专利名称：：槌果藤在制备用于治疗肾脏疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物药的新用途，具体地说是涉及一种植物药槌果藤在用于治疗肾脏疾病药物中的新用途，特别是槌果藤在制备用于局灶节段性肾小珎J更化药物中的用途。
背景技术：
：肾脏疾病是危害群众健康的常见疾病，据最新的临床流行病学调查，我国慢性肾脏疾病的发病率已接近10%。各种慢性肾脏疾病持续*将导致慢性肾功能衰竭而使患者必须以长期肾替代治疗(透析或移植)维持生命。目前我国接受透析治疗的总人数达数十万，且每年还在以10%以上的速度增长。每位透析患者每年IO余万的治疗费用，给家庭和社会造成沉重的负担。因此，积极探索肾脏疾病的有效治疗药物，控制肾脏疾病或延緩肾功能不全的进展已是当前肾脏疾病领域研究的当务之急。肾脏疾病中的局灶节段性肾小Jl^更化(FSGS)的病变特征为仅累及部分肾小球及肾小球毛细血管袢的部分小叶的硬化病变。临床上以蛋白尿或肾病综合征为其主要表现，在小儿原发性肾病综合征中FSGS约占10%-20%，且为难治性肾病综合征的主要病理类型。90%的儿童和70%的成人患者表现为肾病性蛋白尿，20%-30%的患者伴有进展性肾功能减退，高血压的发生率为30%-45%，近50%的患者有镜下血尿。由于其疗效差，病程长，预后凶险，故亦为儿童及成人终末期肾病最多见的病理改变。到目前为止，对原发性FSGS还没有可靠一致的治疗手段。在FSGS中，首选的治疗是激素。根椐15个有关FSGS研究的荟萃分析，经活检证实的FSGS仅有大约25°/。对激素敏感，对激素敏感的病人15年后倾向于疾愈；相反，对激素不敏感的病人50%在4年内血清肌肝翻倍。对于不能緩解或激素抵抗的FSGS的病人一个疗程的环磷酰胺或苯丁酸氮芥和激素同时使用可能有效。其他的治疗方案如环孢素(CsA)停用后易复发，且具有肾毒性；FK506近年也用于FSGS的治疗，Duncan等观察了FK506对FSGS有一定的治疗效果，但因病例太少需进一步观察证明；霉酚酸脂(MMF)在一些零星的试验中其緩解后复发率少于50%,对照试验正在进行。整体而言，目前FSGS的疗效仍不满意，需要进一步探索有效的治疗药物或方案。槌果藤(CapparisspinosaL.)为百花科植物，半灌木状匍旬藤本。喜生于荒漠戈壁和低山坡石质沙土低处。药用果实。分布于新疆、西藏等地。据中医文献记载，有祛风、散寒、除湿、消肿、止痛之效。具有舒张血管、止血及抑制布氏杆菌和结核菌等作用。民间用于风湿性关节炎、肝硬化、肝炎、寒冷引起的脾胃病证、浮肿。对药物成份研究，有报告含阿魏酸、芥子酸、,丁等成份;种子油含C!8不饱和脂肪酸。另据记载还含糖、硫苷、芥子酶、甾体皂苷、抗坏血酸、红色素、碘等成份。经过文献检索和民间用法得知槌果藤有多方面的药理学作用。动物实验表明，槌果藤实具有镇痛、消炎、抗凝血作用。而其在药效学方面，国外研究发现，其醇提取物具有很强的抗氧化效能，具有防辐，增强毛细血管的功能；提取物水溶液曱醇可溶性部分具有显著的抗肝毒性活性；还具有抗动脉硬化、利尿、滋补、免疫抑制等作用。作为维吾尔药，在临床上已采用槌果藤实治疗风湿病、肩周炎、硬皮病、瘢痕疙疼等病症。
发明内容本发明提供了一种槌果藤在制备用于治疗肾脏疾病药物中的用途。用槌果藤为主要成份制成的药物，可以较好治疗各种肾脏疾病。本发明所述槌果藤在制备用于治疗肾脏疾病药物中的用途，特别是在制备用于治疗局灶节段性肾小Ji^更化药物中的应用。槌果藤可按常规方法，加入适当的辅料，加工成临床上可应用的任何一种制剂，例如煎剂、颗粒剂、丸剂以及片剂等。临床上优选为煎剂，制备、服用均十分方便。各种肾脏疾病的共同临床表现是尿液检查的异常，特别是蛋白尿；病理损害及发病机制都表现为肾小球或小管、间质的病理损害，从基因水平看各种肾脏疾病在发生、发展过程中均存在包括转化生长因子P1、肿瘤坏死因子oc受体、足细胞相关蛋白(Podocin)、纤维连接蛋白等与肾纤维化及病理改变密切相关的基因表达出现显著变化。为了更好地理解本发明的实质，以下通过槌果藤对FSGS大鼠模型的治疗作用和基因芯片初步筛选用为治疗肾脏疾病的典型，从而说明其作用机制。一、实-睑动物健康雄性SD大鼠60只，体重为237.69±22.83g，均由浙江省中医研究院实验动物中心提供。二、药物与试剂槌果藤,按体重60Kg成人分别给药10g、30g、60g和120g的剂量换算成大鼠该药剂量分别为lg/Kg、3g/Kg、6g/Kg、12g/Kg,再以每只大鼠每次灌胃量2ml计算出四种不同煎剂浓度分别为75g/L、150g/L、300g/L及600g/L。煎制前先将称取药物清水浸泡半小时，各组浓度均为水沸后煎煮45分钟左右，煎取的药品4'C储存备用。三、动物模型与分组将所有动物随^^分为6组，每组n-12。其中五组氯胺酮(江苏省连云港制药厂)50mg/Kg腹腔注射，麻醉后行左肾摘除术，7天后尾静脉注射阿霉素5mg/Kg(浙江海正药业股份有限公司)，30天后再次尾静脉注射阿霉素3mg/Kg，按不同灌胃给药浓度将上述五组动物分为75g/L组(A组)、150g/L组(B组)、300g/L组(C组)、600g/L组(D组)，各组动物每日均给予2ml煎剂灌胃。另两组分别为每日等量生理盐水灌胃的安慰剂对照组(E组)和假手术组(F组)。F组动物予剥离肾包膜，不切除肾脏并缝合切口，与其他五组同时给予等量生理盐水。各组给药时间均为四周。四、4全测指标与方法各组动物于治疗前后均分别测定24小时尿蛋白定量(考马斯亮蓝法，上海化学试剂公司)，尾静脉采血检测血常规，用全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、谷丙转氨酶(ALT)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、胆固醇(Choi)水平，四周后所有大鼠均断头处死并取肾组织迅速置于液氮中保存备冲企。五、基因芯片检测(一)样本采集1.首先准备好用于包装样本的冷冻保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表写明样本编号。2.准确切除所需肾组织。3.立即剔除结締组织和脂肪组织等组织类型。4.在RNase-free的O.9%生理盐水中漂洗样本，以去除血渍和污物。5.用冷冻保存管装栽包裹组织，-2(TC冻存4小时，-8(TC冻存12小时，然后迅速投入液氮冷却保存。(二)总RNA抽提及鉴定1.将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用扦子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。2.将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量UNIzol试剂(上海博星生物公司)的匀浆管中，把匀浆管置于水浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。3.将匀浆液转移至15mL离心管中，于4。C,12000g,离心10分钟。4.小心吸取上清液转入新的15mL离心管，在15-30。C放置5分钟。5.向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15-30'C放置3分钟。6.于4。C,12000g，离心15分钟。7.从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15mL离心管。8.向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15-30X^文置10分钟。9.于4。C，12000g，离心10分钟。10.弃去上清，緩慢地沿管壁加入75y。乙醇5mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。11.再加入75W乙醇10mL，在涡旋器上短暂涡旋；于4。C,8000g离心10min。12.小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。13.加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80。C保存。14.进行电泳以及紫外分析、70。C水浴保温实验(三)RNA质量判定标准1.RNA样本的OD260/OD280应在1.7-2.2之间。2.总RNA电泳图i普有清晰的28S、18S条带。3.70。C水浴保温l小时后的电泳图镨与水浴保温前的图谱无明显差异。(四)探针标记与杂交1.预杂交1)配制预杂交液杂交试剂l(上海博星生物公司)加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2(上海博星生物公司)混匀。2)将配制好的预杂交液放入95"水浴锅内变性2分钟，将待预杂交的玻片放入95。C水浴锅内变性30秒，玻片取出后即放入无水乙醇中30秒，晾干。3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42。C预杂交56小时。2.标记探针(以下在冰浴中进行)1)于一已灭菌的1.5mLE卯endorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50juL，以下i式剂均为RNase-free):謹2023jaL逆转录引物5|iL总RNA30-50jig振荡混匀，置于7(TC水浴10分钟。取出后，迅速置于冰上。2)分别加入以下试剂逆转录酶緩冲液10|iLDTT5jiLdNTPs4juL3)而后在暗室中加入以下试剂逆转录酶2nLCy5-dCTP或Cy3-dCTP3juL4)用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2分钟。将Eppendorf管置于42。C水浴2小时。5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I465。C水浴10分钟后加入标记试剂II4iliI。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50JiL左右。6)使用DM纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DM。7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。8)将柱置于一个1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心l分钟将柱置于另一个新的l.5mlEppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间。以3000rpm离心2分钟，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。9)加入标记试剂III8jul，真空抽千。3.杂交1)在抽干的探针管中加6.5pL杂交试剂l，充分混匀，使4笨针溶解。再加入6.5juL杂交试剂2，混匀备用。2)将预杂交的玻片取出，用(1朋20冲去盖玻片。3)将探针置于95。C水浴中变性2分钟；玻片置于95'C水浴中变性30秒，玻片取出浸无水乙醇30秒，探针取出后迅速置于水上。4)将探针置于大鼠cDNA表达谱芯片(BiostarR-40S,上海博星生物公司)上，用盖玻片覆盖，置于杂交抢中，用Parafilm密封，放入42。C杂交箱内杂交过夜(16~18h)。4.洗片1)用O.5%的洗涤液1(上海博星生物公司)冲洗玻片，去除盖玻片。2)准备两个染色缸，分别装有O.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3(上海博星生物公司)，放入6(TC水浴锅中。3)将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤IOmin。4)用O.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾千后扫描。(五)扫描结果筛选及分析1.通过芯片图像分析软件对芯片灰度扫描图进行分析，可以得到芯片上每个基因点的原始信号值，包括前景信号值和背景信号值，然后根据这些原始信号值进行后续的数值分析。2.用基因点Cy5信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的Cy5信号的实际强度值(以下简称为信号值)；并且，为了避免弱信号对实验结果的干扰，将所有小于200的Cy5信号值用200替代。3.用基因点Cy3信号的前景信号值减去它的背景信号值，得到该基因点的Cy3信号值。4.为了校正Cy5、Cy3标记体系间的系统误差，实验数据要进行均一化处理。均一化处理时先依据以下2个原则篩选出参与均一化处理的有效基因点1)该基因点的Cy3、Cy5信号值皆大于200，或者其中之一大于800;2)该基因点的Cy5信号值/Cy3信号值的比值在0.1-IO之间。5.计算每个有效基因点Cy5信号值/Cy3信号值的比值，然后求出其相应的自然对数值r=ln(Cy5/Cy3)，算出全部有效基因点r值的平均值R,那么实验的均一化系数就等于R的倒数即EXP(R)。6.将所有基因点的Cy3信号值乘上均一化系数，得出调整后的Cy3*。并且，为了避免弱信号对实验结果的干扰，将所有小于200的Cy3承值以200取代。7.计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio,Ratio-Cy5/Cy3*。8.筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点，这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异。9.将表达具有显著性差异的基因与Genebank进行比对，从而筛选出有意义的基因。六、不同组别间基因芯片对比情况(表l)表1不同组别间基因芯片对比表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>七、统计学处理数据以均数士标准差(；±s)表示，采用SPSS11.0forwindows软件进行统计学处理，组内采用配对t检^r、组间采用方差分析进行资料统计，P<0.05示结果具有统计学意义。八、试验结果1.尿蛋白变化各组动物造模前24小时尿蛋白定量无显著性差异(P>0.05)，治疗前(第四周)各冲莫型组24小时尿蛋白定量均显著增高，与F组比较有显著性差异(P<0.01)。治疗后(第八周)A、B、C、D各组24小时尿蛋白定量均值较治疗前均有显著下降(P〈0.05)，组间比较可见治疗后(第八周)A、B、C、D各组24小时尿蛋白定量均显著低于E组(P〈0.01)，D组治疗后24小时尿蛋白定量显著低于同期A、B、C组(P〈0.05)。由此可见，实验组不同治疗浓度的槌果藤煎剂均有降蛋白尿的作用，其中又以D组(600g/L)作用为最强(表2)。表2各组动物治疗前后24小时尿蛋白定量(mg/24h)对比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*各组治疗前后比较有显著性差异(P<0.05)"与E组比较，治疗后有显著性差异(P<0.01)'与A、B、C组比较，治疗后有明显差异(P<0.05)2.血常规从各组治疗前后血常规结果比较看，各组白细胞总数和血小板数治疗前(第4周)与治疗后(第八周)均无显著性差异(P>0.05)。模型组治疗前血红蛋白均低于假手术组(F组，P<0.05),A、B、C、D组治疗后血红蛋白低于治疗前，但无统计学差异(P>0.05),而E组治疗后血红蛋白显著低于治疗前(P<0.05，表3)。表3各组治疗前后血常规变化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>承与同期F组比较有显著性差异(P<0.05)"与同组治疗前比较，有显著性差异(P<0.05)3.生化指标各模型组血浆白蛋白水平治疗前显著低于F纽(P〈0.05)。而A、B、C、D各组治疗后血浆白蛋白较治疗前显著上升，E组血浆白蛋白水平则较治疗前显著降低(P<0.05)。各组谷丙转氨酶水平治疗前后无统计学差异(P>0.05，表4)。各模型组治疗前血胆固醇、肌酐、尿素氮水平均显著高于F组(P<0.05),而而A、B、C、D各组治疗后血胆固醇、肌酐、尿素氮水平均较治疗前有显著降低，E组血胆固醇、肌酐、尿素氮水平则较治疗前显著升高(P<0.05，表5)。表4各组治疗前后血浆白蛋白和谷丙转氨酶比较<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表5各组治疗前后肾功能和血胆固醇水平比较<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>氺与同期F组比较有显著性差异(P<0.05)"与同组治疗前比较，有显著性差异(P<0.05)4.基因芯片检测结果4.1总RNA的质量鉴定为减小样本间个体差异，分别取D、E、F组各4个组织标本，分别提取总RNA,编号分别为D—D4、Ei-E4、F,-F4。经鉴定各样本的OD260/OD280值均在1.7-2.2之间。各样本总RNA电泳图语有清晰的28S、18S条带，70°C水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图镨无明显差异。然后将每组4个标本各取100ng等量混合成各组待4全RNA标本。4.2基因芯片检测结果通过计算每个基因点在本次实验中的表达差异值Ratio(Ratio=Cy5/Cy3*)，筛选出Ratio大于2或小于0.5的基因点，这些数据所代表的基因在与两种探针杂交时表现出较大的差异。结果发现，与E组比较，D组共有185条基因表达下调，146条基因表达上调。再通过三组样本(D、E、F组)之间的横向比较以及与Genbank进行比对，从而筛选出有意义的基因102条，其中73条表达下调，29条表达上调。其中包括转化生长因子P1、肿瘤坏死因子oc受体、足细胞相关蛋白(Podocin)、纤维连接蛋白等与FSGS发生发展密切相关的基因表达具有显著性差异(表6)。表6基因芯片检测D组与E组表达显著差异的部分基因列表GeneBank号Cy5/Cy3*基因名称BC0870390.223III型胶原X159060.356纤维连接蛋白(Fibronectin)AY0396510.365足细胞相关蛋白PodocinAF1212170.367I型胶原BC0839090.371肿瘤坏死因子a(TNFoc)受体AF1878180.396表皮生长因子(EGF)受体固—0215780.400转化生长因子P1(TGFP1)NM—0239620.403血小板书t化生长因子(PDGF)NM—1334090.425整合素连接激酶(ILK)BC0788380.449肾特异性膜蛋白(离子通道，钙超载)XM—2134210.452血管内皮细胞锌指蛋白XM一2152514.050锌指蛋白216(VitD)BC0605475.135硒蛋白(抗氧化)槌果藤对FSGS大鼠模型均有减少尿蛋白的作用，起到免疫调节、抗氧化、抗纤维化作用，从而对FSGS具有治疗作用，且未发现骨髓抑制、肝损害等副反应。临床方面，将单次给药相当于原药材120g浓度的槌果藤煎剂治疗肾脏疾病患者248例，每次5ml，一日三次，两个月为一疗程。观察期内慢性肾小球肾炎97例，89例有显效；IgA肾病62例，48例有显效；紫癜型肾炎29例，18例有显效；糖尿病肾病35例，27例有显效；慢性间质性肾炎15例，IO例有显效。具体实施方式下面结合实施列对本发明的实质内容进行说明，但本
发明内容并不局限于此。实施例1煎剂的制备称取12kg槌果藤加10倍水浸泡半小时，加热，水煮沸提取45分钟，过滤，滤渣弃去，定容1000ml，得到相当于原药材12g/ml浓度的煎剂。实施例2颗粒剂的制备称取6kg槌果藤加8倍水浸泡半小时，加热，水煮沸提取45分钟，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至相对密度为1.38-1.40(6(TC)的清膏，取清膏加入蔗糖粉与淀粉的混合物重量比(1:2)适量，混匀，加入乙醇适量，制成1000g颗粒，4安每袋10g包装。实施例3片剂的制备称取3kg槌果藤加9倍水浸泡半小时，加热，水煮沸提取60分钟，，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至相对密度为1.38-1.40(60°C)的清膏，取清膏加入环糊精适量，制颗粒，加入适量滑石粉，压片，得1000片。实施例4丸剂的制备称取3kg槌果藤加9倍水浸泡半小时，加热，水煮沸提取60分钟，过滤，滤淹弃去，滤液浓缩，干燥，4分碎，过筛，用蒸馏水泛丸，干燥，制得1000丸。应用例1取按实施例1制得的槌果藤煎剂治疗肾脏疾病患者92例，每次10ml，一曰三次，两个月为一疗程。观察期内慢性肾小球肾炎47例，39例有显效；IgA肾病32例，28例有显效；慢性间质性肾炎15例，IO例有显效。应用例2取按实施例2制得的槌果藤颗粒剂治疗肾脏疾病患者111例，每次10g，一曰三次，两个月为一疗程。观察期内慢性肾小球肾炎67例，51例有显效；IgA肾病22例，18例有显效；慢性间质性肾炎25例，17例有显效。应用例3取按实施例3制得的槌果藤片剂治疗肾脏疾病患者120例，每次3片，一日三次，两个月为一疗程。观察期内慢性肾小球肾炎59例，47例有显效；IgA肾病29例，21例有显效；慢性间质性肾炎32例，24例有显效。应用例4取按实施例4制得的槌果藤丸剂治疗肾脏疾病患者121例，每次3丸，一日三次，两个月为一疗程。观察期内慢性肾小球肾炎62例，48例有显效；IgA肾病36例，29例有显效；慢性间质性肾炎23例，16例有显效。权利要求1.槌果藤在制备用于治疗肾脏疾病药物中的用途。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于所述槌果籐在制备用于治疗局灶节段性肾小肆J更化药物中的用途。3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于槌果藤按常规方法加工成临床上可应用的任何一种制剂。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述制剂为煎剂。全文摘要本发明公开了槌果藤在制备用于治疗肾脏疾病药物中的用途，特别是在制备用于治疗局灶节段性肾小球硬化药物中的应用，本发明通过槌果藤对局灶节段肾小球硬化大鼠模型的治疗作用和基因芯片初步筛选说明其作用机制，通过槌果藤制备成的药物在临床试验中表明，对治疗肾脏疾病有显著疗效，且未发现骨髓抑制、肝损害等副作用，具有广阔的应用前景。文档编号A61P13/00GK101234130SQ20081005998公开日2008年8月6日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者应旭旻申请人:应旭旻