专利名称：：生物素用于预防光老化的用途的制作方法生物素用于预防光老化的用途本发明涉及生物素，优选以特定比例组合的生物素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)，用于预防由日光诱导的皮肤老化(光老化)的用途。如果皮肤长期暴露于UV辐射下，那么这导致受影响皮肤区域出现表皮和真皮损伤，诸如角化过度、角质化形成细胞发育不良和真皮弹性组织变性，从而长期以具有光化或日光角化症的光老化皮肤形式存在。皮肤光损伤和光老化的分子机理已成为广泛研究的课题。uv辐射使得整个范围的细胞表面生长因子和细胞活素受体活化(Rittie和Fisher2002)。这种配体独立的受体活化诱发多个集中刺激转录因子AP-1的下游信号途径(downstreamsignalingpathways)。通过AP-1上调的基因中的一些是若干基质金属蛋白酶(MMP)家族的成员。因此，MMP是造成日光UV辐射诱导皮肤损伤的原因，从而影响皮肤色调和弹性，导致过早老化。MMP使皮肤细胞外基质中的胶原质和弹性蛋白降解。MMP表达和活性的增加导致胶原质的蛋白质水解增加，同时胶原质表达减少会导致皮肤弹性组织变性并起皱(Bemeburg2003)。其症状包括皮革样肌理(leatherytexture)、皱纹、斑点状色素沉着、松弛和灰黄。MMP是最重要的且被充分确定的与光老化相关的基因之一。因此，为了确定物质对光老化的的防护能力，最感兴趣的调查是它们对UVA诱导的MMP的抑制性的影响。生物素是水溶性维生素，其对皮肤、头发和指甲的功能很重要生物素缺乏会导致鳞状的粗糙皮肤和易断指甲。此外，生物素是若干种羧化酶(诸如乙酰基-CoA羧化酶、甲基巴豆酰基-CoA羧化酶、线粒体丙酰-CoA羧化酶、线粒体丙酮酸羧化酶)中负责二氧化碳转化的辅助因子。(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是会抑制各种皮肤胶原酶的膳食化合物中的一种(Lee等，2005)。本文所用术语"EGCG"指(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯及/或其衍生物(例如酯化形式、苷、硫酸酯/盐)中的一种或多种。本发明的目的在于提供一种会预防由日光诱导的皮肤老化(光老化)的活性成分。本文所用术语"日光"指天然的和/或人造的日光，其除了UV辐射以外由其还包括IR辐射。因此，所述活性成分应当预防由UV辐射引起的皮肤老化以及由IR引起的皮肤老化。现在令人惊讶地发现，本发明的目的通过如下实现使用生物素用于减少由日光诱导的胶原质和/或弹性蛋白降解、皱纹、细纹和/或皮肤老化胶原酶以及/或者用于抑制由日光诱导的胶原酶。甚至更惊讶地发现，通过生物素和EGCG的协同组合会以甚至更优选的方式实现本发明的目的。因此，更优选使用协同组合的生物素和EGCG以减少由日光诱导的胶原质和/或弹性蛋白降解、皱纹、细纹和/或皮肤老化胶原酶以及/或者抑制由日光诱导的胶原酶。活性成分可以通过口服组合物或局部用/化妆用组合物的形式施用，然而优选口服。本文所用术语"口服组合物"指用口服用的组合物。因此，本发明的口服组合物可以作为食品、饲料和饮料的补充剂，作为膳食补充剂或者作为药物制剂，它们可以是固体(诸如胶囊或片剂)或液体(诸如溶液或悬浮液)。此外，术语"口服组合物"还包括含有一种或两种本发明的活性成分的食品、饲料和饮料。本文所用术语"局部用组合物"指可以局部施用到哺乳动物的角质组织上的化妆品组合物。本申请中使用的术语"化妆品组合物"指例如在R6mppLexikonChemie，第10版1997，GeorgThiemeVerlagStuttgart,NewYork,标题为"Kosmetika"的章节中定义的化妆品组合物。在优选的实施方式中，本发明还涉及一种口服组合物，其包含比例在1:l至l:5000范围内的协同组合的生物素和EGCG。本领域普通技术人员不会预见到生物素与EGCG的组合对于抑制4UVA诱导的MMP1具有出众的协同作用，从而达到防老化/抗皱效果。在实际暴露于日光/UV光之前使用数天至数周协同组合的生物素和EGCG还会预防光老化。在强烈日晒(即日光浴)之前、期间和/或之后立即涂敷，其也具有防护性。如果生物素与EGCG组合施用，那么本发明优选使用(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯本身。在本发明的进一步优选实施方式中，所用EGCG具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少92%、最优选至少94%的纯度。由其优选的是含有EGCG的水性绿茶萃取物，其中EGCG的含量基于所述提取物的总量为至少80%(优选为至少85%、更优选为至少90%、甚至更优选为至少92%、最优选为至少94%)，所述萃取物例如且优选通过US6，383，392、EP1103550、US10/246112和EP1077211中所述的任意一种方法得到。优选地，其它多酚和儿茶素(诸如没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、没食子儿茶素和表儿茶素)的总量基于所述绿茶提取物的总重小于或等于5重量％。更优选地，没食子儿茶素没食子酸酯的含量小于或等于2.5重量％，和/或表儿茶素没食子酸酯的含量小于或等于5重量％(优选小于或等于3重量％)。根据本发明，有利的是，咖啡因在绿茶提取物中的含量基于所述绿茶提取物的总重小于或等于2.5重量％(优选小于或等于0.1重量％)，和/或没食子酸在绿茶提取物中的含量基于所述绿茶提取物的总重小于或等于0.1重量％。如果生物素与EGCG组合施用，那么根据本发明有利的是，生物素与EGCG的比例在1:l至l:5000的范围内，优选在l:3至1:3000的范围内，最优选在l:5至1:1000的范围内。如果意欲口服活性成分，那么根据本发明有利的是，以其有效日常用量(日剂量)处于下述范围内的方式服用活性成分。因此，日剂量是以一次使用全部的方式(通过单一剂量)施用还是以多次剂量的形式施用并不相关。生物素对于体重约70kg的人来说，日剂量不应超过40mg，优选不应超过25mg;对于体重约70kg的人来说，日剂量优选介于0.03至40mg之间，更优选介于0.06至25mg之间。EGCG:对于体重约70kg的人来说，日剂量为50至600mg;对于体重约70kg的人来说，优选日剂量为150至300mg。如果组合物被制备成适于口服的片剂、胶囊、颗粒或散剂形式，那么可以使用赋形剂，诸如作为载剂的乳糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、脲、淀粉、糊精和/或麦芽糊精、磷酸钙和/或磷酸氢钙、高岭土、结晶和/或微晶纤维素和/或硅酸；结合剂，诸如水、乙醇、丙醇、单糖、葡萄糖溶液、淀粉和/或氢化淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、虫胶(shellac)、甲基纤维素、乙基纤维素、磷酸钙和/或聚乙烯基吡咯垸酮；绷解剂，诸如干淀粉、交联羧甲基纤维素、交联维酮、藻酸钠、琼脂粉末、海带淀粉粉末(laminaranpowder)、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、硬脂酸甘油一酯、淀粉和/或乳糖；防绷解剂，诸如硬脂酸、可可油脂和/或氢化油；吸收剂(absorbefacient)，诸如季铵碱和/或月桂基硫酸钠；保湿剂，诸如丙三醇和/或淀粉；吸附剂，诸如淀粉、乳糖、高岭土、斑脱土和/或硅胶；润滑剂，诸如被纯化的滑石、硬脂酸盐、硼酸粉末和/或聚乙二醇；矫味剂(tastecorrigents)，诸如蔗糖、桔皮、柠檬酸和/或琥珀酸；等等。如果组合物被制成片剂形式，那么其可以被提供为由常见包衣包覆的片剂，例如糖包衣片剂、明胶包衣片剂、肠包衣片剂、膜包衣片剂、双层包衣片剂、多层包衣片剂等等。胶囊通过如下制成将根据本发明的化合物与以上或者根据现有技术列举的各种载剂混合，然后将混合物装入硬质凝胶胶囊、软质胶囊等等中。可以将具有多种维生素和矿物的补充剂加入本发明的组合物中，从而例如使营养良好平衡或者获得在一些膳食中缺乏的适量必需营养。具有多种维生素和矿物的补充剂还可用于疾病预防和对由于生活方式和共有的不当膳食结构(有时在糖尿病患者中可见)引起的营养缺乏和不足的防护。根据本发明的组合物可以是食品或饮料组合物。饮料可以例如是运动饮品、能量饮品或其它软饮品、或任意适当的饮料制剂。运动饮品是这样的饮料，其应当为运动员补充体液以及恢复电解质、6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>糖和其它营养。运动饮品同时是等压的，这意味着它们含有与人体中的营养物质相同的比例。能量饮品是这样的饮料，其包含(合法的)刺激物、维生素(尤其是维生素B)以及/或者矿物质，从而使使用者能量猛增。通常的成分包括咖啡因、瓜拉那(guarana)(来自瓜拉那植物的咖啡因)和/或牛磺酸、各种形式的人参、麦芽糊精、肌醇、肉碱、肌酸、葡醛内酯(glucuronolactone)、辅酶Q10和/或银杏叶提取物(ginkgobiloba)。其中的一些可以包含高水平的糖或葡萄糖，而另一些完全或部分采用糖醇和/或人造甜味剂(如环己氨基磺酸Ca(Ca-clamate)或天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame))增甜。一些上述饮料被调味和/或被着色。软饮品是不含酒精的饮品。一般而言，该术语仅用于凉饮料。热巧克力、茶和咖啡被认为不是软饮品。该术语原本专指碳酸饮品并且仍常用在这种方式中。如果组合物被制成以下食品中的任意一种的形式，那么根据本发明组合物中生物素的含量和EGCG(如果需要)的含量选自下表所给定范围是有利的<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>如果组合物被制成片剂或胶囊形式，那么根据本发明组合物中生物素的含量和EGCG(如果需要)的含量选自下表所给定范围是有利的:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例lEGCG和生物素在抑制UV-A诱导的基质金属蛋白酶表达上的协同效应将初代人真皮纤维原细胞在不含谷氨酰胺且被抗生素/抗真菌素、2mML-谷氨酸盐和7.5%的胎牛血清补充的EMEM(Earle的最低必要培养基)中在37"/5%0)2下进行培养，并且生长至100%融合。照射前48小时，用在EMEM(具有AB/AM、L-谷氨酸盐和2%FCS)中的期望物质预孵化细胞。24小时后，培养基用含有该物质的新培养基(新制成的)替换。为了照射，将培养基取出，在用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)进行6次洗涤步骤后用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)进行替换。然后，将该板暴露于30J/cn^的UVA1下。UVA1的输出量为约150mW/cm2。照射后，将细胞微型板中的磷酸缓冲盐水与含有物质的培养基(+7.5%FCS)(新制备的)交换，然后将细胞在C02孵化器中孵化另外24小时(MMP-1确定)。取出培养基，用磷酸盐缓冲的盐水冲洗细胞，然后将整块板冷冻在液氮中。采用Rneasy总RNA试剂盒(Qiagen,Hilden;Germany)分离总RNA。通过260/280下的光度测量确定RNA浓度。利用用于RT-PCR的SuperscriptTMmFirst-Strand合成系统将总RNA(75ng)的等分试样应用于cDNA-合成。分析两个试样中的每种化合物。在Opticon1(MJResearch,Waltham，MA，USA)上采用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,Darmstadt,Germany)实施PCR反应。为了比较实时PCR对照细胞和被处理细胞间的相对表达，使用2(—55€(7))方法。结果汇总在表1中。与在未照射细胞中探测到的水平(未示出)相比，UV-A处理使MMP-1RNA增加了10倍。EGCG和生物素使这种表达分别减少了13%和66%。明显不同的是，当组合这些物质时，UV-A诱导的MMP-1表达完全消失了。这意味着EGCG和生物素对MMP-1调节具有协同效应，因为观察到的抑制作用与预期的抑制作用(单个化合物数值的总和)之间的差值为正值(即21%)。表l:MMP-1在皮肤纤维原细胞中的表达<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2长效防老化预防的片剂组成-.<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>制备:将生物素、TeavigoTG、成块的乳糖、微晶纤维素、二氧化硅和交联维酮加入适当的容器中，然后用滚筒混合机混合20分钟。硬脂酸镁用1mm的筛子进行过筛，加入，然后将组合物再混合2分钟。采用KorschXP1片剂冲压机将粉末压制成片剂，冲模尺寸为17X7.87mm的椭圆形。从春天(即日光曝晒量增加前至少两个月)开始应当每天服用一片，服用整个季节。实施例3促进防老化保护的速溶饮品组成<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>用500pm的筛子过筛所有成分。将粉末置于适当的容器中，然后在滚筒共混机中混合至少20分钟。通过加水使35g粉末形成1升饮料。速溶饮品包含50mgEGCG和0.5mg生物素/(每份240ml备饮饮品)。推荐在大量日晒或日光浴期间和以后每天饮用至多3份。实施例4用于连续基础防老化保护的薄荷糖组成<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>将TeavigoTG、生物素、抗坏血酸细颗粒、山梨糖醇、芳香剂(AromaFrescofortePermaseal60470-31(Givaudan)禾口AromaEiszuckerPermaseal60153-73(Givaudan))、甜味剂和PEG6000混入滚筒中，然后用滚筒混合机混合10分钟。用1mm的筛子过筛山梨糖醇和二氧化硅，然后将其在单独的滚筒中混合10分钟。将两个粉末混合物组合，然后再混合10分钟。用lmm的筛子过筛硬脂酸镁，添加后再混合2分钟。采用KorschXPl片剂冲压机将粉末压制成片剂，冲模尺寸为8mm圆形。推荐每天服用至多5个薄荷糖。TEAVIGOTG:DSMNutritionalProducts的商品；TablettoseTM80:BrenntagN.V.的商品；Aerosil200:Degussa的商品PolyplasdoneXL10:ISP的商品。权利要求1.生物素用于抑制由日光诱导的胶原酶的用途。2.生物素用于减少由日光诱导的胶原质和/或弹性蛋白降解的用途。3.生物素用于预防和/或减少由日光诱导的皱纹和细纹以及/或者光老化的用途。4.如权利要求1至3中任意一项所述的生物素的用途，所述生物素与(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)协同组合。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，生物素与EGCG在所述组合中的比例在l:l至l:5000的范围内。6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，生物素与EGCG在所述组合中的比例在l:3至1:3000的范围内。7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，生物素与EGCG在所述组合中的比例在l:5至1:1000的范围内。8.如权利要求1-7中任意一项所述的生物素和可选应用的EGCG的用途，所述生物素和可选应用的EGCG在适于口服的组合物中作为活性成分。9.一种含有生物素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的组合的口服组合物，其特征在于，生物素与EGCG的比例在1:1至1:5000的范围内。10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，生物素与EGCG的比例在l:3至1:3000的范围内。11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，生物素与EGCG的比例在l:5至1:1000的范围内。全文摘要本发明涉及生物素优选以特定比例组合的生物素和(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)用于预防由日光诱导的皮肤老化(光老化)的用途。文档编号A61K31/4188GK101678003SQ200880015483公开日2010年3月24日申请日期2008年5月7日优先权日2007年5月10日发明者瑞吉纳·格劳克泽克,约瑟夫·斯楚瓦格尔申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司