专利名称：：突变的大肠杆菌不耐热肠毒素的制作方法突变的大肠杆菌不耐热肠毒素相关申请的交叉引用本申请要求2007年7月18日提交的美国专利申请11/779,419的优先权，该美国专利申请的内容在此引入作为参考。
背景技术：
：肠产毒性大肠杆菌菌林在人和家养动物中通过产生两种类型的肠毒素引起腹泻，这两种类型的肠毒素即不耐热毒素(LT)和耐热毒素(ST)(Hofstra等人，1984，O^m.259:15182-15187)。LT与霍乱毒素(CT)在功能、结构和免疫学上相关(Clements等人，1978，/"/e"./mmw".21:1036-1039)。LT和CT被合成为由5个相同的亚单位B和1个酶活性亚单位A组成的全毒素分子(AB5)(Spangler,1992，M〖cto&o.56(4):622-647)。B五聚体结合肠上皮细胞或其它任何含GM1的细胞的膜中的神经节苷脂GM1(vanHeyningen，1974,S"'e"ce183:656-657)。在亚单位B与细胞表面上的GM1结合后，亚单位A插入细胞溶质(cytosal)中，并且在其单二硫键处被蛋白水解切割和还原，从而产生酶活性的Al肽和较小的A2肽(FishmanPH1982，Szo/.69:85—97;Mekalanos等人，1979，C7^附.254:5855-5861;Moss等人，1981，/編.CA亂256:12861-12865)。Al肽能够结合NAD和催化Gsa的ADP-核糖基化，Gsa是一种与腺苷酸环化酶相关的GTP结合性调节蛋白(Spangler,1992，M/cra^o.iev.56(4):622-647)。发生的cAMP增加最终导致电解质和流体从受影响的细胞释放(Cheng等人，2000,18:38-49)。已证明LT作为粘膜佐剂起作用，并且诱导针对粘膜共施用的抗原的免疫应答(Clements等人，1988,r鹿'"e6:269-277;ElsonCO.1989,/画画/.To—146:29-33;Spangler,1992，M〖c油o.細.56(4):622-647)。但是，野生型LT的高毒性限制了它的临床应用。因此，希望产生具有降低的毒性而同时保留免疫原性的突变LT。本文使用的术语"大肠杆菌不耐热肠毒素"或"LT，，是指任何肠产毒性大肠杆菌菌抹产生的不耐热肠毒素。术语"大肠杆菌不耐热肠毒素亚单位A"或"LTa"是指LT的亚单位A。它包括含有信号肽的前体LTA和已除去信号肽的成熟LTA。
发明内容本发明基于以下意料之外的发现与野生型对应物相比，含有突变的LTa的LT表现出降低的毒性而同时保留免疫原性。这种突变的LTA在对应于野生型LTa第61位的位点处具有氨基酸置换，野生型LTA的氨基酸序列SEQIDNO:5在下文示出。因此，本发明提供一种分离的多肽，其包含在对应于SEQIDNO:5第61位的位点处含有除S、T和F之外的氨基酸残基的突变LTA。置换氨基酸残基可以是D、E、H、I、K、L、N、P、Q、R、Y或W。它可以是天然存在的氨基酸，也可以是非天然存在的氨基酸，例如D-氨基酸或(3-氨基酸。在一个实例中，LTa具有SEQIDNO:2、4、8或10的氨基酸序列。含有这种突变LTA的LT表现出降低的毒性，即，小于含有SEQIDNO:5的野生型LT的10-5倍。在另一方面，本发明提供含有抗原和上述突变LTa的疫苗。该疫苗可以进一步包含LT亚单位B,该LT亚单位B与突变的LT八形成完整的LT蛋白质。抗原可以来源于细菌或病毒。在另一方面，本发明提供包括编码上述LTA突变体的核苷酸序列的分离的核酸。在一个实例中，该核苷酸序列是SEQIDNOs:1、3、7或9。本发明的范围内还包括包含以上描述的核酸的载体和含有该载体的转化细胞。本发明的一个或多个实施方案的细节在说明书以下部分描述。根据说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将是显然的。发明详述解毒的LT,例如含有突变LTa的解毒的LT，由于其高免疫原性而是理想的疫苗佐剂。设计用来实现该目的的本发明的突变LTa是通过在L丁a中对应于SEQIDNO:5第61位的位置处引入氨基酸置换而制备的。不同肠产毒性大肠杆菌菌林产生的LTa是高度同源的。因此，通过比较LTa的氛基酸序列与SEQIDNO:5，本领域技术人员可以发现该LTA中的哪个位点对应于SEQIDNO:5的第61位。就象SEQIDNO:5的LTa—祥，几乎所有野生型L丁a都在对应于SEQIDNO:5第61位的位置处包含丝氨酸。可以-使用例如在大小或极性方面与丝氨酸不同的氨基酸作为亚取代物。亚取代氨基酸的例子包括疏水性氨基酸残基(例如，I和L)、带电荷的氨基酸残基(例如，D、E、K、R和H)或具有大侧链的氨基酸残基(例如，N、Q、Y和W)。脯氨酸也可以用作亚取代物，因为它通常改变多肽的局部结构。亚取代氨基酸包括非天然存在的氨基酸，例如，D-氨基酸或P-氨基酸。本发明的LTA突变体可以通过本领域公知的方法制备。例如，通过重组方法如下产生该突变体。从肠产毒性大肠杆菌菌林中分离编码野生型LTa的cDNA,并进行定点诱变，以产生编码所需LTA突变体的cDNA。参见Ho等人，Gene,77:51-59,1989。然后将携带突变的cDNA插入表达载体中用于转化细胞。最后，纯化在转化细胞中产生的LTA突变体，与LT亚单位B装配，以形成完整的LT蛋白。含有上述LTA突变体的LT的毒性可以使用诸如Y-l肾上腺细胞测定的试验进行评估。参见Cheng等人，Vaccine,18:38-49,2000。本发明的L丁a突变体可以用作疫苗中的佐剂。疫苗(即，人疫苗或兽用疫苗)可以含有抗原和LTA突变体本身或含有LTA突变体的LT。抗原可以来源于细菌，例如，酉良脓《连j求菌(Streptococcuspyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、淋病奈瑟球菌(Neiseriagonorrhoea)、月亩月莫炎奈瑟；求菌(Neisseriameningitides)、白喉才奉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、肉毒冲炎菌(Clostridiumbotulinum)、产气荚膜4炎菌(Clostridiumperfringens)、石皮伤风才炎菌(Clostridiumtetani)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、臭鼻克雷伯菌(Klebsiellaozaenae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、大肠4干菌(Escherichiacoli)、^同纟录々支单月包菌(Pseudomonasaeruginosa)、空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)、嗜水气单月包菌(Aeromonashydrophila)、错^]犬芽孑包4干菌(Bacilluscereus)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、苍白密螺S走体(Treponemapallidum)、奋森i危虫累"走体(Borreliavincentii)、4白氏j^t螺j走体(Borreliaburgdorferi)、结斗亥分沖支才干菌(Mycobacteriumtuberculosis)、卡氏肺嚢虫(Pneumocystiscarinii)、支原体(Mycoplasmaspp.)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazeki)、衣原体(Chlamydiaspp.)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)。它也可以来源于病毒，例如，流感病毒、单纯疱渗病毒、人免疫缺陷病毒、巨细胞病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、EB病毒、水痘带状疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、肠道病毒或日本脑炎病毒。疫苗可以进一步含有药学可接受的载体，如磷酸盐緩沖液或碳酸氢盐溶液。载体的选择基于给药方式和途径和标准药学实践。合适的药物载体和稀释剂以及用于其中的药剂辅料在Remington'sPharmaceuticalSciences中有描述。制备疫苗的方法在本领域中公知，如美国专利4,601,903、4，599，231、4,599,230和4,596,792中所举例说明的。疫苗可以制备为可注射物，如液体溶液或乳剂。抗原和LTa突交体或含有它的LT可以与生理学可接受的赋形剂混合，该赋形剂可以包括水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。疫苗可以进一步含有少量的辅助物，如湿润剂或乳化剂，或pH緩冲剂，以提高疫苗的有效性。疫苗可以通过皮下或肌肉内注射经肠胃外给药。此外，其它给药方式，包括栓剂、口服或局部制剂，也可能是希望的。对于栓剂，粘合剂和载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇类(polyalkaleneglycols)或甘油三酯类。口服制剂可以包含通常使用的赋形剂(incipients)，例如，药物级别的糖、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶嚢、持续释放制剂或粉末的形式。疫苗以与剂量制剂相匹配的方式并且以治疗上有效的、保护性的和免疫原性的量给药。给药量取决于所治疗的对象，包括，例如，个体免疫系统合成抗体的能力，以及需要时，产生细胞介导的免疫应答的能力。需要施用的活性成分的精确量取决于医生的判断。但是，合适的剂量范围可由本领域技术人员容易地确定，并且可以是微克数量级的本发明的多肽。用于初次给药和加强剂量的合适的方案也是可以变化的，但是可以包括初次给药以及随后的后续给药。疫苗的剂量也可以取决于给药途径，并且根据宿主的大小而变化。下面的具体实施例应理解为只是说明性的，而绝不是以任何方式限制其余的公开内容。不需要进一步的详细说明，可以相信，本领域技术人员基于此处的记载就可以最大限度地利用本发明。此处引用的所有出版物在此全文引入作为参考。实施例1:构建编码野生型LTa和LT突变LTa的基因将LT基因的1.8-kbDNA片段，包括亚单位A和亚单位B，从人肠产毒性大肠杆菌H10407中分离出来，并克隆到pBluescriptIIKS(-)载体(pBluescript-LThWT)中。LT基因(编码亚单位A和B)的核苷酸序列(SEQIDNO:6)和该LT的亚单位A的氨基酸序列(SEQIDNO:5)如下所示LT的核苷酸序列(SEQIDNO:6)(亚单位A:1-777;亚单位B:774-1148):taactttcataccgtgctga120atgcccagagggcat貼tgei180240tctcttsgtttg3g33gtgc300t3Ct3t3t3tatgttstagc360gtettacagccctceicccsta420csgatatstggatggtatcg橋g3g3ccggt3540ag3ttagcsggtttcccacc600gttgtggaaa660tg3gc3c3at720ttttcagactatcagtcaga780ttaitgtttt3840ccc3gtcteit900atcatatacg960tt貼g3gcggcgcaaceittt10201080ttg3t333ttatgtgtatgg1140aaaactagctctagacccgtacttcgatasccggcttttcacttagcatgtt貼ttttggatcaccaattcatcaeiga3t3tctC3gggg七tgscatatttscggcgttgttcggastgaatcgatggcaggtcgasg3gagg貼ctcgtttctgcgtggtgtgsttgctg貼tatsggcttggsg3gacaeittacagt3ctstcctc3tcgc3acsccaggcaaaagtcccgggc3gCCCCC33ttCtasaacgttcatgacggatatattstcsggtaggtggaatatgaacgsttctccggc3gsaagaaccctggtgatacttgcaa3sgtta3ttcggaatgatcteitgtgc3acaaatatatagswtggttcggaggtcttt33tcttt3ttgtttccsct3t3ttCC3Cttgtattsggcaccatattctggstggttacgaittcatc3ttacggagctcgactcccaaasattgcggcraatcsgtatg成熟LTa的氛基酸序列(SEQIDNO:5):NGDKIjYRADSRPPDEIKKSGGIjMPKGHNEYFDRGTQMNINIiYDHARGTQrGFVRYDDGYV60STSLSLRSAHLAGQSILSGYSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGVYSPHPYEQEVSALGGIP120YSQIYGWYRVNFGVIDERIiHRNREYRDRYYRNIiNIAPAEDGYRIjAGFPPDHQAWREEPW工180HHAPQGCGNSSRT工TGDTCNEETQN!LST工YIiRKYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNR工RNE:L2409使用定点诱变法(Ho等人，1989,77,51-59)构建各种LTA突变体。更具体来说，通过分别用K、R、H、Y和F替换SEQIDNO:5第61位的丝氨酸构建LTa突交体，包括LTA(S61K)、LTa(S61R)、LTa(S61H)、LTa(S61Y)和LTa(S61F)。利用以下寡核普酸引物构建这些突变体LTA(S61K)[5，TCTCAAACTAAGAGAAGTTTTAACATATCCGTCATCATA3'](SEQIDNO:ll),LTA(S61R)[5，ACTTCTCAAACTAAGAGAAGTTCTAACATATCCGTCATC3'](SEQIDNO:12),LTA(S61F)[5，ACTTCTCAAACTAAGAGAAGTGAAAACATATCCGTCATC3'](SEQIDNO:13)，LTA(S61Y)[5，ACTTCTCAAACTAAGAGAAGTATAAACATATCCGTCATC3'](SEQIDNO:14)，LTA(S61H)[5，ACTTCTCAAACTAAGAGAAGTATGAACATATCCGTCATC3'](SEQIDNO:15)。这些LTA的核苷酸序列和氨基酸序列如下所示LTA(S61K)的核苷酸序列(SEQIDNO:1):￡ttg3￡iswt￡itssctttcsttttttttsttttstteigcstcgccsttetaLtgcseistggc60gscaaattat120atgcccagag180gatcacgcga240tctcttagtt300360gtst3csigcc420cagstatatg權540agattagcag6006603cccag3atc720ttttcsgsct777accgtgctgatgagaagtgcatgttatsgcctcacccatagsitggtatcggsgsccggtagtttccceiccgttgtgg貼3tgsgcacsatctctsgacccgtacttcgsta3ccggcttttcscttsgcagacagcaccatgaacaggagtgttaattttttcstcsaga3t3tctcaggccagatgaaaagaggaactcgtcagsttatgggscsgtctagtttctgcgtggtgtgattgctga3te1te1ggcttggsgagacwttscagtaaascgttc3tgacggatat3tt3tcsggtsggtggwt3tgs3cgsttctccggcaga33gssccctggtg3tacttgcggaggtcttt貼tctttsttgttaaasct3t3ttCC3Cttgta七tsggcsccatsttctggatggttacg3ttC3tC3ttei3tgsggagatcagtcagaggttgacatatataacagaattcggaatgaattatgaLTA(S61K)的氨基酸序列(SEQIDNO:2):NGDK!LYRADSRPPDEIKRSGGIjMPRGHNEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRYDDGYV60KTSLSLRSAHLAGQSILSGYSTYYIYV工ATAPNMFNVNDVLGVYSPHPYEQEVSALGGIP120YSQIYGWYRVNFGVIDER!LHRNREYRDRYYR肌NIAPAEDGYRLAGFPPDHQAWREEPWI180HHAPQGCGNSSRTITGDTCNEETQNIjSTIY!LRKYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRNEIi240LTA(S61R)的核苷酸序列(SEQIDNO:3):atgaaaaatataactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaatggc60120atgcccagag1803ccgtgctgsggcatsatgatgagasgtgcstgttstagcctcacccataggitggtstcgg3gsccggt3gtttccc3ccgttgtggaaatgagcacaatctctsgscccgtacttcgatssccggcttttC3cttsgc3gacagcaccatgtt貼ttttgg3tC3CC33ttcatcaags3t3tctcagggatcacgcga240tctcttsgtt300t3Ct3t3t3t360420cagatat3tg綱agggaatata540agattagcag600gcscc3C33g660acccagaiatc720ttttcagactatcagtcagaggttgacatatataacagaattcggaatgaiattatga777gtcagatatggg3C3gtct3貼tstgtttagtttctgcgtggtgtgattgctgwtataggcttggsgagacaattacagt3tt3tcsggtsggtgg貼tctccggcag3gtgatscttgcggsggtcttt33tCttt3ttgttsg36ictatattccscttgtattaggcaccatattctacatcgtaacggatggttacgattcatcattsatgaggagLTA(S61R)的氨基酸序列(SEQIDNO:4):NGDKLYRADSRPPDEIKRSGGIiMPRGHNEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRYDDGYV60RTSLSLRSAHLAGQSILSGYSTYY工YVIATAPNMFNVNDVLGVYSPHPYEQEVSALGGIP120YSQIYGWYRVNFGVIDERLHRNREYRDRYYRNUSIIAPAEDGYRLAGFPPDHQAWREEPWI180HHAPQGCGNSSRTITGDTCNEETQNIiSTIYLRKYQSKVKRQIFSDYQSEVD工YNRIRNEIj24011LTa(S61H)的核普酸序列(SEQIDNO:7):atgaaaaatataactttcattttttttatttt3ttagcatcgccattatatgcaaatggc60120atgcccsgag180240tctcttagtt300t3Ct3t3t3t360gtat3cagcc420cagsitstatg480540600gcsccsc貼g660720ttttcagactatcagtcagaggttgac3tststaacagaattcggaatgaattatga7773ccgtgctgactctagaccccc3g3tgsa3cggsggtcttggceitaatgsgtacttcgatt貼tctttat3accggctttgtcagatatgatgacggatatgttcstscttC3Cttagcsggacsgtctatattatcagg3t3ttCCSCtgacagcacca3atatgtttaatgttaatgatgt3tt3ggcCtC3CCC3t3tg33c3gg3ggtttctgcgttsggtgg33taccatsttctgeitggt3tcgtgtt33ttttggtgtg3ttgg3gsccgg七3ctccggcagaggatggttacgtttcccsccgcttggagag3sga3ccctggattcatcatgttgtgg3貼gtgst3Cttgtgagcacaat3tstctcagggaggcagataLTA(S61H)的氨基酸序列(SEQIDNO:8):NGDK:LYRADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNEYFDRGTQMNINIiYDHARGTQTGFVRYDDGYV60HTS:LSIiRSAHLAGQSILSGYSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLiGVYSPHPYEQEVSALGGIP120YSQ工YGWYRVNFGV工DERIiHRNREYRDRYYRNLNIAPAEDGYRIiAGFPPDHQAWREEPWI180HHAPQGCGNSSRTITGDTCNEETQNIjST工YIjRKYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRNEL;240LTA(S61Y)的核苷酸序列(SEQIDNO:9):atgaaaaata120atgcccagag180gatcscgcgei240tctcttsgtt300360gtst3C3gcc420480agggaatata540600660acccagaatc720ttttcagact777taactttcattttttttattttattagcatcgccattatatgcaaatggc60ccagatgaastaaaacgttccggaggtctt3ccgtgctgsggcataatgatgsgseigtgcatgttstagcCtC3CCC3t3gatggtatcggtttcccaccgttgtggei￡i3tgagcacaatctctsgscccgtacttcgataaccggcttttceLcttagc6tgacagcaccatgttsattttggatcaccaattcatcaagsst3tctC3ggsg2tgg貼ctcgtcsgst3tgggsc3gtct3貼tstgttt3gtttctgcgtggtgtgattgctgwteitaggcttggsgagaastatcaatt3tt3tcdggatgttsatgaatgaacgattctccggcagaaagaaccctggtgstacttgcaasagttaataatctttattgttt3t3Ctatattccscttgtattaggcsccat3ttctggstggtt5icatcagtcagaggttgacstatataacsgaattcggaatga3ttatgaLT八(S61Y)的氨基酸序列(SEQIDNO:10):NGDKLYRADSRPPDEIKRSGGLMPRGHNEYFDRGTQMNINLYDHARGTQTGFVRYDDGYV60YTSLSIiRSAHLAGQSILSGYSTYYIYVIATAPNMFNVNDVLGVYSPHPYEQEVSALGGIP120ysqiygwyrvnfgviderlhrnreyrdryyrnlniapaedgyrlagfppdhqawreepw工180HHAPQGCGNSSRTITGDTCNEETQNLSTIYLRKYQSKVKRQIFSDYQSEVDIYNRIRNEL240为了比较，也通过用赖氨酸替换亚单位A的氨基酸位点63处的丝氨酸构建了来源于EWD299的另一个LT突变体LTp(S63K)(Dallas等人，1979，/.5""eho/.139,850-859)。实施例2:制备野生型LT和含有突变LTa的LT用含有天然或突变LT基因(包括亚单位A和亚单位B的基因)的pBluescriptIIKS(-)载体转化大肠杆菌HBIOI。在含有补充有100lag/ml氨苄青霉素的L-肉汤的3升摇瓶中培养过夜，从其培养物中纯化天然和突变LT。通过离心收集细胞，将其重悬浮于TEAN緩13冲液(0.2MNaCl,50mMTris，1mMEDTA和3mMNaN3，pH7.4)，并用《效射流均质才几(microfluidizer)(MicrofluidicsCorporation,USA)裂解。经离心澄清裂解液后，通过添加固体石克酸铵至65%饱和将LT分级分离。然后将制品悬浮在TEAN緩沖液中，对相同的緩冲液充分透析，并用作粗LT。粗LT于4。C在用TEAN緩沖液平衡的固定化D-半乳糖(Pierce,Rockford,IL)柱上进行层析(Uesaka等人，1994,Mkro^a/尸W/ogeww^16:71-76)。用TEAN中的0.3M半乳糖洗脱天然和突变LT。每种纯化的毒素对PBS緩沖液透析，用于生物学和免疫学分析。纯化的野生型和突变LT通过SDS-PAGE分离，其中LT亚单位A的分子量约为28-29kDa,LT亚单位B的分子量约为12-13kDa。含有LTa(S61K)的完整LT(即LTh(S61K))和含有LT八(S61R)的LT(即LTh(S61R))的收率类似于含有SEQIDNO:5的LTA的LT。LT的AB5杂六聚体和Bs五聚体通过pH3-10等电聚焦凝胶(invitrogen)分离。AB5和B5蛋白带的强度通过UVIBand软件(UVItecLimited)进行分析，以计算ABs杂六聚体和B5五聚体的百分比(ABs的等电点(pl)值介于8.0和7.8之间，B5的pl值介于8.3和8.1之间)，结果在表1中列出。表l.野生型LT和含有突交LTa的LT的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>纯化的LTh(S61K)和LTh(S61R)的ABs的百分比约为90-100%。实施例3:确定野生型LT和含有突变LTA的LT对细胞内cAMP水平的影响Caco-2细胞(ATCCHTB-37)以每孔5乂104个细胞的浓度在24孔板中在补充了20%FBS的MEM-ot培养基中维持，生长至接近铺满，并在5%C02下在含有1%FBS和lmM3-异丁基-1-甲基黄噪呤(IBMX)的MEM-a中温育30min，然后添加毒素(Grant等人，1994,InfectionandImmunity62:4270-4278)。向每孑L力口入天纟《或突变LT,并且温育4小时。然后用冷PBS洗涤细胞两次。通过向每孔加入200I^IO.INHCI并在室温下温育15分钟提取细胞内cAMP。向每孔加入0.1NNaOH后收集细胞裂解液的上清液(Cheng等人，2000,Facc/"e18:38-49;Park等人,1999,五jc/m'総由/Mo/ecw/arMeAc/we31:101-107)。用cAMP酶免疫测定试剂盒(Assaydesigns;Correlate-EIA)测定cAMP。从该实施例获得的结果显示，LTh(S61K)没有提高细胞内cAMP的浓度。实施例4:利用Yl肾上腺肿瘤细胞分析测定含有突变LTa的LT的毒性在本研究中，评价LT样品的肠毒性效应，这些LT样品包括野生型LT、LT活性位点突变体(h61K)和LT亚单位B复合物B5。在补充了15%马血清、2.5%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1.5g/L碳酸氢钠的Ham，sF12培养基中维持的小鼠Y-l肾上腺肿瘤细胞(ATCCCCL-79)以每孔2x10"个细胞(200ul/孔)的浓度接种到96孔平底板中，于37。C、5%C02+48小时。96孔平底板中的细胞用lxPBS(pH7.4)洗涤两次，然后在37。C、5%C02下用系列稀释的LT样品(10jug/200pi~10-10)ug/200jLd)处理过夜。毒素处理24小时后用光学显微镜检查细胞的典型细胞变圆(cellrounding)。活性定义为启动细胞变圓所需的毒素的最小浓度(ECi)或50%细胞变圆所需的毒素浓度(EC50)。参见David等人，1975，InfectionandImmunity,11:334-336;Cheng等人，1999，Vaccine18:38-49。LTh(S61K)、LTh(S61R)、15LTh(S61H)的毒性显著低于野生型LT,即，10-6比1。参见下面的表2。LTh(S61F)的毒性也较低(即10—5)，但是其降低程度没有其它突变体那么明显。表2含有野生型或突变的LTa的LT的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例5:通过兔回肠袢试验测定含有突变LTa的LT的毒性该i式马全长口以前戶斤述进4亍(Giannelli等人，1997,/"/ec"o"a"c/65:331-334;Giuliani等人，1998，丄五x/7.MeA187:1123-1132)。各重约2.5Kg的新西兰成年兔用于该试验。通过在兔小肠末端开始，并向胃移动，形成各长5cm的袢。将含有不同含量的LT或LT突变体的0.5ml样品注射到各个袢内，然后闭合腹部。18小时后，收集并测量每个袢中积累的液体。实验进行三次，结果以毫升/厘米表示。来自该实验的结果显示，500吗LTh(S61K)在兔回肠袢中只积累lml流体，积累的流体的体积类似于天然对照。当使用O.l吗野生型LT时，野生型LT积累的流体的体积显著大于LTh(S61K)。另夕卜，其它LTp(S63K)的流体积累也显著大于LTh(S61K)。实施例6:测定含有突变LTa的LT在鼻内免疫中的佐剂效应在该实施例中使用灭活的流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)(PR8)(ATCCVR-95)。病毒颗粒如以前所述制备(Aitken等人，1980,五wr/肠c/z缀107:51-56;Gallagher等人，1984，C/Zw.M/cro編.20:89-93;Johansson等人，1989，《/.Wro/.63:1239-1246)。简要地说，病毒在35°C下在10天大的鸡胚胎蛋的尿嚢腔中繁殖2天。将来自感染PR8的鸡蛋的尿嚢液首先低速离心，然后以96,000xg离心1小时，以沉淀病毒颗粒，将该病毒颗粒重悬浮在磷酸盐緩冲液(PBS)中。将这些颗粒加载到30-60%蔗糖密度梯度上，并以96,000xg离心5小时。收集含有病毒的级分并用PBS稀释。病毒进一步以96，000xg沉淀1小时，并重悬浮在PBS中。纯化的病毒用0.025%曱醛在4°C下处理一周。基于光密度通过Bio-Rad蛋白质分析测定并标准化蛋白质浓度，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Oxford等人，1981,/.历o/.^""d.9:483-491)测定血细胞凝集素(HA)的含量。6-8周大的雌性BALB/c小鼠,人台湾NationalLaboratoryAnimalCenter获得。各由5只小鼠组成的组在麻醉下用含有单独的或与8天然或突变LT联合的20|Lig灭活流感病毒(flu.Ag)的25(alPBS鼻内免疫。三周后再免疫小鼠。对照小鼠在相同条件下给予PBS。最后一次免疫两周后，杀死各组的小鼠，获得血清并进行血细胞凝集抑制(HI)试验。与单独用灭活病毒疫苗鼻内免疫的小鼠相比，在用灭活病毒疫苗联合LTh(S61K)或LTp(S63K)鼻内免疫的小鼠中检测到显著提高的HI滴度。LTh(S61K)联合灭活病毒的HI滴度显著提高。LTh(S61K)联合病毒的HI滴度为813,类似于LTh(S63K)联合病毒的HI滴度，但是大于单独病毒的HI滴度。实施例7:测定含有突变LTa的LT在肌肉内免疫中的佐剂效应除了免疫采用肌肉内施用以外，重复在实施例6中进行的程序。肌肉内疫苗在含有单独的或与4fig天然或突变LT联合的10iug灭活病毒疫苗的50piPBS中制备，并注射到股后肌(posteriorthighmuscle)中。免疫和采样程序如前所述进行。LTh(S61K)联合灭活病毒的HI滴度显著提高。LTh(S61K)联合病毒的HI滴度为512，显著高于野生型LT联合病毒或单独的病毒的HI滴度。其它实施方案本说明书中公开的所有特征可以任意组合。本说明书中公开的每个特征可以用具有相同、等同或类似目的替代特征来代替。因此，除非另外明确说明，公开的每个特征只是总的一系列等同或类似特征的一个实例。基于上述描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种应用和条件。因此，其它实施方案也在以下权利要求的范围内。权利要求1.一种分离的多肽，其包含突变的大肠杆菌不耐热肠毒素亚单位A，突变位点对应于SEQIDNO5的第61位，并且该位点是除S、T和F之外的氨基酸残基，其中含有该突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素与含有SEQIDNO5的野生型大肠杆菌不耐热肠毒素相比具有降低的毒性。2.权利要求l的分离的多肽，其中含有所述突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素具有低于野生型大肠杆菌不耐热肠毒素的io-6倍的毒性。3.权利要求1的分离的多肽，其中所述氨基酸残基选自K、R、H和Y。4.权利要求l的分离的多肽，其中所述突变的亚单位A具有选自SEQIDNO:2、4、8和10的氨基酸序列。5.—种含有抗原和佐剂的疫苗，该佐剂为突变的大肠杆菌不耐热肠毒素亚单位A，其突变位点对应于SEQIDNO:5的第61位，并且该位点是除S、T或F之外的氨基酸残基，其中含有该突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素与含有SEQIDNO:5的野生型大肠杆菌不耐热肠毒素相比具有降低的毒性。6.权利要求5的疫苗，其中所述抗原来自细菌或病毒。7.权利要求6的疫苗，其中所述细菌选自肺炎链球菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、脑膜炎奈瑟球菌和b型流感嗜血杆菌。8.权利要求6的疫苗，其中所述病毒选自流感病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、肠道病毒禾口4仑y犬病毒。9.权利要求5的疫苗，其中所述含有突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素具有低于野生型大肠杆菌不耐热肠毒素的l(T6倍的毒性。10.权利要求5的疫苗，其中所述亚单位A突变体在对应于SEQIDNO:5第61位的位点处含有K、R、Y或H。11.权利要求5的疫苗，其中所述亚单位A突变体在对应于SEQIDNO:5第61位的位点处含有K。12.权利要求5的疫苗，其中所述亚单位A突变体在对应于SEQIDNO:5第61位的位点处含有R。13.权利要求5的疫苗，其中所述亚单位A突变体含有选自SEQIDNO:2、4、8和10的氨基酸序列。14.权利要求5的疫苗，进一步包含LT亚单位B，其中亚单位A突变体和亚单位B形成完整的大肠杆菌不耐热肠毒素。15.—种分离的核酸，其包含编码突变大肠杆菌不耐热肠毒素亚单位A的核普酸序列，其对应于SEQIDNO:5第61位的位点为除S、T或F之外的氨基酸残基，其中含有突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素与含有SEQIDNO:5的野生型大肠杆菌不耐热肠毒素相比具有降低的毒性。16.权利要求15的核酸，其中所述含有突变亚单位A的大肠杆菌不耐热肠毒素具有低于野生型大肠杆菌不耐热肠毒素的io-6倍的毒性。17.权利要求15的核酸，其中所述氨基酸残基选自K、R、Y和H。18.权利要求5的核酸，其中所述核苷酸序列选自SEQIDNO:l、3、7和9。19.含有权利要求15的核酸的载体。20.含有权利要求19的载体的转化细胞。全文摘要本发明涉及能够用作佐剂的突变大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)亚单位A。该亚单位A突变体在对应于野生型LT第61位的位点处含有氨基酸置换。含有该突变亚单位A的LT显示比其野生型对应物降低的毒性。文档编号A61K39/02GK101687026SQ200780053210公开日2010年3月31日申请日期2007年8月13日优先权日2007年7月18日发明者徐悠深,林阳生,阮大同申请人:财团法人生物技术开发中心