Hiv肽，抗原，疫苗组合物，检测hiv所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法

专利名称：Hiv肽，抗原，疫苗组合物，检测hiv所诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法
HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导 的抗体的免疫测定试剂盒及方法本申请是申请日为2000年3月2日、申请号为00805735. 4、发明 名称为"HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导的抗体的免疫测 定试剂盒及方法"的发明专利申请的分案申请。本发明涉及基于HIV gag p24保守区域的新肽、游离形式或载体结合 形式的包含至少 一种上述肽的抗原、包含至少 一种该抗原的疫苗组合物、背景HIV感染的全球性流行急需得到控制，而开发抗HIV的疫苗是AIDS研 究中的一个主要目标。通常，疫苗应当激活抗原呈递细胞，克服T-细胞 应答中的遗传限制并产生T-与B-记忆细胞。该病毒群体的可变性给获 得有效的HIV疫苗造成更大的困难。目前还没有在试图开发HIV疫苗的 过程中取得突破性进展的报导。现在普遍接受的是，诱导抗原特异性体 液和细胞介导的免疫是开发有效的预防性和治疗性疫苗的关键。免疫系 统的所有三种武器包括中和抗体、CD8+CTL和T辅助细胞1 (TH1)细胞 是对抗HIV的保护性免疫所必需的。已知CTL能够清除其它病毒的感染 (Ada，免疫细胞生物学(Immunol. Cell Biol.)， 72:447-454， 1994)， 并且CTL能够在病毒后代能够产生并通过细胞裂解释放之前于感染早期 裂解受感染的靶标(Ada等，同前)。焦点集中在抗原的选择及不同佐剂 的设计和评价上。在不同的体内和体外研究中使用的抗原均来自主要源 于gpl60及在某种程度上源于p24的粗蛋白和各种合成肽。对gpl20的 V3环已进行了大量的研究。观察到T和B细胞应答的诱导，然而， 一项 体外研究报导，源于gp41保守区的肽显示了对感染的增强(Bell S.J. 等，临床实验免疫学(Clin. Exp. Immunol. ) ， 87 (1) : 37-45， ( 1992 年l月)。侯选疫苗中天然存在的HIV病毒序列由于该病毒所固有的通过改变存 在于感染细胞表面的表位外观特征而隐藏的能力而不能刺激稳定的免疫 应答。免疫系统误认为与一种特定的氨基酸序列相关而实际上重要的氨 基酸却被隐藏起来。最近的一项关于抗gag p24蛋白抗体效价的研究显示，慢AIDS it^l 进程与高效价相关，而快AIDS发展进程与低效价相关。已经显示具有低 p24抗体效价的人比具有高p24抗体效价的人其AIDS的发展快得多 (ZwartG.等，病毒学(Virology), 201,复285-93页，1994年6月)， 4明p24能够在控制AIDS的iU艮中起着关键的作用.在W091/13360中描迷了新的HIVp24肽,其中在一种鉴别所诊断的HIV 阳性血清样品真假的方法中使用了该肽。Johnson R. P.等(免疫学杂志(The Journal o'f Immunology),第147 巻，第1512-1521页，No. 5， 1991年9月1日)描述了在三个HIV-1血 清反应阳性个体中对gag特异性CTL应答的良好特异性进行的分析，发 现该gag特异性CTL应答是由I型HLA限制的CD3+CD8淋巴细胞介导的。EP-A-0 356 007/>开了抗原决定簇，具体地它涉及到与HIV-1中存在 的蛋白质相关并且能够作为潜在的抗AIDS疫苗的基础使用的合成多肽序 列。Rosenberg E. S.等，科学(Science),第278巻，1997年11月21 曰，第1447-1450页描述了，病毒特异性CD4+ T辅助淋巴细胞是在许多 慢性病毒的感染中维持有效免疫的关键，但具有特征性的是在1型慢性 人类免疫缺陷病毒(HIV-l)的感染中不能检测到该细胞。相反地，相应于 p24的HIV-1特异性增殖应答与病毒的携带有关。他们推断HIV-1特异性 辅助细胞在免疫治疗干涉及疫苗开发中可能是重要的。R Hoffmann-U Roche & Co. Aktiengesellschaft的EP 0 230 222、 EP 0 270 114、 DE 37 11 016和GB 2 188 639涉及到HTLVIII Gag/Env 基因的蛋白或融合蛋白的重组表达和纯化。可以将这些由天然序列组成 的蛋白质纯化至均一并作为用于检测抗AIDS相关病毒的抗体的诊断测试 的基础。也可以对该gag/env蛋白进行配制，以用作通过预防免疫防止4AIDS的疫苗。从诊断和治疗的观点看，使用p24作为测定或治疗一部分的主要问题 和p24上许多刺激产生大量低特异性抗体的表位有关，这些表位通过在 潜在的突变序列上的重复加强能产生自身抗体(HIV感染中ct/PT细胞 受体的自身抗体，调节异常和模仿.LakeD.F.，等，美国国家科学院院 刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), (23) : 10849-53, 1994年11月8 曰)，此外，据报道，p24的抗体效价达不到与包膜蛋白(gpl20和gp41) 的抗体效价一样高的水平。通常p24的抗体在感染极早期产生，但在最 初感染期后它的效价很快达到稳定。之后p24的效价逐渐下降，而gpl60 发生相反情况。在细胞毒T-细胞活性受到天然存在的HIV-1 gag变种抑 制的有关最近报导中，也观察到这些发现(Klenermaii P.等.，自然 (Nature) ， 2:369 (6479)，第355页，1994年6月2日)。这可能是为 什么会观察到p24效价很快稳定和后来开始下降的原因之一。根据以上背景资料，为满足对有效的预防和治疗疫苗的需求，我们决 定研究"S:计能模拟p24表位而又不拮抗细胞毒T-细胞活性的新合成肽的 可能性。最初的工作建立在Korber B.等人(人类逆转录酶病毒和AIDS, 1997 年编，理论生物学和生物物理学组，Los Alamos国家实验室，Los Alamos, NM)发表的一个表位上。该表位的氨基酸序列(203—222)是KA L G PG ATLEE關T A CQGVG RRMRTKSIKD LSSS R R GVR V S AA SE QQ在本说明书给出的序列中定义氨基酸的单字母和三字母密码符合国际 标准并在教科书例如，Lehninger A. L.《生物化学原理》(Principles of Biochemistry) (Worth Publishers Inc.,纽约，1982)中有说明。在上述头一行序列下面给出的氨基酸是此序列的自然变异。在以下序列上对含有该修饰表位的序列进行初步研究ANPDCKQILKSLGPGATLEEXXTACQGVG-NHZ L__ ,t其中X表示2-氨基己酸，而且半胱氨酸残基处于氧化状态，即形成链 内二硫桥。用该肽作为诊断试剂盒的一部分的研究结果(未发表)显示对于一组预先选择的非洲人血清其特异性达到87% (n=279)。对于一组包 含了明显不同于其它亚型的HIV-1 0亚型血清的HIV-1阳性血清，其灵 敏度惊人地高达100%。为提高特异性，即确定对纯粹的非交叉反应性抗体应答有利的氨基酸， 在一个明显短得多的而且经itii一步修饰的^Ui进行了相似的研究LIWGATCQEHXTACQGVG-NH2 l__l其中X具有如上所述含义，且半胱氨酸残基形成一个链内二硫桥。 该研究的结果表明实验的特异性提高到96%(n=293)，而且与在不使 用p24肽进行的实验中得到的特异性相似。因为在包含了第一个肽的实 验中特异性为87%,所以如果将该肽用作候选疫苗，那么由于它能被非特 异性的抗体所识别，则可能诱导针对一个以上表位的免疫应答。然而， 后一个实验显示所用肽序列能获得仅对HIV-1特异的免疫应答，因此， 如果在侯选疫苗中使用以这个肽为基础的序列作为抗原，那么极有可能 增强针对HIV-1的独特免疫应答。为进一步增加T细胞表位的数量和减少逃避突变体形成的机率，在分 別来自第264-284位残基，第253-271位残基和第166-186位残基的以 下三个序列的基础上(这些序列发表在1997年"人类逆转录酶病毒和 AIDS"上；核酸和氨基酸序列的编辑和分析(A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences), 理论生物学和生物物 理学组(编)，Los Alamos国家实验室，Los Alamos),构建了另外三个肽序列RWI I L GLNKI VRMYSPT S ILD KGVVM MK CVG EDM V V QI GS ANNP P I PVGE I YKRW I ILGLS Q A V KDML RKGM VMGGSNKV DVVH GTAP和PEV I PMFSALSEGATPQDLN T R I TT T LTE AD I S YNI YM L N AL VH V IM LAV为确定对HIV-1特异且灵敏的独特序列，合成了几个修饰的肽' 本发明描述根据本发明的肽来源于HIV-1核心蛋白p24的上述四个不同保守区 域，且具有保持该HIV-1表位独特性(灵敏性和特异性)的性质。而且， 根据本发明的该新肽对识别的细胞毒T淋巴细胞(CTL)不具有拮抗作用， 并将具有至少一个潜在的CTL表位。根据本发明，满足以上标准的肽选自Xaat Xaaa Xaa3 Xaa4 Xa% Xaag Ala Xaa8 Xaa9 Gln Thr Pro Trp Xaa14 Xaa15Xaa16 Xaa17 Xaa18 Val Xaa^ (SEQ ID NO:l)其中该链中的氨基酸可能具有以下含义该肽衍生物的第l位的Xaa是Lys或Arg,第2位的Xaa是Ala、 Gly、 Ser或Arg,第3位的Xaa是Leu或Met,第4位的Xaa是Gly或Arg,第5位的Xaa是Pro、 Thr、 Val、 Ser、 Gln或Ala ,第6位的Xaa是Gly、 Ala、 Lys、 Arg、 Gln或Glu，第8位的Xaa是Thr或Ser，第9位的Xaa是Leu或lie,第14位的Xaa是Thr、 Ser或Val，第15位的Xaa是Ala或Ser,第16位的Xaa是Cys或Ser,第17位的Xaa是Gln或Leu，第18位的Xaa是Gly、 Glu或Arg,第20位的Xaa是Gly或Arg，该肽含有SEQ ID NO:l序列的至少九个连续氨基酸，Xaat Xaa^ Xaa3 Xaa4 Xaa5 Gly Leu Asn Pro Leu Val [Gly]n Xaa12 Xaa13 TyrXaa15 Pro Xaa17 Xaa18 lie Leu Xaa^ Xaa22 (SEQ ID NO:4)其中该链中的氨基酸具有以下含义第l位的Xaa是Arg、 Lys、 Asp或是没有，第2位的Xaa是Trp、 Gly、 Lys或Arg，第3位的Xaa是Ile、 Leu、 Val或Met ,第4位的Xaa是Ile、 Val或Leu ，第5位的Xaa是Leu、 Met、 Val或Pro ,第12位的Xaa是Arg、 Lys ,第13位的Xaa是Met或Leu ，第15位的Xaa是Ser、 Cys或Gin,第17位的Xaa是Thr、 Val、 Ile、 Ser或Ala，第18位的Xaa是Ser、 Gly或Thr ,第21位的Xaa是Asp、 Glu、 Cys或Gly ,第22Xaa是Gly或没有，其中SEQ ID N0:4的序列含有至少6个连续氨基酸，且n = 0， 1， 2或3，X叫Xaa^Xaag Pro Ile Pro X叫Xaa8 Xaag Xaal0 Xaa^ Xaa12 [Gly]n Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaago Xaa21 Xaa^ Xaa23 Xaa24 (SEQ ID NO :9)其中第l位的Xaa是Asn、 Ser、 Gly、 His、 Ala、 Pro、 Arg或没有第2位的Xaa是Asn、 Ala或Lys第3位的Xaa是Pro、 Gln、 Gly、 Ile或Leu第7位的Xaa是Val或Ala第8位的Xaa是Gly或Lys第9位的Xaa是Glu、 Asp、 Lys、 Phe或Thr第10位的Xaa是Ile、 Met、 Val或Leu第ll位的Xaa是Tyr、 Leu或没有第12位的Xaa是Ser或没有第13位的Xaa是Arg或没有第14位的Xaa是Asp、 Arg、 Trp、 Ala或没有第15位的Xaa是lie或没有第16位的Xaa是Tyr或没有第17位的Xaa是Lys或Arg第18位的Xaa是Arg、 Lys或Asp第19位的Xaa是Trp或Gly第20位的Xaa是Ile、 Met、 Val、 Gin或Ala第21位的Xaa是Ile、 Val或Ala第22位的Xaa是Leu、 Met或Val第23位的Xaa是Gly或Cys 第24位的Xaa是Leu或没有其中SEQ ID N0:9的序列由至少六个连续氨基酸组成，且n 二 1， 2或3,Xaat Xaa^ lie lie Xaa5 Xa^ XaayXaa8 Xaag Leu Xaa^ [Gly]n [Arg]旭Xaa12 Xaa" Xaa" Xaa" Xaa^ X&fl" Xaa" Xaa" Xaago Xas^i X3H22 Xa&24 Xaa25 (SEQ IN NO:15)其中第l位的Xaa是Pro、 Lys、 Arg或没有第2位的Xaa是Glu、 Arg、 Phe或Lys第5位的Xaa是Pro或Thr第6位的Xaa是Met、 Thr或Nleu第7位的Xaa是Phe或Leu第8位的Xaa是Ser、 Thr、 Ala或Met第9位的Xaa是Ala、 Glu或Leu第11位的Xaa是Ser或没有第12位的Xaa是Ala、 Arg或没有第13位的Xaa是Ile、 Leu或没有第14位的Xaa是Ser、 Ala、 Leu或没有第15位的Xaa是Tyr、 Glu或Asp第16位的Xaa是Gly或Asp第17位的Xaa是Ala或Leu第18位的Xaa是Thr、 Ile、 Val、 Leu或Asn第19位的Xaa是Pro、 Thr或Ser第20位的Xaa是Tyr、 Phe、 Nleu、 His或Gin第21位的Xaa是Asp、 Asn、 Leu或Ala第22位的Xaa是Leu、 Ile、 Val或Asn第23位的Xaa是Asn、 Tyr、 Cys或Gly第24位的Xaa是Thr、 Met、 Ile、 Ala、 Val或没有第25位的Xaa是Gly或没有其中SEQ ID N0:15的序列由至少六个连续氨基酸组成，n = 1,2或3且 m=0， 1, 2或3，这些序列的末端可以是游离的羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基 或它们的盐，两个或多个半胱氨酸残基可以形成链内或链间二硫键(disulphide binding), -S-(CH2)p-S-或-(CH2)p-桥的部分，其中p = 1-8，任选插入 一个或多个杂原子如0、 N或S,而且/或者将该所述肽序列固定在固相 支持物上。这些新肽序列具有充当良好抗原的潜力，其中该抗原含有至少一种选 自SEQ ID NO:l、 SEQ ID N0:4、 SEQ ID N0:9或SEQ ID NO: 15的肽。 可以通过例如二聚化或多聚化和/或罔定在固相上，调整不同肽的比例或 浓度或这些肽的大小，以调节抗原性。该抗原包含两个或多个根据本发 明的多肽序列，它们或者通过桥如这些链的半胱氨酸残基之间的二硫桥、 或可能插入了一个或多个杂原子(如0、 S、或N)的C「Cs亚烷基桥等连 接在一起，或者优选地它们并不相接。这些链可以以单体、二聚体或寡 聚体的形式被固定在固相上。可以在末端加上其它的氨基酸，以便形成 利于固定的"臂"。尽管优选自然存在的L-型氨基酸，但本发明肽中的所有氨基酸均可以 是D-或L-型的。这些肽序列的C-末端及N-末端可以因对末端顺2基团和/或000H基团 的修饰而与天然序列不同，例如，它们可以被酰化、乙酰化、酰胺化、 或ff饰以便为载体或另 一分子提供结合位点。根据本发明的肽由6-50个氨基酸，优选10-30个氨基酸组成。它们 覆盖了己鉴定位置中所有天然的氨基酸变异。根据本发明的多肽抗原可以是游离形式的或载体结合形成的。可以从 多种已知的载体中选择该多肽任选结合的载体或固相。应当根据该固定 化多肽作为诊断抗原或作为疫苗中的免疫成分的预期用途来进行选择。能够用于例如诊断目的的载体的实例有磁珠或共聚物(如笨乙烯-二乙 烯基笨共聚物、雍化笨乙烯-二乙烯基笨共聚物)、聚笨乙烯或羧化聚笨 乙烯的胶乳、炭黑珠、未活化的或聚苯乙烯或聚氯乙烯活化的玻璃、环 氧活化的多孔磁性玻璃、明胶或多糖颗粒或其它蛋白质微粒、红细胞、单克隆抗体或多克隆抗体或这些抗体的fab片段。根据本发明的又一实施方案，这些抗原可以和载体、佐剂联合或和其 它免疫刺激因子如携带朋「基因的金丝雀痘苗病毒联合，形成疫苗的部 分。用于疫苗目的的载体或/和佐剂的例子是其它蛋白质，如人或牛的血 清白蛋白及匙孔血蓝蛋白。可以将免疫刺激物质分成三组佐剂、抗原 的载体和赋形剂。佐剂的实例有氢氧化铝、铝盐、皂苷、胞壁酰二肽或 三肽、单磷敞基脂A、副百日咳博德特氏菌(丑/ er^/ss/s),及各种细胞 因子，包括Thl细胞因子IL-12和IL-1。许多蛋白质毒素可以用以携带 过客蛋白(passenger protein)穿过细胞膜进入细胞质，这在开发CTL 疫苗中是有用的。载体包括细菌毒类素如灭活的破伤风和霍乱毒素、经 遗传改造脱毒的细菌毒素如来自大肠杆菌的热不稳定性肠毒素、脂肪酸、 活的载体如脊髓灰质炎病毒嵌合体(polio chimeras )、和形成颗粒的杂 合蛋白如酵母逆转录转座子杂合TY颗粒和HBcAg颗粒。现代疫苗中经常 存在的成分赋形剂由矿物油乳剂、弗氏完全和不完全佐剂、植物油乳剂、 非离子嵌段共聚物表面活性剂、角鲨烯或角鲨烷、脂质体和生物可降解 微球体构成。对于新疫苗的开发具有显箸潜力的两种新佐剂包括水包油 型微乳剂(MF59)和聚合物微粒。任何能提高该抗原的免疫原性的物质都 可以被采用，而且，在美国和欧洲药典上还给出了载体或佐剂的几种其 它替代物。用于免疫刺激用途的该抗原的适合制剂还可以含有干扰素如INF~y、 抗病毒性趋化因子或造血生长因子，如粒细胞巨噬细胞生长因子。为了增强刺激和例如肠道内的吸收，另一个方法是与小欣例如二、三 或四肽一起施用本发明的肽。这些肽可以在本发明的肽之外施用，也可 以与本发明的肽联合起来施用。优选地，本发明的肽与由D-型或L-型氨 基酸、优选D-型氨基酸组成的三肽YGG—起施用。12近来用于疫苗的非肠胃夕卜递送(職-parenteral delivery)如通过 粘膜递送的方法包括产生非毒性粘膜佐剂衍生物的基因融合技术、在 必需基因中带有缺失的遗传失活抗原、抗原与对于粘膜免疫应答的调节 和控制重要的特定细胞因子的共表达、以及允许DNA或RNA摄取的遗传 物质本身及其在寄主细胞中的内源性表达。在需要细胞介质的免疫的情况下，产生持久应答的一种方法是接种编 码一种或多种特异抗原的质粒DNA。为了防止HIV感染，疫苗应该诱导粘膜和全身免疫应答，并且能够通 过任何方便的途径肠胃外或非肠胃外施用，如皮下、皮内、静脉内、肌 内、口服、经粘膜或鼻内施用。在一个根据本发明的疫苗的优选实施方案中，它包含含有SEQ ID NO:l、 4、 9和15的肽的抗原，更优选地这些肽以1:1:1:1的比例存在。在另一个优选实施方案中，该疫苗组合物含有抗原RAL GPAATLQTPWTASLGVG-NH2 (SEQ ID NO : 3)RWLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILG-NH2 (SEQ ID NO : 6) RAIPIPAGTLLSGGGRAIY K R T A 1 L G - NH2(SEQ ID NO : 1" 和RFIIPNIFTALSGGRRALLYGATPYAIG-NH2 (SEQ ID NO : 18).这些序列中的一个含有B细胞表位并将激活体液免疫系统，而其它的序列提供CTL表位，在该CTL表位框架中设计氨基酸改变以实现增强的 结合。为了便于该肽的合成和/或增加该肽的溶解性，进行其它的氨基酸 改变。本发明的再一个实施方案是，采用本发明的抗原在体液样品中检测由 HIV-1或HIV-1特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方法。设计用于该检测的 免疫测定试剂盒和能够选择性地与所述抗原反应的抗体也包括在本发明 中。肽制备的描迷本发明的肽可以通过任何已知的制备线性氨基酸序列的方法，如重组DNA技术来产生。将编码本发明肽或该所述肽的多聚体的核酸序列引入表 达载体中。适合的表达载体有例如含有复制和表达所必需的控制序列的 质粒、粘粒、病毒和YAC (酵母人工染色体)。可以在宿主细胞中刺激该 表达载体表达。适合的宿主细胞是例如细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞。 这些技术是本领域所熟知的，并描述于例如Sambrook等，《分子克隆 实验室手册》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual) ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989。 其它熟知的 技术有降解，或通过在液相或优选在固相(树脂)上把一个氨基酸残基 与下一个氨基酸残基偶联起来的合成技术，例如所谓的Merrifield合成。 参见例如Barany和Merrifield，《肽分析合成生物学》(P印tides， Analysis, Synthesis, Biology), 第2巻,E， Gross和Meinhofer编 (Acad. Press,纽约，1980); Kneib—Cor on ier和Mullen,国际肽蛋白 研究杂志(Int. J. P印tide Protein Res. )， 30,第705 - 739 ( 1987); 和Fields和Norble，国际肽蛋白研究杂志，35，第161 - 214页(1990)。 如果期望连接的或环状的肽，则当合成适合的线性氨基酸序列后，对 该氨基酸序列采取化学氧化步骤，以便实现环化或将一个肽序列内或两 个肽序列之间的两个半胱氨酸残基连接起来，参见Akaji等，Tetrahedron Letter,33， 8,第1073—1076页，1992。合成的一般性描述在以下给出的实施例中制备的所有肽衍生物均是按标准程序在 Milligen 9050型肽合成仪上合成的。所用树脂是具有0.20 meq/g理论 负载量的Tenta Gel P RAM ( RAPP POLYMERE GmbH， Tttbingen )。合成的 最终产物在真空中干燥过夜。在存在作为清除剂的乙二硫醇 (ethandithiol) (5%)和水(5%)的情况下用90%三氟乙酸处理(室温下 1.5小时)，使该肽从树脂上裂解下来。然后过滤该树脂，用其它的三氟 乙酸(100%) (2x20ml)在滤器上清洗。将合并的滤出液在真空中蒸发(室温下水浴)，剩余物用乙酸(200 ml)研制，过滤出沉淀物。立即在滤器上 用冰乙酸(100ml)溶解该固体，将其加入1.5升在甲醇中的20%乙酸中， 并用甲醇中的0.1 M碘溶液处理直到剩余微弱的褐色。然后加入醋酸盐 形式的Dowex 1x8离子交换剂(15g) (Bio-Rad， Richmond, CA)，之后 过滤混合物。蒸发滤液，残余物水冻干燥除去乙酸。然后在含有溶于0.1% 三氟乙酸水溶液的乙腈的适合系统中，在装有Kromasil 100 - 5 C8 (EKA Nobel, Surte，瑞典)的柱子上，通过反向相液相色谱纯化该产物。通过 配备了 Kromasil 100 - 5 C8柱(EKA Nobel， Surte，瑞典)的分析性 高效液相色谱仪(HPLC)分析从柱子中收集的样品。合并含有纯物质的组 分，蒸发溶剂，将产物水冻干燥除去乙酸。对终产物进4亍最终的HPLC分析，通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)验证该肽的结构。在合成中用到的所有氨基酸均是L-氨基酸，并用芴甲氧基羰基对其ot-氨基功能进行保护。侧链按以下方式进行保护Cys (Trt)， Gln(Trt), Glu(0tBu)， Thr(tBu).括号内的缩写词是Trt =三苯甲基t-Bu =叔丁基0tBu =叔丁酯这些氨基酸衍生物由Bachem AG，瑞士提供。 实施例1KALGPGATLQTPWTACQGVG - NH2 (SEQ ID NO: 2)的 制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以跣胺形式合成该肽。纯 度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。 纯度(HPLC): 87 %实施例2RALGPAATLQTPWTASLGVG (SEQ ID N0:3)的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酖胺形式合成该肽。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。纯度(HPLC): 〉 95%分子量(游离碱(free base)): 1966实施例3WIIPGLNPLVGGGKLYSPTSILCG-NH2 (SEQ ID NO: 3) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。 纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。 纯度(HPLC): 95 % 质谱分析理论分子量2454.9 实验分子量2454.8 ES+实施例4WLLLGLNPLVGGGRLYSPTSILGRALG (SEQ ID N0:6) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。 纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。 纯度(HPLC): >95 % 分子量(游离碱)2552 分子式' CU9H195029N33实施例5KILLGLNPLVGGGRLYSPTSILG (SEQ ID NO : 7)， R"LGLNPLVGGGRLYSPTTILG (SEQ ID NO : 8) 和NIPIPVGDIYGGGDIYKRWQALCL (SEQ ID NO : 24)的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酖胺形式合成这些肽。纯度用HPLC分析测定，结构通过M酸分析和质谱分析(LDI-MS)来 实施例6RNIPIPVGDIYGGGDIYKRWQALC L(SEQ ID NO:IO) 的制备。根据合成的一般性描迷，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。 纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。 纯度(HPLC): 85 % 质谱分析理论分子量2817.3 实验分子量2813. 7 ES+实施例7RAIPIPAGTLLSGGGRAIYKRWAILG (SEQ ID NO: 11) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。纯 度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。 纯度(HPLC): >95 % 分子量(游离碱)2707分子式- C125H208029N38实施例8ALPIPAGFIYGGGRIYKRWQALG (SEQ ID NO : 12)， K IPIPVGFIGGGWIYKRWAILG (SEQ ID NO : 13)和K I PIPVGTLLSGGGRIYKRWAILG (SEQ ID NO : 14) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成这些肽。 纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。实施例9K F I I P Nl F S A L G G A I S Y D L N T Nl L N C I ( SEQ ID NO: 16) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。序 列中的Nl是正亮氨酸。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和 质谱分析(LDI-MS)来a, 纯度(HPLC): >80 % 质谱分析理论分子量2783.3 实验分子量2783. 3 ES+实施例10KFIIPN1FSALSGGGAISYDLNTFLNCIG (SEQ ID N0:17)的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。 序列中的Nl是正亮氨酸。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析 和质谱分析(LDI-MS)来验证。纯度(HPLC): 〉80% 质谱分析理论分子量2932.4 实验分子量2931. 8 ES+实施例11RFIIPN1FTALSGGRRALLYGATPYAIG卿ID NO: 18)的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。序 列中的Nl是正亮氨酸。纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和 质谱分析(LDI-MS)来發江。 纯度(HPLC): >95 % 分子量(游离碱)2894 分子式C137H217032N3718实施例12KII PN1FSALGGGRLLYGATPYAIG (SEQ ID N0:19), RIIPN1FTALSGGGRLLYGATPYAIG (SEQ ID N0:20) 和WIIPN1FSALGGAISYDLNTN1LNCI (SEQ ID N0:25) 的制备。根据合成的一般性描述，从相应的原材料，以酰胺形式合成该肽。 纯度用HPLC分析测定，结构通过氨基酸分析和质谱分析(LDI-MS)来验证。实施例13 通过二疏桥二聚化通过氧化步骤将实施例1和3的肽序列连接起来形成二肽，其中半胱 氨酸残基形成二硫桥，该桥可以按以下两种方式的任何一种形成A) 用12氧化。等量的这两个肽溶解在乙酸/甲醇(1:4)中，加入溶于 甲醇的O. 1 M 12产生二聚体的混合物。或B) 通过[Cys (Spy) 16] -SEQ ID NO: 2进行氧化。用2， 2_二硫二吡啶(2，2-dithiodipyridin) (3当量)处理溶解在2 M AcOH (aq)和2-丙醇(l:l) 中的2. 3mM SEQ ID NO:2的肽，产生[Cys(Spy) 16]-SEQ ID N0:2。 将等量的[Cys(Spy)16]-SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO:5的肽溶解在10 mM NH40ac (aq pH=6. 5)和甲醇(5:2)中，产生SEQ ID N0:21的二 聚体。此肽的纯度用HPLC分析测定，肽结构用氨基酸分析验证，肽含量(氨 基酸游离碱)为80% 纯度(HPLC) : 92%实施例14制备含有SEQ ID N0:3、 6、 11和18的肽的疫苗。将水冻干燥的这些 肽以4 mg/ml的终浓度溶解在无菌水中。最终盐浓度是0. 9 %。依据厂家 的4吏用说明，将粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)制剂配制成0.3 mg/ral的终浓度。这两种溶液均进行皮内给药， 一个典型的注射剂量是100实施例15将抗原溶液或悬浮液与等份的Bering弗氏完全或不完全佐剂混合， 然后通过注射器的抽吸和用力推出，或采用匀浆器使其良好地乳化。该 乳化液应保持稳定至少30分钟。此抗原-佐剂乳化液最好皮下注射作为 贮存。实施例16 毒性数据将实例13中的二肽在0. 9% NaCl中稀释到4 mg/ml的试验溶液浓度。 此二肽以每公斤体重100 ng的剂量注入NMPI雌性小鼠体中。没有观察 到毒性作用，因此该肽被认为是无毒的。在小鼠和大鼠中对实例14中疫苗的肽組合物进行毒性研究。选棒小鼠 用于本研究，以提供来自第二种常用啮齿类动物物种的比较数据。测试 物质是以含有冻干物的小瓶形式提供的4种肽的混合物，用于和生理盐 水进行重构，剂量水平以总的肽量来表示。这4种肽以1:1:1:1的比例 存在，使每种肽的剂量水平是0. 0075mg/kg体重、0. 075mg/kg体重和0. 75 mg/kg体重，该剂量水平高达预期的人体剂量的500倍。将测试动物分成 4组，每组10只动物(5只雄性和5只雌性)盐水对照组以及低、中和 高剂量组。通过以3ml/分钟的剂量速度静脉内输注至尾静脉的方式，施 用一次该测试组合物。通过腹膜内注射戊巴比妥钠在第15和16天处死 动物。这些研究的结果显示，给小鼠和大鼠施用的这些剂量水平没有引起不 良反应，而且无作用剂量超过3mg/kg。实施例17用于检测HIV-1所诱导的抗体的免疫测定依据厂家推荐的操作方案制备磁性微粒试剂。所用Dynabeads的生产商是Dynal AS。将包被了配体的磁性微粒称作试剂1。将根据本发明的 肽与该磁性颗粒的预先激活表面共价偶联。也可以将该肽物理吸附在该 磁性微粒的表面。试剂1中颗粒的浓度在1 mg/ml到15 mg/ml之间。 颗粒大小在0. 2 nm至15 p之间。肽的浓度范围从0. 01 mg/mg颗粒到 1 mg/mg颗粒。根据Dako AS公司推荐的方案，制备抗人Ig碱性磷酸酶(AP)偶联的 抗体试剂。该方案是本领域的标准程序，这个试剂被称作试剂2。根据Fluka AG推荐的方案，制备底物溶液酚舦-单磷酸盐。该方案是 本领域的标准程序，这个试剂被称作试剂3。所用的洗涤和孵育緩冲液是含有以下添加成分的标准0.05M tris碱 緩沖液Tween 20(0.01%到0.1%)、甘油(0. 1%到10%)和氯化钠(0. 296 到O. 1%)。该测定程序包括一个孵育步骤，其中在每个孔将1滴试剂1和2滴洗 涤緩冲液混合。混合后，加入30 pi样品并孵育该溶液5分钟。可以利 用磁铁吸附住磁性微粒，并在将该磁铁分离开之前除去液体。然后在与 试剂2 —起孵育前，每个孔用4滴洗涤溶液清洗两次。加入1滴试剂2 和2滴洗涤緩冲液，并孵育该溶液5分钟。可以利用磁铁吸附住磁性微 粒，并在将该磁铁分离开之前除去液体。然后在与试剂3 —起孵育之前， 重复洗涤步骤。每个孔加入2滴试剂3，并将溶液孵育3分钟。可以在白 色背景下读取结果，阳性结果呈红色((3+ =鲜红)，而阴性结果与阴性 对照中所获得一样是清楚的淡黄/褐色溶液。该免疫测定试剂盒可以用于检测由HIV病毒或HIV特异性肽或蛋白 质，例如本发明的肽诱导的抗体。上面的实施例仅用来举例说明本发明，我们必须理解本领域的技术 人员能对这里所描述的肽、抗原和疫苗进行修改，而不背离权利要求书 中阐迷的本发明的概念和范围。本发明的多肽能以选自序列SEQ ID N0:1、 SEQ ID N0:4、 SEQ ID N0:9 和SEQ ID NO: 15每一组的至少一种肽的组^^吏用，以形成抗原和目的在 于防治1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的预防性或治疗性疫苗的有效成分。该疫苗可以包括对于保护或刺激宿主(人类或脊推动物)免疫系统 具有有利作用的化合物，如白介素、干扰素、粒细胞巨噬细胞生长因子、 造血生长因子等。优选地，该疫苗组合物进一步含有佐剂或赋形剂，更 优选地该佐药或赋形剂是可能与明矾、弗氏佐剂(完全或不完全)或氬氧化铝一起的单磷酰基脂A(Mon叩hosphoryl Lipid A) (MPL )。佐药/ 赋形剂的最佳量将取决于所选择的类型。该肽或疫苗制剂可以在保存前冻干。该疫苗可以优选在低温下保存在 含有一个或多个剂量单位的小瓶中备用。根据本发明的肽的典型剂量单 位在每公斤体重1 iig-lmg的浓度范围内，优选在每公斤体重2 ng~0. 15 mg 内。本领域的技术人员将明了适合的剂量将取决于患者的体重、疾病 的类型、病症的严重性、给药途径以及几个其它的因素。该疫苗可以通 过注射施用多达12次，典型地施用大约3次。在制备注射溶液时，将这 些肽以每种肽1 ing/ml和0. 996氯化钠的终浓度溶解在无菌氯化钠溶液中《 典型地注射体积从100 到200 pi (2 x 100 nl)。该狀优选与合适的 佐药和/或粒细胞巨噬细胞生长因子如Leucomax Shering Plough — 起施用。适合的施用方式可以是皮内、皮下、静脉内、口服、肌内、鼻 内、粘膜途径或任何其它合适的途径。为了维持保护作用，可能需要进 行加强施用。本领域技术人员将明了，根据本发明的该疫苗组合物不仅 在感染的预防中有用，而且在感染的治疗中也是有用的。序列表(1) 一般信息(i)申请者(对于除美国之外的所有国家)(A) 姓名Bionor A/S(B) 街区Str0mdalsjordet 4,信箱号码1868 Gulset(C) 城市Skien(E) 国家挪威(F) 邮编(ZIP): N-3705(G) 电话+47 35 50 57 50(H) 传真+ 47 35 50 57 01(i) 发明者和申请人(仅限于美国)(A) 姓名Birger S0renset1(B) 街区Meierlia 3(C) 城市3727 Skien(D) 国家挪威(ii) 发明名称HIV肽，抗原，疫苗组合物，检测HIV所诱导的抗体的免疫测定和方法。(iii) 序列数25(iv) 计算机可读形式(A) 介质类型软盘(B) 计算机IBM兼容机(C) 操作系统Windows 95(D) 软件Word 7. 0(v) 目前的申请资料优先权来自2000年三月四日提交的N0 1999 1078 申请号(2)SEQIDNO: 1的信息(I) 序列特性(A) 长度20个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(V)片段类型内在的(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置1(D)其它信息/注="第1位的Xaa是Lys或Arg" (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置2(D)其它信息/注="第2位的Xaa是Ala, Gly， Ser或Arg" (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置3(D)其它信息/注="第3位的Xaa是Leu或Met" (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置4(D)其它信息/注="第4位的Xaa是Gly或Arg" (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置5(D)其它信息/注="第5位的Xaa是Pro， Thr, Val， Ser, Gln或Ala " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置6(D)其它信息/注="第6位的Xaa是Gly， Ala， Lys, Arg, Gln或Glu " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置8(D)其它信息/注="第8位的Xaa是Thr或Ser "(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置9(D)其它信息/注="第9位的Xaa是Leu或lie " (ix)特征(A) '名称/关键词被修饰的位点(B) 位置14(D)其它信息/注="第14位的Xaa是Thr, Ser或Val " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置15(D)其它信息/注="第15位的Xaa是Ala或Ser " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置16(D)其它信息/注="第16位的Xaa是Cys或Ser,任选地Cys形成二硫键的部分 (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置17(D)其它信息/注="第17位的Xaa是Gln或Leu " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置18(D)其它信息/注="第18位的Xaa是Gly， Glu或Arg " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置20(D)其它信息/注="第20位的Xaa是Gly或Arg "(xi)序列描述SEQ ID NO:l :Xaa， Xaa2Xaa3Xaa4 Xaa5 Xaa6 Ala Xaa8 Xaa9 Gin Thr Pro Trp Xaa14Xaa，5'Xaa16 Xaa17 15 10 15Xaa"Val Xaa20 20(2) SEQ ID N0:2的信息:(i) 序列特性(A) 长度20个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iv) 假设无(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置16(D)其它信息/注="任选地第16位的Cys形成二硫键桥的部分"(xi) 序列描述SEQ ID NO: 2:Lys Ala Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Gin Thr Pro Trp Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly 15 10 15 20(2)SEQ ID N0:3的信息: d) 序列特征(A) 长度20个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 3:Arg' Ala Leu Gly Pro Ala Ala Thr:Leu Gin TKr Pro T巾Thr. Ala Ser Leu Gly Val Gly 1 5 10 15 20(2) SEQ ID NO: 4的信息(i) 序列特征(A) 长度23-24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(ix)特征(A) 名字/关键词被修饰的位点(B) 位点1(D)其它信息/注释="第l位的Xaa是Arg， Lys, Asp或没有(ix)特征(A) 名字/关键词被修饰的位点(B) 位点2(D)其它信息/注释="第2位的Xaa是Trp， Gly， Lys或Arg (ix)特征(A) 名称/关键词(iX)特征被修饰的位点(B) 位置3(D)其它信息/注="第3位的Xaa是Ile， Leu, Val或Met "(ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置4 '(D)其它信息/注="第4位的Xaa是Ile , Val或Leu " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置5(D)其它信息/注="第5位的Xaa是Leu， Met' Val或Pro "(ix)特征(A)名称/关键词被修饰的位点(B)位置12(D)其它信息/注="第12位的Xaa是Arg或Lys "(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置13(D)其它信息/注="第13位的Xaa是Met或Leu " (ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置15(D)其它信息/注="第15位的Xaa是Ser, Cys或Gln,任选地Cys形成二硫键的部分"(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置17(D)其它信息/注="第17位的Xaa是Thr, Val, Ile， Ser或Ala "(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置18(D)其它信息/注="第18位的Xaa是Ser, Gly或Thr "(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置21(D)其它信息/注="第21位的Xaa是Asp, Glu， Cys或Gly,任选地Cys形成二硫键的部分"(ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置22(D)其它信息/注="第22位的Xaa是Gly或没有"ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置11. . 12(D)其它信息/注="任选地插入具有0、 1、 2或3个残基的Gly桥" (xi)序列描述:SEQ ID NO: 4Xaa， Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaas Gly Leu Asn Pro Leu Val [GlynXaa12Xaa13 Tyr Xaa15 Pro 1 5 10 15Xaa17Xaal8lle Leu Xaa21 Xaa^ 20(2) SEQ ID NO:5的信息 (i)序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 种类氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子种类肽(iii) 假设无IX)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="第23位的Cys可以形成二硫桥的部分" (xi)序列描述SEQ ID NO: 5:Trp He lie Pro Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Lys Leu Tyr Ser Pro Thr Ser lie Leu 1 5 10 15 20Cys Gly(2) SEQ ID N0:6的信息:(l)序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种29(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述:SEQ ID NO:6:Arg Trp Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pra Thr Ser 15 10 15 20l'le Leu Gly(2) SEQ ID N0:7的信息: (i)序列特征(A) 长度23个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO:7:Lys lie Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro Thr Ser lie 15 10 15 20Leu Gly(2〉 SEQ ID NO:8的信息 (i)序列特性(A) 长度23个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii)分子类型:肽(lil)假设无 (xi)序列描述:SEQ ID N0:8:Arg Leu Leu Leu Gly Leu Asn Pro Leu Val Gly Gly Gly Arg Leu Tyr Ser Pro Thr Thr lie1 5 10 15 20Leu Gly(2)SEQ ID N0:9的信息: (i)序列特征(A) 长度22-26个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置1(D)其它信息/注="第1位的Xaa是Asn， Ser, Gly His, Ala, Pro, Arg或没有"ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置2(D)其它信息/注="第2位的Xaa是Asn , Ala或Lys ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置3(D)其它信息/注="第3位的Xaa是Pro， Gln， Gly, lie或Leuix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置7(D)其它信息/注="第7位的Xaa是Val或Ala ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置8(D)其它信息/注="第8位的Xaa是Gly或Lysix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置9(D)其它信息/注="第9位的Xaa是Glu, Asp， Lys， Phe或Thr 。ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置10(D)其它信息/注="第10位的Xaa是Ile， Met, Val或Leu 。 ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置11(D)其它信息/注="第ll位的Xaa是Tyr, Leu或没有。ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置12(D)其它信息/注="第12位的Xaa是Ser或没有")特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置13(D)其它信息/注="第13位的Xaa是Arg或没有 ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置14(D)其它信息/注="第14位的Xaa是Asp, Arg, Trp, Ala或没有U)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置15(D)其它信息/注="第15位的Xaa是Ile或没有ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置16(D)其它信息/注="第16位的Xaa是Tyr或没有 ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置17(D)其它信息/注="第17位的Xaa是Lys或Arg ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置18(D)其它信息/注="第18位的Xaa是Arg, Lys或Aspix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置19(D)其它信息/注="第19位的Xaa是Trp或Gly ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置20(D)其它信息/注="第20位的Xaa是lie, Met, Val， Gin或Alaix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置21(D)其它信息/注="第21位的Xaa是Ile, Val或Ala ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置22(D)其它信息/注="第22位的Xaa是Leu, Met或Valix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="第23位的Xaa是Gly或Cysix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置24(D)其它信息/注="第24位的Xaa是Len或没有ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置12. . 13(D)其它信息/注="选择地插入1、 2或3残基的甘氨酸桥 (xi)序列描述:SEQ ID NO:9:Xaa, Xaa2Xaa3 Pro lie Pro Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa，。Xaa，， Xaa12 [Gly]n Xaa，3 Xaa14Xaa151 5 10 15Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa2420(2) SEQ ID NO: 10的信息(i)序列特征(A) 长度25个氨基酸(B) 类性氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种 (ii)分子类型:肽 (ill)假设无IX)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置24(D)其它信息/注="第24位的半胱氨酸可以形成二硫键的部分(xi)序列描述:SEQ ID N0:10:Arg Asn lie Pro He Pro Val Gly Asp lie Tyr Gly Gly Gly Asp lie Tyr Lys Arg Trp Gin Ala15 10 15 20Leu Cys l>eu(2) SEQ ID NO: 11的信息 (i)序列特征-(A) 长度26个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 11:Arg Ala lie Pro lie Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg Ala lie Tyr Lys Arg Trp 15 10 15 20Ala lie Leu Gly 25(2) SEQ ID NO: 12的信息 (i)序列特征(A) 长度23个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 12:Ala Leu Pro lie Pro Ala Gly Phe He Tyr Gly Gly Gly Arg lie Tyr Lys Arg Trp Gin Ala Leu， 5 10 15 20Gly(2) SEQ ID NO: 13的信息 (i)序列特征(A) 长度22个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 13:Lys lie Pro lie Pro Val Gly Phe lie Gly Gly Gly Trp lie Tyr Lys Arg Trp Ala lie Leu Gly 1 5 10 15 20(2) SEQ ID NO: 14的信息(l)序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述:SEQ ID NO: 14:Lys lie Pro lie Pro Val Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg lie Tyr Lys Arg Trp Ala lie15 10 15 20Leu Gly(2) SEQ ID NO: 15的信息(i) 序列特征(A) 长度24-28个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置1(D)其它信息/注="第1位的Xaa是Pro, Lys, Arg或没有 ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置2(D)其它信息/注="第2位的Xaa是Glu， Arg， Phe或Lys ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置5(D)其它信息/注="第5位的Xaa是Pro或Thr i;c)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置6(D)其它信息/注="第6位的Xaa是Met, Thr或Nle ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置7(D)其它信息/注="第7位的Xaa是Phe或Leu ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置8(D)其它信息/注="第8位的Xaa是Ser, Thr， Ala或Metix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置9(D)其它信息/注="第9位的Xaa是Ala， Glu或Leuix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置11(D)其它信息/注="第ll位的Xaa是Ser或没有ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置12(D)其它信息/注="第12位的Xaa是Ala， Arg或没有1X)特征 ，(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置13(D)其它信息/注="第13位的Xaa是Ile， Leu或没有ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置14(D)其它信息/注="第14位的Xaa是Ser, Ala, Leu或没有1X)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置15(D)其它信息/注="第15位的Xaa是Tyr， Glu或Asp ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置16(D)其它信息/注="第16位的Xaa是Gly或Aspix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置17(D)其它信息/注="第"位的Xaa是Ala或Leuix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置18(D)其它信息/注="第18位的Xaa是Thr， Ile' Val, Leu或Asnix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置19(D)其它信息/注="第19位的Xaa是Pro, Thr或Ser ix)特征:(A) 名称Z关键词被修饰的位点(B) 位置20(D)其它信息/注="第20位的Xaa是Tyr, Phe， Nle, His或Glnix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置21(D)其它信息/注="第21位的Xaa是Asp, Asn， Leu或Alaix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置22(D)其它信息/注="第22位的Xaa是Leu， Ile， Val或Asn i;0特征修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="第23位的Xaa是Asn， Tyr, Cys或Glyh)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置24(D)其它信息/注="第24位的Xaa是Thr, Met, lie, Ala， Val或没有iX)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置25(D)其它信息/注="第25位的Xaa是Gly或没有")特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="任选地第23位置的Cys形成二硫键的部分 1X)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置11... 12(D)其它信息/注="任选地在插入第U位Xaa和第12位Xaa之间一个Gly-Arg桥'其中n = 1， 2和3， m独立于n，是0, 1, 2或3。(xi)序列描述SEQ ID NO: 15:Xaa， Xaa2 lie lie Xaa5 Xaa6 Xaa7Xaaa Xaa9 Leu Xaa" [Glyn〖Argm Xaa12 Xaa13 Xaa" 1 5 10Xaa15Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa13Xaa20 Xaa21Xaa22Xaa23 Xaa24 Xaa25 15 20 25(2)SEQ ID NO: 16的信息G)序列特征40(A) 长度25个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型肽(iii) 假设无ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置24(D)其它信息/注-"任选地第24位的Cys形成二硫键的部分 (xi)序列描述:SEQ ID N0:16:LVs 'Phe lie lie Pro NIe Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala He Ser Tyr Asp. Leu Asn Thr NIe1 5 10 15 20Leu:Asn.Cys lie(2) SEQ ID NO: 17的信息 (i)序列特征(A) 长度28个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置26(D)其它信息/注="任选地第26位Cys形成二硫键的部分(xi)序列描述SEQ ID NO: 17:Lvs Phe lie He Pro NIe Phe Ser Ala Leu Ser Gly Gly Gly Ala lie Ser Tyr Asp Leu Asn ; 5 10 15 20Thr Phe Leu Asn Cys lie Gly 25(2) SEQ ID N0:18的信息(i)序列特征(A) 长度27个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 18:Arg Phe lie lie Pro NIe Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Arg Arg Ala Leu Leu Tyr Gly Ala1 5 10 15 20Thr Pro Tyr Ala lie Gly 25(2) SEQ ID NO: 19的信息(l)序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述SEQ ID NO: 19:Lys lie lie Pro NIe Phe Ser Ala Leu Gly Gly Gly Arg Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr Ala15 10 15 20lie Gly(2) SEQ ID N0:20的信息 (O序列特征(A) 长度25个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无(xi)序列描述:SEQ ID NO :20:Arg lie lie Pro Nile Phe Thr Ala Leu Ser Gly Gly Gly Arg Leu Leu Tyr Gly Ala Thr Pro Tyr 15 10 15 20Ala lie Gly 25(2) SEQ ID N0:21的信息(i)序列特征(A) 长度44个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种 (il)分子类型二聚体肽 (iil)假设无ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置二硫键在SEQ ID NO:2的第16位和SEQ ID NO:5的第23位之间(2) SEQ ID NO:22的信息 (i)序列特征(A) 长度40个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种 (ll)分子类型二聚体肽(iii)假设无ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置二硫键在SEQ ID N0:2的第16位和SEQ ID N0:2的第16位之间 (D)其它信息'/注="(2) SEQ ID N0:23的信息:(l)序列特征(A) 长度48个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型二聚体肽(iii) 假设无ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置二硫键在SEQ ID N0:5的第23位和SEQ ID N0:5的第23位之间(2) SEQ ID NO: 24的信息 (i)序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无ix)特征:(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="第23位的Cys可以形成二硫桥的部分 (xi)序列描述:SEQ ID NO:24:Asn lie Pro lie Pro Val Gly Asp lie Tyr Gly Gly Gly Asp lie Tyr Lys Arg Tyr Gin Ala 1 5 10 15 20l_eu Cys Leu(2) SEQ ID N0:25的信息:(i) 序列特征(A) 长度24个氨基酸(B) 类型氨基酸(C) 链型单(D) 拓扑结构两种(ii) 分子类型:肽(iii) 假设无ix)特征(A) 名称/关键词被修饰的位点(B) 位置23(D)其它信息/注="任选地第23位的Cys形成二硫键的部分(xi)序列描述:SEQ ID N0:25:Trp lie lie Pro NIe Phe Ser Ala Leu Gly Gly Ala lie Ser Tyr Asp Leu Asn Thr NIe 15 10 15 20Leu Asn Cys lie
权利要求
1.来自HIV gag p24蛋白的肽，其特征在于其氨基酸序列为Arg Ala IlePro Ile Pro Ala Gly Thr Leu Leu Ser Gly Gly Gly Arg Ala Ile Tyr Lys ArgTrp Ala Ile Leu Gly(SEQ ID NO11)，其中所述序列的末端可以是游离羧基或氨基基团、酰胺、酰基、乙酰基或它们的盐类，任选地所述肽序列被固定在固相支持物上。
2. 抗原，其特征在于它含有根据权利要求1的肽。
3. 疫苗组合物，其特征在于它含有根据权利要求l的抗原和可药用稀释 剂以及任选的佐剂、载体和/或赋形药和任选的其它一种或多种免疫刺激 化合物。
4. 根据权利要求3的疫苗组合物，其中这些肽被溶解在盐水溶液中，而 且所述任选的免疫刺激化合物是粒细胞巨噬细胞生长因子。
5. 根据权利要求3-4中任一项的疫苗组合物，其中该组合物含有选自 单磷酰基脂A(MPL )、弗氏完全或不完全佐剂或氢氧化铝的佐剂。
6. 在体液样品中检测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体的方 法，其特征在于将所述样品进行免疫测定，其中使用了抗原，所述抗原 是权利要求1的肽。
7. 用于在体液样品中检测由HIV或HIV特异性肽或蛋白质诱导的抗体 的免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒包含了诊断用抗原，该诊断用 抗原是权利要求1的肽。
全文摘要
本发明包含新的经修饰的肽，这种肽能诱导HIV-1特异免疫应答而不拮抗细胞毒性T-细胞的活性，从而获得一种有效的预防性和治疗性抗HIV疫苗。此肽以HIV gag p24蛋白的保守区域为基础，本发明描述了游离形式或载体结合形式的包含至少一种上述肽的抗原、包含至少一种该抗原的疫苗组合物、使用此抗原检测由HIV或HIV特异肽诱导的抗体的免疫测定试剂盒及方法。
文档编号A61K39/00GK101328209SQ20081009213
公开日2008年12月24日 申请日期2000年3月2日 优先权日1999年3月4日
发明者B·索伦森 申请人:比奥诺尔免疫有限公司