专利名称：：从九节龙提取的三萜皂苷类抗胶质瘤化合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药
技术领域：
，是一种新化合物及其在医疗方面的用途，具体地说是从九节龙中提取分离到的一种新的三萜皂苷类化合物,其制备方法，以及在治疗胶质瘤方面的应用。技术背景人恶性胶质细胞瘤是颅内肿瘤中最常见的一种，新型安全高效的化疗药物的开发是治疗该病的迫切要求，我们的前期研究表明中药九节龙的总皂苷可抑制人恶性胶质瘤U251MG细胞生长。九节龙(v4n&to/w^foA.DC)为紫金牛科紫金牛属植物，又称毛茎紫金牛，分布于中国南部地区，具有清热解毒的功效，药用全草。紫金牛属植物主要含有三iSS皇苷化合物，且被证明是其主要有效成分。已有人对九节龙中的三菘皂苷进行过研究，并报道分离鉴定了3种原生的三絡皂苷(指非经过酸水解等化学方法而获得的三萜皂苷)，即九节龙皂苷I(arfipusfflosideIX九节龙皂苷II(ardipusillosideH)和一个未命名的四糖三萜皂苷，其中九节龙皂苷H作为新化合物被报道过2次(张清华，王晓娟，缪振春，等.药学学报，1993,28(9):673^78和缪振春，冯锐，周永新，等.波谱学杂志，1999，16(5):395~402)，但从化学结构上看其实是同一个化合物-这3种化合物被证实对多种肿瘤显示较强的抑制作用。但相比于紫金牛属其他植物，对九节龙的三菘皂苷类化学成分的研究尚不充分。我们对九节龙总皂苷迸行了系统分离，获得了一种新的三萜皂苷类化^J,该化合物苷元的30位羧基通过一个甘油基与糖醛酸连接，这种结构的三格皂苷在天然界非常罕见，该化合物为天然界发现的第三个具有这种结构特征的化合物，其化学结构和抗胶质瘤活性未见有过报道。I类创新药物(单体化合物药物)研制的大量实践和报道证实化学结构决定药理作用，新的化学结构很可能预示着更强的生物活性、更低的毒副作用或更适于在临床使用。虽然1993年已报道了九节龙皂苷I和九节龙皂苷II的结构和提取分离，但与已从紫金牛属其他植物分离获得大量的三絡皂苷化学成分相比，对九节龙的三結皂苷类成分的研究尚不充分，而且也未发现这3种三菘^苷成分具有抗胶质瘤活性的报道。因此迫切需要对九节龙的化学成分进行更深入研究，从中获得更多新化合物特别是具有较强抗胶质瘤作用的新化合物。
发明内容本发明目的是提供从九节龙提取的三蔽皇苷类质瘤化合物，它具有质瘤作用。本发明的目的是这样实现的，从九节龙提取的三萜皂苷类抗胶质瘤化合物，采用髙分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术，以及化学方法，确定了该化合物的化学结构，其特征是式I所示化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>式l上述结构其化学名称为邓"CMa-L-吡喃鼠李糖基"(1—2)^-1>吡喃葡萄糖基"{1^4)"形-1>吡喃葡萄糖基<1—2)Ht-L-吡喃阿拉伯糖基H6ca8"二羟基-齐墩果-I2-烯-30"酸3(M>[3'"0"(a-D-吡喃葡萄糖醛酸钠)甘油基(1'—30)酯(3p^Ha-L-rh咖nopyranosyK1—2>p-I>glucopyranosyHI~4HP-D~glucopyranosy"1—2)I"a-L-arabi加pyranosyiJ-16a^28"dihydroxy-olean-12-en-30oicacid30-0[3'"CKsodi咖ot-D"glucopyran肌咖te)glycerol(1'—30)1ester),按照CA(ChemicalAbstracte)命名原则，其化学名称为(3队1600>16;28^1^(1)野-3<{01-1^iiiamnopyranosyKI—2')-p-D^glucopyranosyl"(1—4HP-D"glucopyranosyl-(l"*2)I"a-L~arabinO"pyranosyl}oxy)olean-l2-en-.30"oicacid2-hydroxy-3-[(sodjumot-D-glucopyrdnuronate—yloxy]-propylester,是从九节龙中提取分离的新的三絡皂苷类化合物，以下简称其为OLAG*所述的从九节龙中提取分离Jd^三絡皂苷类化合物的方法，其步骤如下(1)提取以九节龙为原料，原料经粉碎后，按重量fl^比加入35倍原料重的甲醇或乙醇，回流提取，共提取3次，每次24小时。合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比510倍的水中，分别用和水等体积的石油鍵萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂后得到总龟苷提取物。(2)分离上述总皂苷应用赚柱层析，以^cSJ比为7:2:16.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合J^剂洗脱，薄层层析检测，收集含式I化合物OLAG的流份，再用RP-18柱进行反相柱层析，以体枳比为l:l3.2的甲f水混合溶剂洗脱，合并含式I化合物OLAG的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为3.5:6.54:6的甲^水或体积比为2.5:7.53:7的乙腈-水浪合溶剂为流动相洗脱，得到式I化合物OLAG的纯品。所述的式I化合物OLAG对U87MG、U251MG、BT325和SHG44等4种人恶性胶质瘤细胞均显示显著的抑制作用，半数有效抑制浓度(lCso值)在1.232邻jtmoI/L之间。并且，在高至100jimol/L浓度时也基本不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。本发明的特点是式I化合物OLAG苷元的30位羧基通过一个甘油基与糖接酸连接，这种结构的三萜皂苷在天然界非常罕见，该化合物为天然界发现的第三个具有这种结构特征的化合物，与从九节龙中提取分离的3种已知三SS龟苷的化学结构均不相同，也未见从天然界分离得到或通过合成的手段得到过-而式I化合物OLAG对多种人恶性胶质瘤细胞株的显著抑制作用也表明其可以进一步作为新的皿质瘤药物进行研究开发。对九节龙总皂苷的提取方法虽然是皂苷类成分的常用提取方法，但并未见用于含式l化合物OLAG的总皂苷的提取，已报道的对九节龙单体龟苷成分的分离方法中，未见采用RP-I8柱反相柱层析和离效液相，而这两种方法的应用对于富集和获得式I化合物OLAG单体有显著作用，这也是本发明能够获得在九节龙中含量较少的式I化合物OLAG的重要原因。本发明从九节龙中通Ji提取、分离纯化得到式I化合物OLAG,该化合物可用于制备治疗胶质瘤的药物，为研制新的抗胶质瘤药物提供了先导化合物。下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。图I是化合物的提取和分离工艺流程图。具体实施方式下面结合具体实施例来说明本发明的实质。应理解，这些实施例仅用于证实本发明而不用于限制本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。化合ft的提取和分离实施例l-实施例化合物的提取和分离工艺流程如图1所示，实施例1采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取3公斤，加入10升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次2小时。合并提取液，减E回收^FM(减压回收即本行业通常所采用的抽滤方法，下同>,得乙醇提取物120克。提取物分敢于l升水中，用石油醚萃取3次，每次l升。萃取后的水相再用与正丁醇萃取3次，每次l升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物10克。将总皂^行硅胶柱层析，以氯仿-甲^水混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:3:1和6.53.5:1(均取下层作为洗脱液)，按100mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检測(薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于1051C加热显色)，收集含如下式I化合物OLAG的第1819流份，减压蒸干溶剂后得0.3克样品。样品采用LichroptepRP-18Lobar柱(Merct公司诚行反相柱层析，以体积比为1:1的甲l水混合溶剂洗脱，按20mL为一个流份接收，薄层层析检測，合并含如下式1化合物OIAG的第68流份，再经髙效液相色谱仪(岛津公司，离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SinoChromODS^BP色谱柱10x250mm,38%'甲醉为流动相，流速2mL/min，室温，206nm紫外检测)，得到如下式I化合物OLAG的纯品12.3毫克。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>上述结构其化学名称为3KHa-L-吡喃鼠李糖基《1—2)^D"吡喃葡萄糖基"(1—1>吡喃葡萄糖基"(1—2)Hx-L-吡喃阿拉伯糖基}-16oa8"二羟基-齐墩果-I2-烯-30-酸3(H>[3'^Ha-D"吡喃葡萄糖醛酸钠)甘油基(r—30)酯(3p^Ha-L-rh咖nopyr幼osyKI—2>p-I>glucopyranosyH1~*4)-[P-D"glucopyranos>1-0—2)"《-L-arabinopyranosy.l}-16o28"dihydroxy-cJean-I2"Cn-30"Ok;acid30"0[3'"0"(sodiuma-D-gucopyranuronate)glycerol(1"30:)ester),按照CA(ChemicalAbstracte)命名原则，其化学名称为(3p，16a)>16;28^ihydroxy-3"(〖ot-L-riiamiu、pyranos>1<(l~*2)-P-I>glucopyranosyl"(l~*4HP-I>glucopyranosyl"(l—2)]-a-L"8rabinO"pyranosyljoxy)olean-12"en-30"oicacid2-hydn、xy-3-[(sodi咖a-D-glucopyraiiuronate)-j4oxyI-propylester,是从九节龙中提取分离的新的三絡皂苷类化合物，简称其为OLAG。实施树2:采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取1公斤，加入4升甲醇进行回流提取，共提取3次，每次3小时。合并提取液，减压回收溶剂，得甲醇提取物30克。提取物分散于200毫升水中，用石油醸萃取3次，每次200毫升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次200毫升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物3克》将总皂^行硅胶柱层析，以氯仿-甲l^水混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:2丄7:3:1和6.53.5"(均取下层作为銜，按50mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检靴薄层展开溶剂为氯仿-甲醇-水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105TC加热显色)，收集含实施例1式I化合物OIAG的第1618流份，JlSffi蒸干溶剂后得(U克样品。样品采用LichroprepRP-18Lobar敏Merck公司难行反相柱层析，以体积比为1:1的甲酵-水混合溶剂洗脱，按7mL为一个流份接收，薄层层析检測，合并含实施例1式I化合物OLAG的第68流份，再经高效液相色谱仪(岛津公司)分离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SinoChromODS-BP色谱柱10x250mm,30%乙腈为流动相，流速2mL/min,室温，206nm紫外检测)，得到实施例1式I化合物OLAG的纯品4.5毫克。实旌例3:采集四川夹江县的九节龙全草作为原料，原料经粉碎成粗粉后，取l公斤，加入5升浓度为95%的乙醇进行回流提取，共提取3次，每次4小时。合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物32克。提取物分散于160毫升水中，用石油醚萃取3次，每次160毫升。萃取后的水相再用正丁醇萃取3次，每次160毫升，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂后得到总皂苷提取物3.5克。将总皂舰行硅胶柱层析，以氣仿-甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，洗脱液的体积比分别为7:3:1和6.5:3.5:1(均取下层作为液)，按35mL为一个流份接收，并用硅胶薄层层析检測(薄层展开溶剂为氯仿-甲|^水(6.5:3.5:1)的下层，显色剂为体积比为1:4的硫酸-甲醇溶液，喷显色剂后于105r加热显色)，收集含实施例1式I化合物OLAG的第1819流份，减压蒸干溶剂后得O.ll克样品'样品采用LichroprepRP-18Lobar柱(Merck公司诚行反相柱层析，以体积比为3:2的甲gu水混合溶剂洗脱，按7mL为一个流份接收，薄层层析检測，合并含实施例1式I化合物OLAG的第46流份，再经高效液相色谱仪(岛津公司份离纯化(HPLC条件为大连依利特公司SinoChromODS-BP色谱柱10x250mm,35%甲醇为流动相，流速2mL/min，室温，206nm紫外检测)，得到实施例1式I化合物OIAG的纯品4.2毫克。化合物的结构鉴定实施例1式I化合物OLAG为白色无定形粉末，分子式为Cs2HMNaO、,，熔点为235~236》°C;[]D+25.2°(c0.15，MeOH)，Liebermann-Burchaid反应和Molish反应均为阳性。对化合物进行碱水解后得到一个次级苷A和甘油苷B,甘油苷B经盐酸蒸气薄层酸水解可检測到葡萄糖醛酸，表明葡萄糖醛酸Mi1—个甘油基连接在苷元30位的羧基上。次级苷A进行酸水解和糖衍生物的分析，具体方法为采用2mol/L三氟乙酸进行酸水解并常法制备水解产物(糖部分)的三甲絲醚化衍生物，以L-ChirasiI-VM气相色谱柱(25tnx032mm.班行GC分析，标准糖制备的相应衍生物作对照。标准糖衍生物的色谱保留时间分别为8.68，9.60min(D"阿拉伯糖X8J《9.64min(!^阿拉伯糖X9.39，1028min(D"鼠李糖X9.31,1021min(L鼠李糖X14.56mill(D"葡萄糖X14.50min(b葡萄糖》可以看到，采用上述条件能够分辨不同绝对构型的糖。分析表明本发明化合物在3位连接的寡糖链由3种糖基组成，即L-阿拉伯氣L-鼠李糖和1>葡萄糖，组成比约为Ll:2。通过高分辨质谱和核磁共振谱特别是二维核磁共振谱的综合解析，确定了该化合物的结构。其波谱数据如下ESI-MS(正离子模式)jw/2:138M+Na;T，1187[M+Na-GluANaf，1U3[1187—CHbCHOHCHjOr,1091187~OCHaCHOHCH2Or;ESI-MS(负离子模式)13M-H一，1339M—Ma—，11M—GtaANa-H]—，IO粉M—GiuANa^CHjCHOHCHsOHl-,101089"0]一；MS/MS(负离子模式，母离子为1339)1191339~Rha]-，1171339~Gk]—,1089，1073,10U77-Rha]—,91089—Rha]—，921089"CHc〗一，柳1031—dc]—，78943~Gte—，619781-CHc]—,60Ara+Rha+2xGlc—H]—，48aglycone^H]一；HR-ESI-MS(正离子模式)1385.5955[M+Naf(计算值CetH^NajOji:1385.5邻5)。其JH和"C核磁共振数据见表I。表I实施例I式I化合物OLAG的^和13C核磁共振数敏测试溶剂:氘代吡啶-重水=2:1)Nfe，H《J)Nfe，H(J)13C10.64饥1.34na37.7tAra21-77取1.84m25.1t14.77d(4.8)103.033.00dd(11.4,4.4)88.1d24.31m7834—38.1s34.34m70.450.47d(10.8)54.6d44.37hre73.061.30m17.7t53.90da0.414J29m62.771.13叫1J9m31.9tGkl8—38.7s15.11d(7-8)103_291-43m45.9d23.83m74.710—35.5s34.12m75.8111.67m22.6t43.97m69.8125.46brt122-0d53.79m77.013—143,3s64.11取4.25bid(11-4)61.014一40.4sGlcII151.50dd(14.4，4.212.02dd(14.4,42)332t14.84d(7.8)102.0164.53brs722d23.93m76.417—38.9s34.17ra77J2182.25dd(14.4，4.2)42.6d43.75dd(9么9.0)70.1192.04取2.49dd(13.8，13.2)43.3t53.67m76.620一43.6s63.98m，4.21bid(II-4)60.8212.20m32.3tRha22l邻nu2.28m30.8115.92s跳3230.97s27.0q24.50m71.5240.79s15-5q34.42m70.6250.64s14_5q44.06m72.6260.72s15.7q54.65m68.7271.55s26.1q1,63d(6.6)17.3283.29d(10.813.55d(10.8)69.0tGluA291.12s27.6q15.35d(3.6)99.030一177.7s24.00姐71.5—34.41m72.44.44hrf"1.414.46hid(11.4)64.8t44.36m71.524.32m67.9d54.55d(102)71.833.81nu4.14birfm.4)693t6一175.7Ara:阿拉伯糖，Glc:葡萄糖(其中，dcl连接于Ara的2位，GkII连接于Ara的4位)，Rha:鼠李糖，GtaA:葡萄糖酸酸，J:偶合常数化合物体外tt^^质瘤作用的研究对实施例1式[化合物OLAG进行了体M^质瘤试验，试验所采用的细胞株分别为-U87MG、U25IMG,、BT325和SHG44等4种人恶性胶质瘤细胞。为測试实施例1式I化合物OLAG对胶质^的选择性以及对正常神经细胞的毒性，另取K-562人白血病和MKN-28人胃痛细胞株以及原代培养的人神经胶质细胞同时溯定实施例1式I化合物OLAG的细胞毒性-用常规的MTT法測试。具体方法为根据细胞生长速率，将处于对数生长期的细胞以4000个细IS/孔接种于邻孔培养板，貼壁生长24小时后，弃去原培养液，加入用DMEM培养液配制好的含不同浓度本发明化合物的溶液200nL,每个浓度设3个复孔，并设盐酸尼莫司丁(ACNU)阳性对照、生理盐水对照和无细胞调零孔。细胞在37t'、5%C02-95%02条件下培养48小时，然后加入PBS溶解的浓度为10mg/mL的MTT(Sigma公司)20pL，在同样条件下孵育4小时。最后，每孔加入200fiL的二甲基亚砜，混匀。将96孔板置酵标仪上测定各孔在490urn处的吸光度(OD难。按下式计算被測物对细胞生长的神制率-细胞抑制率-(I一治疗组OD傲对照组OD值)X100%半数有效抑制浓度IC50值采用Logit法计算。试验结果见表2。表2实施例I式I化^fOLAG对4种恶性胶质瘤细胞、2种其他肿瘤细胞以及原代培养的人神经胶质细胞的抑制作用(IC5Q值'imiol/L)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>可见，实施例1式I化合物OLAG对4种人恶性胶质瘤细胞均有显著抑制作用，ICso值与临床常用于恶性脑肿瘤治疗的盐酸尼莫司丁接近,但对其他2种肿瘤细胞的抑制作用非常弱，表明其对胶质瘤具有选择性作用。实施例1式I化合物OLAG不影响原代培养的人神经胶质细胞生长(lCso值WOOnmol/L)。具体试验中发现,既使在实施例1式I化合物OLAG的浓度为100jimol/L时，对神经胶质细胞的抑制率也只有6.9M(PX).05),但阳性对照盐酸尼莫司丁在100nmol/L浓度时的抑制率可达31.8M(iM).05),可见，实施例1式I化合物OLAG对正常神经胶质细胞基本无毒性，可用于制备治疗胶质瘤的药物。权利要求1.从九节龙提取的三萜皂苷类抗胶质瘤化合物，其特征在于化学结构式如下式I上述式I结构的化学名称为3β-O-{α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-α-L-吡喃阿拉伯糖基}-16α，28-二羟基-齐墩果-12-烯-30-酸30-O-[3′-O-(α-D-吡喃葡萄糖醛酸钠)甘油基(1’→30)]酯(3β-O-{α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabinopyranosyl}-16α，28-dihydroxy-olean-12-en-30-oicacid30-O-[3′-O-(sodiumα-D-glucopyranuronate)glycerol(1′→30)]ester)，按照CA(ChemicalAbstracts)命名原则，其化学名称为(3β，16α)-16，28-dihydroxy-3-({α-L-rhamnopyranosy-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-α-L-arabino-pyranosyl}oxy)olean-12-en-30-oicacid2-hydroxy-3-[(sodiumα-D-glucopyranuronate)-yloxy]-propylester，以下简称其为OLAG。2.权利要求I所述从九节龙提取的三結皂苷类质瘤化合物的制备方法，具体步骤如下(1)提取以九节龙为原料，原料经粉碎后，按重量体积比加入35倍原料重的甲醇或乙醇，回流提取，共提取3次，每次24小时，合并提取液，回收溶剂，得甲醇或乙醇提取物，提取物分散于按重量体积比510倍的水中，分别用和水等体积的石油瞇萃取3次，萃取后的水相再分别用与水等体积的正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，回收溶剂后得到总皇苷提取物；(2)分离J^总皂苷应用硅胶柱层析，以,比为7:2:16.5:3.5:1的氯仿-甲醇-水混合^W洗脱，薄层层析检测，收集含权利要求l所述式I化合物OLAG的流份，再用RP-18柱进行反相柱层析，以体积比为1:13:2的甲^水混合溶剂洗脱，合并含权利要求1所述式I化合物OLAG的流份，再经高效液相色谱仪分离纯化，体积比为3.5:6.54:6的甲醇-水或体积比为2.5:7.5~3:7的乙腈-水混合溶剂为流动相洗脱，得到权利要求1所述式I化合物OLAG的纯品。3.权利要求1所述从九节龙提取的三萜皂苷类抗胶质瘤化合物在制备抗胶质瘤药物中的应用。全文摘要本发明公开了从九节龙提取的三萜皂苷类抗胶质瘤化合物，分子式为C<sub>62</sub>H<sub>99</sub>NaO<sub>31</sub>，及其在治疗胶质瘤方面的应用。采用高分辨质谱和二维核磁共振谱等光谱技术，以及化学方法，确定了该化合物的化学结构。体外抗肿瘤试验表明，该化合物对U87MG、U251MG、BT325和SHG44四种人恶性胶质瘤细胞有明显的抑制作用，而不影响原代培养的人神经胶质细胞生长。本发明化合物可望成为治疗胶质瘤的药物。文档编号A61K36/185GK101333239SQ200810150539公开日2008年12月31日申请日期2008年8月4日优先权日2008年8月4日发明者张淑瑜,文爱东,汤海峰,王晓娟,冶田,峰邱申请人:中国人民解放军第四军医大学