的标准，各项工艺参数稳定、可靠、重复性好，样品得率、含量及转移率都无较大波动，而且三批中试平行性较好。该工艺稳定可行，洗脱溶剂环保且成本较低，符合大规模生产的要求。因此，我们认为该工艺条件是可以用于放大生产。
本发明的特点在于工艺流程简单，生产成本较低，工艺稳定，适于大规模生产。
本发明提供的治疗风湿性疾病的中药组合物，其含有采用上述制备方法所得的虎杖提取物，该提取物的组成中包括了二苯乙烯总苷，其中的主要活性成分是虎杖苷，从药效学角度出发，作为本发明用于治疗风湿性疾病的中药组合物，所述二苯乙烯总苷的含量在55％以上，其中的虎杖苷的含量在55％以上。
在此基础上，本发明还研究提出了一种治疗风湿的纯中药药物制剂，该中药药物以上述二苯乙烯总苷为有效活性成分，并包括了药剂学上可接受的辅料组分。本发明还提供了该纯中药药物制剂的一种制备方法，其包括以虎杖为原料，用乙醇提取，并经纯化分离制取虎杖提取物，其中有效部位为二苯乙烯总苷，以该二苯乙烯总苷为有效部位，按照药剂学方法制备成要求的药物制剂。
本发明的药物制剂包括针剂和口服剂，其中口服剂包括胶囊剂、口服液、片剂、颗粒剂等，特别是胶囊剂要求虎杖提取物中的二苯乙烯总苷的含量在55％以上，虎杖苷含量在55％以上，每粒或片含有二苯乙烯总苷的含量以虎杖苷计不得少于50mg。在制备口服制剂时，其特征在于选用的辅型剂可以是淀粉、糊精或环糊精、蔗糖、硬脂酸盐等常规充填剂。注射剂型包括注射液及冻干粉针等。在制备注射剂型时，要求所述虎杖提取物中的二苯乙烯总苷的含量在85％以上，且虎杖苷的含有量不低于80％。冻干粉针剂可以通过无菌喷雾干燥、低温真空干燥、冷冻干燥等方法制备。各制剂的后期制备工艺及设备均属制药领域的常规技术，本发明对此不作限定，故在此不予详述。
为保证药物的质量，在生产过程中需要对最终提取物中的有效成分含量随时进行检测。用于检测所述苷类化合物的方法可以借助任何可行的检测手段和公知的方法，本发明在此提出了一套可行的检测方法。
首先，通过高效液相色谱分析，与虎杖苷标准品谱图对照，证明了在提取物中含有以虎杖苷为主要成分的二苯乙烯总苷。因此，我们采用高效液相外标法，通过标准曲线检测来控制虎杖提取物中的虎杖苷含量，经实际检测证明，检测结果的重现性好、灵敏度高。应该说明的是，该方法仅作为本发明产品的质量控制手段之上，不应排除其它任何可满足要求的方法和操作。特别是虎杖苷提取率含量测定对于本领域的技术人员是很容易实现的，可通过HPLC外标法测得，因此非常适合工业化大生产要求。虎杖提取物中虎杖苷的HPLC(按照中国药典2000年版一部附录VI D)测定方法如下 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(40∶60)为流动相，检测波长306nm。理论板数按虎杖苷峰计算，应不低于1500。
对照品溶液的制备取虎杖苷对照品约3mg，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每1ml中含虎杖苷0.03mg)。
供试品溶液的制备取测试样品粉末约15mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加甲醇适量超声处理(功率250W，频率33KHZ)使溶解，取出，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，照外标一点法计算，即得。
本发明最主要的创造性在于将所提取的虎杖提取物用于治疗风湿性疾病。本发明人为了寻找虎杖中抗风湿的有效部位，对于虎杖中多个部位进行了进行抗炎、镇痛药效学筛选。结果表明，所得二苯乙烯类有抗炎镇痛的活性，因此有效部位定为二苯乙烯总苷。以小鼠二甲苯致炎法、小鼠醋酸致扭体反应法进行初步筛选试验，以蛋清致大鼠足跖肿胀进行优选试验。药理活性确定有效部位为一类二苯乙烯苷类化合物，经分离结构确证主要为虎杖苷。所以确定以虎杖苷为代表的二苯乙烯总苷为有效部位。
为评价虎杖提取物对风湿病的治疗作用(主要药效学)，共设计了十个实验(详见下文)。风湿性痹症为自身免疫性疾病，实验一、二研究了虎杖提取物对于原发和继发的免疫性关节炎的治疗作用；实验三、四通过小鼠的体外实验研究了本药的免疫调节功能。实验五评价了本药抗痛风的疗效。风湿性痹症除特异性免疫外，还伴有非特异性炎症反应。因此实验六、七分别采用鸡蛋清做速效致炎剂，甲醛做中效致炎剂，观察本药对于急性和亚急性非特异性炎症的治疗作用。风湿病常伴有剧烈的疼痛，因而采用小鼠乙酸扭体法观察本药的镇痛作用。风湿性痹病前期以渗出性病变为主，后期以增生性病变为主，实验九、十则分别评价了本药的抗炎性渗出作用及对肉芽肿的治疗作用。实验结果表明，虎杖提取物具有明显的抗炎、镇痛及调节免疫功能的作用，动物试验疗效肯定。
为了便于理解本发明在治疗风湿性疾病方面的药用价值，发明人使用以上所述方法或实施的口服制剂及注射剂完成了药理毒理和药效实验。
虎杖提取物治疗风湿性疾病的主要药效学实验如下 实验一虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎的影响 采用Freund’s完全佐剂(30mg/ml)致大鼠关节炎的造模方法，分别以虎杖提取物小、中、大三个剂量(15mg/kg、30mg/kg、60mg/kg)灌胃给药，以足肿胀度、脾系数、胸腺系数、脾淋巴细胞增殖功能及大鼠双侧踝关节病变程度为观测指标，并取双侧踝关节，做病理检查。研究虎杖提取物对佐剂性关节炎的影响。连续给药24天，于末次给药后1小时测量造模足及对侧足体积，处死动物，取脾和胸腺称重，计算脏器系数。结果如下 表1虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎原发病变的影响
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 由表1结果可见，Freund’s完全佐剂造模后各组大鼠足出现不同程度肿胀，以模型组最为显著，说明造模成功；虎杖提取物各剂量组均能不同程度的改善大鼠左足肿胀度。
表2虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎的右后足跖肿胀度的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 由表2结果可见，Freund’s完全佐剂造模后各组大鼠足出现不同程度肿胀，以模型组最为显著，说明造模成功。虎杖提取物各剂量组均能不同程度的改善大鼠右后足跖肿胀度。 表3虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎继发病变的影响 ——右后足踝关节的病理检查结果 注虎杖提取物各剂量组、强的松组与模型组右侧踝关节炎症程度相比较，P＜0.05(卡方检验)。
由表3结果可见强的松组与模型组右侧踝关节比较，炎症程度轻，有显著性差异(P＜0.05)。虎杖提取物各剂量组与模型组右侧踝关节相比较，程度明显轻于模型组，有显著性差异(P＜0.05)。
表4虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎的继发左后足跖肿胀度的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 由表4结果可见，Freund’s完全佐剂造模后各组大鼠足出现不同程度肿胀，以模型组最为显著，说明造模成功。虎杖提取物在给药18天后各剂量组均能不同程度的改善大鼠左后足跖肿胀度，大剂量组效果更为明显。
表5虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎的继发左后足踝关节病变的病理检查结果 注虎杖提取物各剂量组、强的松组与模型组左侧踝关节炎症程度相比较，P＜0.05(卡方检验)。
左后足踝关节病理组织学检查结果模型组踝关节滑膜炎症明显，HE染色光镜下见滑膜水肿，滑膜层明显增厚，滑膜细胞肥大，可见突入关节腔内的绒毛；滑膜层下纤维组织疏松、水肿，有淋巴细胞、单核细胞浸润；结缔组织内毛细血管增多；滑囊液中可见中性粒细胞。阳性药强的松组踝关节滑膜炎症明显轻于模型组；虎杖提取物小、中、大各剂量组踝关节滑膜炎症均明显轻于模型组。
表6虎杖提取物对佐剂性关节炎大鼠免疫器官的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表7观察虎杖提取物对佐剂性关节炎大鼠继发性病变的严重度评分结果 注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表8虎杖提取物对佐剂性关节炎大鼠继发病变体重的影响
注与模型组比较***P＜0.001。
由表8结果可见，造模后12d～24d强的松组与模型组比较，大鼠体重均明显降低，经统计学处理差异有极显著性(P＜0.001)；而虎杖提取物小、中、大剂量组与模型组比较，大鼠体重没有明显变化。
表9虎杖提取物对佐剂性关节炎大鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 由表9数据可以看出，阳性药“强的松”作用组大鼠脾淋巴细胞对ConA的反应性增殖能力较模型组有显著的恢复(P＜0.05)，这与文献报道相一致，阳性药有效，证实了本实验方法的可行性；虎杖提取物小、中、大三个剂量(15、30和60mg/kg)均有明显恢复脾淋巴细胞增殖功能的作用(P＜0.05)，提示虎杖提取物对佐剂性关节炎大鼠的免疫功能具有明显的调节作用。
实验一结果显示，虎杖提取物小、中剂量在造模后的6h、18h、24h、48h、12d、15d、18d、21d、24d的右足肿胀度和12d、15d、18d、21d、24d的左足肿胀度较模型组显著改善，各剂量组均升高脾淋巴细胞增殖功能，与模型组相比存在统计学上的显著性差异。说明虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎有明显的防治作用。
由免疫反应所介导的炎症反应在各种风湿性疾病，尤其是类风湿性关节炎病理过程中起着主导作用。大鼠佐剂性关节炎是类风湿性关节炎的常用模型之一，原发病变主要表现为早期致炎局部的炎症反应，致炎后18h右脚的肿胀达到高峰，持续3d逐渐减轻，8d后再度肿胀；继发性病变由迟发型超敏反应引起，一般出现在致炎后12～14d，表现为对侧(左后肢)和前肢足的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小节及体重下降等。一般的抗炎药物只对原发性病变有效，若药物具有免疫抑制和调节作用，则可拮抗由免疫反应所引起的炎症。本次实验结果显示虎杖提取物对大鼠佐剂性关节炎原发病变和继发病变均有明显的抑制作用，还可明显恢复脾淋巴细胞增殖功能，表明虎杖提取物不仅具有抗炎活性，还可有效调节机体的免疫功能。另外，阳性对照药强的松由于其毒副作用，大鼠体重在炎症后期一直明显低于模型组；而虎杖提取物各剂量组大鼠体重与模型组比较无明显变化，说明虎杖提取物治疗时毒副作用很小，充分体现了中药的用药优势。
实验二虎杖提取物对二硝基氯苯致小鼠迟发型超敏反应的影响 观察虎杖提取物对二硝基氯苯(DNCB)诱导小鼠迟发型超敏反应的影响。将动物按体重随机分为正常组、模型组、阳性组(强的松，5mg/kg)、虎杖提取物小(20mg/kg)、中(40mg/kg)、大(80mg/kg)剂量组，共6组，每组12只，各组小鼠腹部去毛，范围3cm×3cm大小，除正常组外，其余各组均将5％二硝基氯苯丙酮溶液均匀涂抹于小鼠去毛腹部，正常组涂抹等体积的丙酮溶剂，致敏前1天开始给药，共9日，致敏7天后用1％二硝基氯苯丙酮溶液每面10μl涂抹于右耳进行攻击，24h后处死动物，测量耳肿胀度，计算脾系数和胸腺系数，并做病理组织学检查。结果如下 表10虎杖提取物对DNCB诱发的迟发型超敏反应小鼠免疫器官的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与正常组比较△△△P＜0.001 从表10结果可知，模型组的脾系数较正常组明显增加，经统计学分析差异有极显著性(P＜0.001)；强的松组同模型组比较，脾系数明显降低，经统计学分析差异有极显著性(P＜0.001)；虎杖提取物中剂量组、大剂量组与模型组比较，脾系数均降低，差异有不同程度的显著性(P＜0.05，P＜0.01)。模型组的胸腺系数较正常组明显增加，经统计学分析差异有显著性(P＜0.05)；强的松组同模型组比较，胸腺系数明显降低，经统计学分析差异有极显著性(P＜0.001)；虎杖提取物中剂量组、大剂量组与模型组比较，胸腺系数均降低，差异有显著性(P＜0.05)。
脾及胸腺病理组织学检查结果正常组、模型组、阳性组及虎杖提 取物各剂量组的脾脏及胸腺病理组织学检查均未见异常。
表11虎杖提取物对DNCB诱发的迟发型超敏反应小鼠耳肿胀度的影响
注与模型组比较*P＜0.05；与正常组比较△△△P＜0.001 由表11结果可知，模型组与正常组比较，耳肿胀度明显增加，经统计学分析差异有极显著性(P＜0.001)；强的松组同模型组比较，肿胀度降低，差异具有显著性(P＜0.05)；虎杖提取物中、大剂量组与模型组比较肿胀度均降低，差异具有显著性(P＜0.05)。试验结果表明，虎杖提取物对DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应具有明显的抑制作用。
2，4-二硝基氯苯是一种半抗原，将其溶液涂抹腹部皮肤后，与皮肤蛋白结合成抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4～7天后将其再次涂抹于皮肤，可使局部产生迟发型超敏反应。本实验以耳肿胀度、脾系数和胸腺系数为观测指标，并做相应的病理组织学检查，说明了虎杖提取物对2，4-二硝基氯苯诱导的小鼠迟发型超敏反应有明显的抑制作用，为临床药效学研究提供了实验依据。
实验三虎杖提取物对小鼠腹腔巨噬细胞产生白细胞介素-1的影响 本实验通过检测虎杖提取物对巨噬细胞(Mφ)产生白细胞介素1(IL-1)功能的影响，来观察虎杖提取物对小鼠免疫系统的作用。体外分离培养小鼠腹腔Mφ，用脂多糖(LPS)来刺激Mφ产生IL-1，将不同浓度的虎杖提取物(100、50、25、12.5和6.25μg/mL)作用于该细胞48小时后，用放免法检测细胞培养液中IL-1的含量，实验重复三批。结果详见表12～14。
表12虎杖提取物对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响(第一批) 表13虎杖提取物对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响(第二批) 表14虎杖提取物对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响(第三批) 注*各用药组与刺激原作用组进行组间t检验，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
三批实验中，LPS刺激组较细胞对照组IL-1含量有升高的趋势；阳性药组(DEX)较LPS刺激组IL-1含量有降低的趋势，证实该方法的可行性较好。虎杖提取物各浓度作用组IL-1的含量均有所降低，并具有一定的剂量依赖性，其中以100μg/mL作用组IL-1含量的下降尤为明显。说明虎杖提取物对小鼠腹腔巨噬细胞产生白细胞介素-1的功能具有抑制作用，由此可以推测该药对小鼠免疫功能具有调节作用。
IL-1是一种单核巨噬细胞来源的细胞因子，在免疫与炎症反应中均起着重要的作用。研究表明，在类风湿性关节炎等免疫系统疾病的动物模型中，IL-1的含量在血液和关节滑液中均明显升高。体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞在刺激原(如LPS)的作用下可持续分泌IL-1。本实验采用放免法检测了不同浓度虎杖提取物作用后细胞培养液中IL-1的含量，结果显示药物作用后IL-1的含量降低，且有一定的剂量依赖性。由此我们可以推测虎杖提取物可能通过抑制巨噬细胞产生IL-1来发挥对免疫系统的调节作用。
实验四虎杖提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 采用本实验来检测虎杖提取物对体外培养的正常小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响。用ICR小鼠，体外无菌条件下分离脾淋巴细胞，将0.01mg/mLConA与不同浓度的虎杖提取物(5、0.5、0.05、0.005、0.0005和0.00005mg/mL)体外共同培养72小时，以SRB法检测虎杖提取物对Con A诱导的脾淋巴细胞的增殖情况。结果见表14。
表14虎杖提取物对小鼠脾淋巴细胞增殖功能的影响 注#表示与空白对照组比较，##P＜0.01；*表示与ConA组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 从上表可以看出，虎杖提取物在0.00005、0.0005mg/mL浓度时能够显著抑制由0.01mg/mL Con A引起的脾淋巴细胞增殖，而在0.5mg/mL时则具有相反的作用，可以显著增强由0.01mg/mL Con A引起的脾淋巴细胞的增殖，在5mg/mL时能够极显著的增强由0.01mg/mL Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖。提示虎杖提取物在低浓度时可以显著抑制小鼠脾淋巴细胞增殖，而在高浓度时可显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，具有双向调节功能。
实验五虎杖提取物对微晶型尿酸钠致大鼠痛风性关节炎的影响 为观察虎杖提取物对微晶型尿酸钠(MSU)致大鼠痛风性关节炎足肿胀体积的影响，用虎杖提取物15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg三个剂量大鼠灌胃给药，每天1次，连续7天。于第7次给药后用100mg/ml微晶型尿酸钠给大鼠右后足底皮下注射造模，并于造模前0h、造模后1h、2h、3h、4h、5h、6h用毛细管放大器测量大鼠足体积，计算肿胀体积。观察虎杖提取物的抗炎作用。结果见表15。
表15虎杖提取物对MSU大鼠痛风性关节炎足肿胀体积的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
由上表可见，造模后不同时间点，虎杖提取物小、中、大剂量组与模型组比较均有不同程度的下降，经统计学处理差异具有显著性。说明虎杖提取物对微晶型尿酸钠致大鼠痛风性关节炎有明显的抑制作用。
由此可以确定虎杖提取物对MSU致大鼠痛风性关节炎足肿胀有明显的抑制作用，证明虎杖提取物有明显的抗炎作用。
实验六虎杖提取物对鸡蛋清致大鼠急性炎症的影响 采用本实验来观察虎杖提取物对大鼠急性炎症的影响。用虎杖提取物15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg三个剂量灌胃给药，每天1次，连续7天。于第7次给药后采用10％鸡蛋清溶液足底皮下注射造模，造模前0h，造模后0.5h、1h、1.5h、2h用毛细管放大器测量足体积并计算肿胀体积。结果见表16。
表16虎杖提取物对急性炎症大鼠足肿胀体积的影响
注与模型组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
结果显示，虎杖提取物中、大剂量组造模后各时间点与模型组比较，足肿胀度均明显降低，经统计学处理差异具有显著性。说明虎杖提取物对大鼠急性炎症有明显的抑制作用。
异种蛋白鸡蛋清注入大鼠右后足部皮下，可释放组胺、5-羟色胺等能够强烈扩张毛细血管的物质，引起血管内液体及蛋白渗出至皮下，形成水肿，造成大鼠足部体积增加。通过测定造模后各个时间点的足肿胀体积，来评价药物对大鼠急性炎症的影响。上述实验结果显示，虎杖提取物能够明显降低大鼠注射蛋清后1～2h内的足肿胀度，表明它的作用可能与抑制组胺、5-羟色胺等物质的释放或拮抗它们的作用有关。
实验七虎杖提取物对甲醛致大鼠亚急性炎症的影响 采用本试验来研究虎杖提取物对大鼠亚急性炎症的抗炎作用。用虎杖提取物15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg三个剂量灌胃给药，每天1次，连续10天，于第7日药后1h给大鼠足底注射2％的甲醛溶液0.1ml/只。于造模前0h、造模后3h、6h、24h、48h、72h用毛细管放大器测量足体积并计算肿胀体积。结果见表17。
表17虎杖提取物对甲醛致大鼠亚急性足肿胀体积的影响
注与模型组比较*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。
结果显示，虎杖提取物各剂量组造模后不同时间点与模型组比较，足肿胀度明显降低，经统计学处理差异具有显著性。说明虎杖提取物对大鼠亚急性炎症有明显的抑制作用。
实验八虎杖提取物对乙酸致小鼠扭体反应的影响 本实验通过观察虎杖提取物对乙酸致小鼠扭体次数的影响，研究虎杖提取物的镇痛作用。用虎杖提取物20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg三个剂量灌胃给药，每天1次，连续7天。末次给药后1h，每只小鼠腹腔注射浓度为1.2％的乙酸溶液，观察并记录腹腔注射1.2％的乙酸溶液后15min内小鼠的扭体次数。结果见表18。
表18虎杖提取物对乙酸致小鼠扭体反应次数及扭体次数的影响
注与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
结果显示，与模型对照组比较，虎杖提取物中、大剂量组小鼠扭体次数明显降低，差异有显著性。说明虎杖提取物有明显的镇痛作用。
实验九虎杖提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 为观察虎杖提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响，用虎杖提取物20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg三个剂量小鼠灌胃给药，每天1次，连续7天。第7天药后1h，在冰醋酸致炎的基础上，静脉注射0.5％伊文斯蓝溶液，取腹腔液测定其吸光度，研究虎杖提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响。结果见表19。
表19虎杖提取物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
注与模型对照组比较*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001 结果显示，虎杖提取物中、大剂量组同模型组比较，吸光度明显降低，差异具有显著性。说明虎杖提取物能够明显减轻炎症小鼠腹腔毛细血管通透性。
本实验采用化学介质冰醋酸致炎的方法，改变了腹腔血管-组织屏障功能，使腹腔毛细血管通透性增加，血浆蛋白透入血管外组织速率加快，在此基础上静脉注射伊文思蓝染料，使之与毛细血管渗出物结合，通过检测光密度值，说明了虎杖提取物的抗炎作用，方法可靠，为进一步的临床研究提供了实验依据。
实验十虎杖提取物对纸片法致大鼠慢性非特异性炎症的影响 为观察虎杖提取物对大鼠慢性非特异性炎症的影响，取Wistar大鼠，将干燥灭菌滤纸片植入大鼠左肩部皮下1片，造成肉芽肿。植入纸片后第2天，用虎杖提取物15mg/kg、30mg/kg和60mg/kg三个剂量大鼠灌胃给药，每天1次，连续7天。末次药后1h处死大鼠取纸片及肉芽组织称重，观察虎杖提取物的抗炎作用。结果见表20。
表20虎杖提取物对大鼠慢性非特异性炎症的影响
注与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
结果显示，虎杖提取物大剂量与模型组比较，肉芽组织重量明显降低，经统计学处理差异有显著性。说明虎杖提取物对纸片法所致大鼠慢性非特异性炎症有明显的治疗作用。
另外安全性评价是很重要的内容。我们进行了一般药理学和毒理学 研究，对药物的临床前安全性作一系统评价。
一、一般药理实验 一般药理学的研究表明虎杖提取物对麻醉猫的心血管系统和呼吸系统没有影响。通过催眠作用实验法(对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响)、行为学实验法(对共济协调运动的影响)、镇静实验法(对自发活动的影响)的研究，结果表明虎杖提取物对小鼠中枢神经系统亦没有影响。
二、急毒实验 中药相对于化学药品而言毒性较低，但其无毒、低毒是相对的，因而严格合理的毒理学研究至关重要。针对虎杖提取物的急毒实验表明，小鼠灌胃给药的最大给药量为9g/kg，毒性较低。腹腔注射给药小鼠LD50值为0.7436g/kg。
三、长毒实验 1、虎杖提取物灌胃给药对大鼠的长期毒性试验。
观察不同剂量虎杖提取物对Wistar大鼠连续灌胃给药26周所产生的毒性反应程度。Wistar大鼠灌胃给药虎杖提取物45mg/kg、150mg/kg、750mg/kg，每天1次，每周6次，连续给药26周，停药观察4周。观察虎杖提取物对大鼠一般情况、体重、摄食量、血液学及血生化、尿常规等指标的影响，并于给药13周、26周及停药4周进行系统尸解，取主要脏器，计算脏器系数，进行病理组织学检查。结果显示，各组动物给药后一般观察无明显异常。给药期间摄食量虽有波动，但考虑为动物生长期自然波动；试验中后期各给药组体重低于对照组，其中大剂量组与对照组比较差异具有显著性；血液学指标及血清生化指标各给药组与对照组比较，个别指标差异有显著性，但均在正常范围内；其它指标如尿常规、脏器重量及脏器系数给药各组与对照组比较均差异无显著性，病理组织学检查未见明显异常。停药4周各给药组体重恢复正常，未见迟发毒性反应。可认为中剂量150mg/kg·d以下为安全剂量。
2.虎杖提取物灌胃给药对Beagle犬的长期毒性试验 以虎杖提取物小(22.5mg/kg)、中(75mg/kg)、大(375mg/kg)三个剂量分别灌胃给予Beagle犬，每天1次，每周6次，连续给药39周，停药观察8周。观察虎杖提取物对Beagle犬一般情况、体重、摄食量、心电图、血液学及血生化、尿常规等指标的影响，并于给药13周、26周、39周及停药8周进行系统尸解，取主要脏器，计算脏器系数，进行病理组织学检查。结果显示，虎杖提取物小、中、大三个剂量组动物，给药后无明显毒性症状。各个剂量组动物的体重均有增长，各给药组与对照组比较差异无显著性。心电图、尿常规各给药组与对照组比较差异无显著性，给药组血常规及血生化个别指标与对照组比较差异有显著性，但在正常范围内。给药39周后，处死动物，尸解肉眼未见异常，病理检察未见异常病变。说明各给药组动物在给药39周后，未见明显毒性反应。
具体实施例方式 用以下的实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。
[实施例1]虎杖提取物的优选制备方法 取虎杖药材(虎杖苷含量在2.55％)500g，粉碎成过10目筛的粗粉，用16倍药材重量体积的60％乙醇以0.6L/kg.h流速渗漉，提取液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05～1.08(60℃时)的浸膏，加6倍药材重量的去离子水溶解，离心(3000转/分，8分/次)，上清液以1L/kg.h流速过D-101大孔吸附树脂柱(柱径∶柱高＝1∶10，树脂重量为药材重量的1.5倍)，用6倍于D-101树脂体积的去离子水以1L/kg.h流速除杂，然后再用6倍于D-101树脂体积的10％乙醇以1L/kg.h流速除杂，最后用8倍于D-101树脂体积的20％的乙醇以0.8L/kg.h流速解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩并真空干燥(60℃，-0.09Mpa)，粉碎得虎杖提取物13.78g，二苯乙烯总苷含量为64.06％，二苯乙烯总苷转移率为69.25％。
[实施例2]虎杖提取物的优选制备方法 取虎杖药材(虎杖苷含量在2.55％)220kg，粉碎成过20目筛的粗粉，用14倍药材重量体积的60％乙醇以0.6L/kg.h流速渗漉，提取液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.05～1.08(60℃时)的浸膏，加6倍药材重量的去离子水溶解，离心(3000转/分，8分/次)，上清液以0.8L/kg.h流速过D-101大孔吸附树脂柱(柱径∶柱高＝1∶10，树脂重量为药材重量的1.5倍)，用6倍于D-101树脂体积的去离子水以1L/kg.h流速除杂，然后再用6倍于D-101树脂体积的10％乙醇以0.8L/kg.h流速除杂，最后用8倍于D-101树脂体积的30％的乙醇以0.8L/kg.h流速解吸，收集解吸液，减压回收乙醇，浓缩并真空干燥(60℃，-0.09Mpa)，粉碎得虎杖提取物6.35kg，二苯乙烯总苷含量为59.46％，虎杖苷含量为58.72％，二苯乙烯总苷转移率为67.02％。
[实施例3]本发明优选剂型胶囊剂的制备方法 取采用上述方法制得的虎杖提取物100克，粉碎过80目筛，加入药用淀粉40g，搅拌使混合均匀，喷入80％乙醇溶液，制软材，过40目筛制粒，60℃干燥，分装于1000粒3#胶囊中，质检，包装，即得。本品每粒含虎杖苷(C20H22O8)，不得少于50mg。[规格]140mg/粒；[功能与主治]清热解毒，通络止痛。用于风、寒、湿、热之邪侵入肌肉、关节、筋骨壅塞于经络，所致的气血凝滞，脉络痹阻。症见肢体关节疼痛剧烈，痛处焮红灼热，肿眼，筋络拘急，日轻夜重，伴发热、口渴、心烦、喜冷恶热、舌质红、苔黄燥。[用法与用量]口服，每日3次，每次1粒。
[实施例4]本发明优选剂型片剂的制备方法 取采用上述方法制得的虎杖提取物100克，研磨粉碎，过80目筛。加入过80目筛的药用淀粉40g，混合均匀，干燥后压成1000片(140mg/每片)，即得。本品每粒片剂含虎杖苷(C20H22O8)，不得少于50mg。口服，一次2粒，每日三次。
[实施例5]本发明优选剂型注射液的制备方法 取采用上述方法制得的虎杖提取物6.0g，加入注射用水约2800ml，65℃水浴使溶解，加入总配制量2.0‰活性炭(6.0g)，搅拌半小时，过滤，于滤器上加水至3000ml，继以0.45μm、0.22μm微孔滤膜分级过滤，滤液以每瓶10ml定量分装于西林瓶中(10ml/支，2mg/ml)，冷冻干燥，回充高纯度氮气，加塞，轧盖，包装，即得。
权利要求
1.虎杖二苯乙烯总苷在制备治疗风湿性疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物中虎杖二苯乙烯总苷的含量在55％以上。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是由虎杖二苯乙烯总苷和药学上可接受的辅料组成。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述药物为注射剂或口服剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述口服剂为胶囊剂或片剂，且虎杖二苯乙烯总苷含量在55％以上。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物为注射液，且虎杖二苯乙烯总苷含量在80％以上。
全文摘要
本发明属于中药新药研究开发领域，涉及一种治疗风湿性疾病的中药组合物，其主要成分为从我国传统中药虎杖中提取的有效部位虎杖二苯乙烯总苷。本发明首次将虎杖二苯乙烯总苷用于治疗风湿性疾病，治疗效果较好。
文档编号A61K36/704GK101194936SQ20071019574
公开日2008年6月11日 申请日期2004年11月19日 优先权日2004年11月19日
发明者周亚伟 申请人:周亚伟