专利名称：：一个蒲公英木质素酸用于抑制乙酰胆碱酯酶的药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及有机化学领域，具体而言，涉及从多种蒲公英药材中分离得到的一个木质素酸用于防治老年性痴呆的药物用途。该化合物，即蒙古蒲公英酸A具有强效抑制乙酰胆碱酯酶的生物活性，因此该化合物及其可药用的盐，以及含有该化合物的药物组合物，可预期作为防治老年性痴呆药物用途。
背景技术：
：蒲公英药材为菊科植物蒙古蒲公英蒲公英(7krarac，，，2ic鹏Hand-Mazz)或同属数种植物的干燥全草，为清热解毒中药，临床上常用于治疗急性乳腺炎、淋巴腺炎、疔毒疮肿、急性结膜炎、感冒发热、急性扁桃体炎、急性支气管炎、肝炎、肿囊炎及尿路感染等疾病。现代天然产物化学对蒲公英属植物的化学成分和生物活性研究发现，该生药具有高效的抗炎作用，具有较高的研究和开发价值。乙酰胆碱酯酶(AChE)又称为真性或特异性胆碱酯酶，位于神经细胞、骨骼肌、平滑肌、各种腺体和血红细胞。乙酰胆碱(ACh)在脑中维持一定的水平对人体记忆功能有重要作用。AChE在脑内的生理作用是迅速使乙酰胆碱水解并失活。所以，抑制乙酰胆碱酯酶是治疗老年性痴呆的方法之一。根据抗炎药物可以影响老年性痴呆疾病发展的思路，我们从菊科蒲公英属植物之根、茎、叶、花各部位提取物中，用乙酰胆碱抑制作用为筛选指标，活性追踪提纯其最有效抑制乙酰胆碱酯酶的部位，并从中得到抑制乙酰胆碱酯酶作用最强的单体化合物，经化学测定其结构为蒙古蒲公英酸A，从而提供了可期待用于制备与乙酰胆碱缺失引起或有关的生理改变或疾病的治疗药物及预防保健品。其中，与乙酰胆碱缺失引起或有关的生理改变或疾病包括但不限于老年性痴呆症(俗称阿兹海莫症，Alzeimer'sDisease)。本发明说明从清热解毒的中药资源中发现新的老年性痴呆药物尤其是乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物具有实际的应用价值。
发明内容本发明的目的是提供蒙古蒲公英酸A的乙酰胆碱酯酶抑制活性。本发明的另一目的是提供蒙古蒲公英酸A及其可药用的盐用于制备预防和治疗由乙酰胆碱(ACh)在脑中缺失造成的人体记忆功能障碍和与之相关疾病，特别是老年性痴呆的药物用途。本发明的另一目的是提供了含有蒙古蒲公英酸A的药物组合物。本发明通过从菊科蒲公英属植物中提取制备得到所述的木质素酸化合物，具体结构如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>称为蒙古蒲公英酸A，即"6，9，IO-三羟基-氧杂蒽-1，2-二羧酸"。蒙古蒲公英酸A来源于菊科植物蒲公英的各个部位，优选从中国药品市场上常见的蒲公英药材，例如蒙古蒲公英(TaraxacummongolicumHand-Mazz)、碱地蒲公英(TaraxacumsinicumKitag)、热河蒲公英(TaraxacumplatypecidumDiels)、东北蒲公英(TaraxacumohwianumKitag)、反複蒲公英(TaraxacumgrypodonDahlst)、兴安蒲公英(TaraxacumfalcilobumKitag)制备而得。优选药材的全草，包括根茎、叶、花，可以是干品或鲜品。最优选蒙古蒲公英和/或碱地蒲公英的全草部分，本发明之说明书中均简称蒲公英。以往的植物化学研究发现蒲公英属植物中主要含有三萜类、香豆素类、酚酸类(包括含酚羟基的黄酮类)、倍半萜类、植物甾醇类、胡萝卜素类和长链脂肪酸类化合物。本发明人以乙酰胆碱酯酶抑制率为生物活性筛选模型，对该植物的各提取部位进行筛选，并通过多种正、反相层析手段对最强效抑制乙酰胆碱酯酶部位跟踪筛选得到该有效抑制乙酰胆碱酯酶的活性化合物，并经红外、质谱、紫外和核磁共振波谱等综合解析推导出其化学结构为木质素酸化合物。本发明得到的该木质素酸成分，即蒙古蒲公英酸A具有强效抑制乙酰胆碱酯酶的作用，提供了可期待用于制备与乙酰胆碱缺失引起或有关的生理改变或疾病的治疗药物及预防保健品，包括但不限于防治老年性痴呆症的医药或保健品用途。本发明的蒙古蒲公英酸A或其可药用盐及其溶剂化物可以与药学上常用的辅料或载体结合，制备得到具有蒙古蒲公英酸A抑制活性从而可以用于防治老年性痴呆疾病的药物组合物。上这种药物组合物可以采用片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等剂型药物；还可以采用现代制药界所公知的控释或缓释剂型或纳米制剂。本发明的有益之处是蒲公英为中药常见药材，从中提取分离强效的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其制备过程简便、成本低廉、低污染，并且符合医药市场上回归自然的趋势，因此具有较好的市场化前景。具体实施方式下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。实施例l:蒙古蒲公英酸A的制备(1)仪器与试剂熔点用北京泰克公司生产的显微熔点仪测定，温度未校正；旋光在日本产Polax-2L型自动旋光仪上测定；红外光谱(IR)由BrukerVector-22红外光谱仪测定，经KBr压片；紫外光谱用ShimadzuUV-240紫外分光光度计测定；核磁共振氢谱CH-NMR)，核磁共振碳谱。C-NMR)和二维核磁共振波谱(2DNMR)由IN0VA型超导核磁共振波谱仪(VARIANINOVA-400MHz)测定(四甲基硅醚为内标)；电喷雾质谱(ESI-MS)由BrukerEsquire3000+质谱仪测定，柱层析用硅胶(100-200，200-300和300-400目)以及薄层层析用硅胶GF254(10-40目)均购自青岛海洋化工厂；柱色谱用聚酰胺(14-30目和100-200目)采用浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂产品；葡聚糖凝胶(S印hadexLH-20)采用瑞典AmershamPharmaciaBiotechAB公司产品；反相硅胶(RP-18)采用日本FujiSilysiaChemical公司的Chromatorex产品；MCI为日本三菱化工公司产品；所用试剂均为分析纯，其中石油醚沸程为60-9(TC;薄层制备层析(PTLC)采用Merck公司的铝箔硅胶板，薄板(TLC)检测用254nm和365nm的紫外灯；显色剂用碘蒸气、10%硫酸-乙醇、2%三氯化铁-甲醇、磷钼酸以及溴甲酚绿溶液。(2)植物来源与鉴定供提取用蒲公英药材为蒙古蒲公英(7araX3CW历7Z70/7^h'CLffl7Hand.-Mazz.)的全草(2001年8月购于安徽亳州药材市场)。(3)提取与分离样品(干重5.0公斤)粉碎后用75%工业酒精沸水下热提两次，提取液冷却后合并，经减压浓縮得462克棕褐色粘稠状粗提物。将粗提物用甲醇溶解，大孔树脂(D-101型)拌样，在旋转蒸发仪上减压除去甲醇，以变色硅胶为干燥剂，4(TC真空干燥过夜，加样到水平衡好的D~101柱中，收集50%甲醇-水洗脱部位，将洗脱液浓縮至干，再用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分配萃取。各有机层减压蒸干后分别得3克，32克，127克浸膏，余为水部位。(4)各提取部位对乙酰胆碱酯酶的活性测定将雄性Wistar大鼠断头处死，迅速分出大脑，分离纹状体并称重，加19倍体积的0.05摩尔/升磷酸缓冲液(pH7.2，大约7毫克蛋白/毫升)用匀浆器匀桨。取混悬液25微升加1毫升溶剂或不同浓度的试验药物，在37'C水浴中预孵10分钟。加入10毫摩尔浓度二硫一双硝基苯甲酸10微升，405nm波长处比色。以他克林(Tacrine)为阳性对照，测试了蒲公英石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位粗提物对AChE的抑制活性。发现在乙酸乙酯部位在0.05毫克/毫升浓度下对AChE活性最强，有28%的抑制活性。阳性对照他克林在0.001毫克/毫升浓度下对AChE抑制率为91.2%。(5)蒲公英酸A的分离纯化取蒲公英乙酸乙酯部位浸膏82克置于硅胶柱(900克，200-300目)中，以氯仿-甲醇(1:0—0:1)为洗脱剂梯度洗脱，根据薄层层析TLC情况共分6个部位(F1-F6)。按上述方法对各部位进行乙酰胆碱酯酶抑制活性追踪检测，结果显示对药效活性最强的部位集中在F6部位，由此判断强效抑制AChE活性的物质集中在该F6部位。取F6(1克)用葡聚糖凝胶(100mL)柱层析，以甲醇洗脱，并经水一醇重结晶得到化合物l(12.2毫克)。(6)蒙古蒲公英酸A的结构鉴定化合物l:红色无定型粉末；ClfiH,08;紫外入，(紫外)196,226，276，317，373nm;红外K盟J(cnf'):3400，1721，1608，1520;ESI-MSy7/z:353[M-H]—;核磁共振氢谱(DMS0-A，400MHz):《8.05(1H，单峰，H-7)，7.46(1H，双峰，/=8.8Hz,H-6)，7.40(1H，单峰，H-6')，7.25(1H，双峰，/二8.8Hz,H-5),6.62(1H，单峰，H-3');核磁共振碳谱(DMS0-A，100MHz):"71.6(s,C-9，)，167.8(s，C-9)，148.6(s，C-4')，146.4(s,C-2，)，142.l(s，C_5，)，141.8(s，C-4)，136.7(s，C-3),128.4(d,C—7)，126.2(s，C—8)，125.8(s，C-l)，123.3(s，C一2)，123.O(s，C-7，)，122.3(s，C-8')，121.4(d，C-6)，120.O(d，C-5)，112.5(d，C—6，)，109.7(s，C-1，)，103.9(d，C-3，)。根据上述结构鉴定相关数据可以看出，化合物1的UV、^-NMR和13ONMR谱与化合物Rufescidride非常相似，ESI-MS显示分子离子峰m/z353[M-H]—，比Rufescidride多18个质量单位，因此可以判断Rufescidride可能为化合物1脱水的产物，即化合物1可能为Rufescidride的9和9'位酸酐水解成两个羧酸的化合物。IR中1721cm—1处的吸收峰，以及化合物1溴甲酚绿显蓝色也证明了化合物中具有羧酸基团。^-丽R和DEPT谱显示化合物l中具有18个s^杂化的碳，包括5个次甲基，5个连氧季碳和两个羰基；在'H-丽R谱中，显示三个芳基氢的单峰信号S8.05(单峰，H-7)，7.409(单峰，H-6，)和6.62(单峰，H-3，)以及苯环邻位氢的两个双峰信号S7.46(双峰，J二8.8Hz，H-6)和7.259(双峰，J=8.8Hz，H-5)。式(1)显示了在HMBC谱中几个主要的相关信号，其中H-6与C-2，C-4和C-7之间有远程相关；H-5与C-1和C-3之间有远程相关以及H-7与C-2，C-6，C-8，C-9和C-9'之间有远程相关说明化合物1中具有二羧基萘环结构。H-6'与C-4'，C-2和C-7'之间有远程相关以及H-3'与C-1'和C-5'之间存在的远程相关信号说明化合物1中具有一三氧取代的苯环与奈环相连。因此可以确定化合物1为芳基萘类木脂素，最后通过与文献发现的芳基奈类木脂素相对比可鉴定出化合物1为蒙古蒲公英酸A。式(1)实施例2:蒙古蒲公英酸A的乙酰胆碱酯酶抑制活性检测(1)将蒙古蒲公英酸A溶于二甲亚砜中，配制成5毫克/毫升溶液，再用磷酸缓冲液稀释成50微克/毫升，10微克/毫升，以及20微克/毫升。以他克林为阳性对照。(2)试验结果如下表l所示表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(3)实验结论:AChE是老年性痴呆(Alzheimer'sDisease,简称AD)的指标性测试酶，老年痴呆患者的AChE降低是引起老年性痴呆的重要原因之一。许多药物是基于对AChE起抑制作用而成为老年性痴呆药物的。本实验表明该木质素酸成分具有强效抑制乙酰胆碱酯酶的作用，具有较强的开发潜力，有可能进一步发展成为新的抗老年痴呆症用药。实施例3:五种蒲公英属植物根茎与地上部分茎叶中化合物1的比较(1)供比较含量用蒙古蒲公英(7krarac咖_z'c"/77Hand.-Mazz)、碱地蒲公英(7krarac〃/T75"j./7ic"yz7Kitag)、热河蒲公英(7krazac鹏;7a力7/ecio^/z7Diels)、东；(匕、蒲公英(7krax3c〃/so/ptj.<3/7"/z7Kitag)、反複蒲公英(7kraxaci//77^7y;7。c/0/Dahlst)、兴安蒲公英(7kra义acw/T7Z^cj7W"迈Kitag)干品各20克由中科院昆明植物所彭华教授采集并鉴定。(2)用沃特斯高效液相色谱(WatersHPLC，2695分离系统包括四元泵、柱温箱自动进样器；2996紫外二极管矩阵检测器，Empower色谱操作软件和SymmetryC18色谱柱(4.6mmx250ram)，5^对上述生药中的蒙古蒲公英酸A的含量进行了检测。(3)供试样品处理阴干粉碎后的样品各称取0.5克(±0.1毫克)，置25毫升容量瓶，加20毫升甲醇，253(TC下超声60分钟，加甲醇至刻度，用0.45pm滤膜滤过。(4)标准溶液的制备准确称取蒙古蒲公英酸A标准品10.0毫克，分别加入8毫升甲醇超声溶解，再加入甲醇配成0.5毫克/毫升的标准储备液。用甲醇按照l:l、1:10、1:50、1:100配制成标准溶液，冷藏备用。(5)试剂甲醇为HPLC级，水为二次蒸馏水。色谱条件柱温30。C，检测波长254nrn，流速0.8毫升/分钟，进样量20微升，流动相甲醇/O.l%HAc=75:25等度洗脱。(6)含量测试将提取溶媒、标准品溶液、供试样品分别进样，记录色谱图。以峰面积对应标准溶液浓度绘制曲线，计算线性范围，相关系数^).998。从标准曲线分别计算出蒙古蒲公英酸A的含量。(7)检测结果如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(8)结果表明蒙古蒲公英根茎和地上部分都含有本发明所述的强效乙酰胆碱酯酶抑制剂化合物，并且碱地蒲公英、热河蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英中都含有不同含量的蒙古蒲公英酸A，说明该化合物是菊科蒲公英属植物中的特征性成分之一，所以运用本属植物包括并不限于蒙古蒲公英、碱地蒲公英、热河蒲公英、东北蒲公英、反苞蒲公英、兴安蒲公英等都可以制备本发明所要求的含有蒙古蒲公英酸A的抗老年痴呆药物。实施例4:鲜品和干品蒲公英中蒙古蒲公英酸A含量的比较(1)供干鲜品含量比较之蒙古蒲公英(7arax3Ctt^/ff朋^h'c"/z7Hand.-Mazz)和碱地蒲公英(7krazacsj'/7ic咖Kitag)鲜品各100克由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定。(2)用沃特斯高效液相色谱(WatersHPLC，2695分离系统包括四元泵、柱温箱自动进样器；2996紫外二极管矩阵检测器，Empower色谱操作软件和SymmetryC18色谱柱(4.6mmx250mm)，5|jm对蒙古蒲公英酸A进行了含量检测。(3)含量测试将提取溶媒、标准品溶液、供试样品分别进样，记录色谱图。以峰面积对应标准溶液浓度绘制曲线，计算线性范围，相关系数20.998。从标准曲线计算出蒙古蒲公英酸A的含量。具体操作同实施例3。(4)结果如表3所示<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>__(5)结果表明蒙古蒲公英和碱地蒲公英的干品和鲜品中都含有不同含量的蒙古蒲公英酸A，含量并无大的差异。说明蒙古蒲公英酸A在菊科蒲公英属植物中存在和含量较为稳定，所以运用本属植物的干品和鲜品都可以制备本发明所要求的含有蒙古蒲公英酸A的抗老年痴呆药物。权利要求1.一个木质素化合物及其可药用盐或其溶剂化物用于抑制乙酰胆碱酯酶的用途，其特征为该木质素化合物具有下列结构称为6，9，10-三羟基-氧杂蒽-1，2-二羧酸，又称为蒙古蒲公英酸A。2.根据权利要求1所述的蒙古蒲公英酸A的用途，其特征是在制备预防和治疗乙酰胆碱缺失导致的相关症状或疾病，尤其是防治老年性痴呆的药物中的用途。3.—种用于防治老年性痴呆的药物组合物，其特征是含有治疗有效量的作为活性成分的根据权利要求1的化合物及其可药用的盐与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成药物组合物。4.根据权利要求2的蒙古蒲公英酸A的用途，其特征是所述药物的制剂形式包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射剂、透皮贴剂、气雾剂、控释或缓释剂、或纳米制剂。5.根据权利要求1所述之化合物的制备途径，其主要来源于任意一种中国产的蒲公英属植物之任一部位；可以是干品或鲜品；可以是蒲公英药材植物的根、茎、叶、花、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物及全草部分。全文摘要本发明涉及从蒲公英属植物中分离得到的一个木质素酸以及该化合物的强效抑制乙酰胆碱酯酶活性。从蒲公英中分离纯化制备而得的蒙古蒲公英酸A，即6，9，10-三羟基-氧杂蒽-1，2-二羧酸具有明显的乙酰胆碱酯酶抑制作用，因此该化合物及其可药用的盐，以及与制剂允许的药物赋形剂或载体制备成的药物组合物可预期作为防治老年性痴呆药物用途。文档编号A61K31/352GK101214237SQ200810059059公开日2008年7月9日申请日期2008年1月9日优先权日2008年1月9日发明者叶发青,艳徐,施树云,杨雷香,南董,昱赵,马建设,黄可新申请人:温州医学院