专利名称：：新型人抗r7v抗体及其应用的制作方法新型人抗R7V抗体及其应用本发明涉及能够与HIV的R7V表位特异结合的新型人抗体。这些抗体具有人的所有CDR并能够特异地中和包括逃逸突变体在内的所有HIV株。其可以用于治疗HIV感染，特别是在HAART失败的患者中。
背景技术：
：HIV感染仍然是威胁公共健康的流行病。尽管药物治疗可以限制感染后HIV的复制和毒力，但目前还没有预防性或治愈性的治疗方法。此外，高效抗逆转录病毒疗法(HAART)除减少AIDS夕卜，还导致多种副作用并导致耐药病毒的出现，这加强了对其它抗HIV疗法的需求。然而，一些被称为"无进展者"的HIV感染者在感染10年、15年或更长时间后并没有发展成为AIDS病，这表明可以通过诸如减毒病毒'、缺陷病毒2、HIV共同受体突变s"或中和抗体5的出现等多种方法延缓HIV疾病。基于包膜的所有常规抗体诱导疫苗都显示其因病毒高突变率而造成的局限性和弱免疫原性。在以往的研究中6，我们证明了从无进展者的血清纯化出的广谱中和性抗R7V抗体的潜能。这些免疫球蛋白靶向源自P2-微球蛋白并在出芽过程中并入HIV外壳中的被称为R7V(RTPKIQV氨基酸序列)的细胞表位7'8。本发明的目的是从无进展患者的B-淋巴细胞中分离出相应的基因后，通过杆状病毒载体产生重组抗R7V抗体。所述杆状病毒技术可以产生并分泌出得到正确装配和糖基化的免疫球蛋白9。这些重组的抗体具有亲本免疫球蛋白的所有功能特性1Q'u，并显示有效的效应子功能，例如结合(i)补体成分Clq""或C3"和(ii)诱导抗体导向细胞毒性所需的IgGFc受体15'16'13。在本发明中，发明人构建了靶向于HIV病毒出芽过程中所需的细胞表位R7V的重组抗体。已经从无进展患者的B淋巴细胞中克隆了编码抗R7V抗体可变区的cDNA。构建了包含该抗体重链和轻链的完整编码序列的两个转移载体，并通过杆状病毒DNA和两个转移载体之间的双重组产生重组杆状病毒。被该杆状病毒感染的昆虫细胞产生完整的人抗R7V免疫球蛋白。发明人已经证明所述特异于R7V肽的重组抗体识别并中和包括耐药病毒在内的所有HIV1分化株，这给出了抗-HIV治疗的新思路。
发明内容因此，根据本发明的第一实施方式，本发明的主题是分离的抗体或者其一种功能片段，所述抗体或所述其一种片段能够特异地结合R7V表位(RTPKIQV-SEQIDNo.ll)并能够中和HIV株，其包含i)包含互补决定区CDR的轻链，所述CDR包含氨基酸序列SEQIDNo.1(QSVLYSSNNKNY)、SEQIDNo.2(WAS)和SEQIDNo.3(QQYYSTPQT)，或者所述CDR在最佳比对后其序列与SEQIDNo.1、2或3具有至少80%、优选90%同一性；和ii)包含CDR的重链，所述CDR包含氨基酸序列SEQIDNo.6(GGSISSYY)、SEQIDNo.7(IYYSGST)和SEQIDNo.8(ARGRSWFSY)，或者所述CDR在最佳比对后其序列与SEQIDNo.6、7禾Q8具有至少80%、优选90%同一性。在本发明中，与抗体化合物或其序列相关的术语多肽、多肽序列、肽和蛋白可以互换。应理解，本发明不涉及天然形式的抗体，也就是说抗体没有处于其天然环境中，但它们已能够通过纯化从天然来源中分离或获得，或者通过基因重组获得，或者通过化学合成获得，并且能够包含如下文所述的非天然氨基酸。CDR区或CDR意在表示如Kabatetal.(Kabatetal.，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thEd.，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH,1991，及其后续版本)所定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高变区。存在3个重链CDR和3个轻链CDR。根据具体情况，本文使用术语CDR是为了表示包含大多数负责通过抗体亲和力结合其识别的抗原或表位的氨基酸残基的这些区域中的一个，或者是这些区域的数个乃至全部这些区域。在本发明中，两个核酸或氨基酸序列间的"同一性百分数"意在表示通过最优比对(最佳比对)获得的两个待比较序列间相同核苷酸的百分数或相同氨基酸残基的百分数，这个百分数是纯粹的统计结果，并且所述两个序列间的差异在其全长上随机分布。两个核酸或氨基酸序列间的序列比较通常通过在以最佳方式比对这些序列后比较它们而进行，所述比较能够通过区段(segment)或通过"比较窗口"进行。除手工方式外，待比较序列的最佳比对还可以通过Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2:482]的局部同源算法的方式，通过Neddleman和Wunsch(1970)[J.Mol.Biol.48:443]的局部同源算法的方式，通过Pearson禾BLipman(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444]的相似度査询法的方式，通过利用这些算法的计算机软件的方式(WisconsinGenetics软件包(GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，或者通过BLASTN或BLASTP比较软件)进行。两个核酸或氨基酸序列间的同一性百分数通过比较以最佳方式比对的这两个序列来确定，其中相对于用于这两个序列间的最佳比对的参考序列，待比较的核酸或氨基酸序列可以包含添加或缺失。同一性百分数的计算可以通过测定两个序列间核苷酸或氨基酸残基相同的相同位点的数量，用该相同位点数量除以在比较窗口中的位点总数，并将所获得的结果乘以100来进行，从而得到这两个序列间的同一性百分数。例如，可以使用BLAST程序，"BLAST2sequences"(Tatusovaetal.,"Blast2sequences-anewtoolforcomparingproteinandnucleotidesequences",FEMSMicrobiolLett.174:247-250)可以在以下网址获得http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html，所使用的参数是给出的缺省值(特别是对于参数"开放空位罚分"5;和"延伸空位罚分"2;所选择的矩阵为，例如由所述程序提供的矩阵"BLOSUM62")，通过所述程序直接计算两个待比较序列间的同一性百分数。与参考氨基酸序列具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列优选相对于参考序列具有某些修饰，特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或取代，截短或延长的那些序列。在一个或多个连续氨基酸或不连续氨基酸被取代的情况下，优选被取代氨基酸是被"等价"氨基酸替代的取代。本发明的术语"等价氨基酸"意在表示能够将基本结构的氨基酸之一取代，但基本不改变相应抗体的生物活性的任何氨基酸，如将在下文中，特别是实施例中定义的氨基酸。这些等价氨基酸可以根据其与其替代的氨基酸的结构同源性来确定，或者根据能够进行的不同抗体间生物活性比较试验的结果来确定。举例而言，可提及能够进行但不引起相应修饰抗体的生物活性的重大改变的取代的可能性。因此，可能用缬氨酸或异亮氨酸替代亮氨酸，用谷氨酸替代天冬氨酸，用天冬酰胺替代谷氨酰胺，用赖氨酸替代精氨酸等，当然也可以设想在相同条件下进行反向取代。本发明的抗体优选为完整的人单克隆抗体或其功能片段。在一个具体实施方式中，本发明抗体的特点是轻链包含的氨基酸序列在最佳比对后与图3B所示的氨基酸序列SEQIDNo.4具有至少80%、优选90%同一性，或者编码轻链的核苷酸序列包含图3A所示的序列SEQIDNo.5或包含在最佳比对后与SEQIDNo.5具有至少80%、优选90%同一性的序列。在另一个具体实施方式中，本发明抗体的特点是重链包含的氨基酸序列在最佳比对后与图3D所示的氨基酸序列SEQIDNo.9具有至少80%、优选90%同一性，或者编码重链的核苷酸序列包含图3C所示的序列SEQIDNo.10或包含在最佳比对后与SEQIDNo.10具有至少80%、优选90%同一性的序列。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含轻链和重链，其中所述轻链包含图3B所示氨基酸序列SEQIDNo.4或由包含图3A所示序列SEQIDNo.5的核苷酸序列编码，所述重链包含图3D所示氨基酸序列SEQIDNo.9或由包含图3C所示序列SEQIDNo.10的核酸序列编码。本发明的抗体功能片段意在具体指抗体片段，例如Fv、scFv(sc表示单链)、Fab、F(ab，)2、Fab，、scFv-Fc片段或二聚抗体(diabody)，或通过化学修饰，例如添加聚(亚烷基)二醇，例如聚乙二醇("聚乙二醇化")(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab，)2-PEG或Fab，-PEG的聚乙二醇化片段)("PEG"表示聚乙二醇)，或通过并入到脂质体中而使半衰期提高的任何片段，所述片段具有本发明SEQIDNo.1、2、3、6、7禾H8序列的CDR，并且特别的是，其能够中和HIV株。优选地，所述功能片段由其来源抗体的重可变链或轻可变链的部分序列构成或包含所述部分序列，所述部分序列足以保持同样的结合特异性。优选地，这些功能片段为Fv、scFv、Fab、F(ab，)2、F(ab，)、scFv-Fc型或二聚抗体片段，其通常具有与亲本抗体相同的结合特异性。根据本发明，可以利用例如上述抗体为起始物通过诸如酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶的消化和/或通过化学还原反应断裂二硫键的方法获得本发明的抗体片段。在另一个方式中，可以通过本领域技术人员熟知的基因重组技术或使用例如自动肽合成仪例如AppliedBiosystems等公司提供的自动肽合成仪通过肽合成法获得本发明所包含的抗体片段。在更优选的方式中，本发明包含通过基因重组或化学合成获得的本发明的抗体或其功能片段。在优选方式中，本发明的所述功能片段选自片段Fv、scFv、Fab、(Fab，)2、Fab，、scFv-Fc或二聚抗体，或通过化学修饰，特别是聚乙二醇化或通过并入到脂质体中而使半衰期提高的任何功能片段。本发明还涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含在最佳比对后与序列SEQIDNo.5具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。本发明还涉及分离的核酸，所述分离的核酸包含在最佳比对后与序列SEQIDNo.10具有至少80%、优选85%、90%、95%和98%同一性的序列。所述"在最佳比对后与优选序列具有至少80%、优选85%、卯％、95%和98%同一性百分数的核酸序列"意在表示相对于参考核酸序列，具有某些修饰例如特别是缺失、截短、延长、嵌合和/或取代，特别是点取代的核酸序列。其优选包括其编码的氨基酸序列与参考序列编码的氨基酸序列相同的序列(这与基因编码的简并性有关)，或者能够特异地与参考序列杂交，优选在高严格条件下，特别是如下文限定的条件下杂交的互补序列。在高严格条件下的杂交表示所述温度条件和离子强度条件经选择而可以保持两个互补DNA片段间的杂交。出于例示的目的，用于定义上述多核苷酸片段的杂交步骤的高严格条件有利地为以下条件DNA-DNA或DNA-RNA杂交分两步进行(1)42"C在磷酸盐缓冲液(20mM，pH7.5)中预杂交3小时，所述磷酸盐缓冲液包含5xSSC(lxSSC对应于0.15MNaCl+0.015M拧檬酸钠溶液)、50%甲醛、7%的十二烷基硫酸钠(SDS)、10xDenhardt，s、5%硫酸葡聚糖和1%的鲑鱼精子DNA;(2)在依赖于探针大小的温度(即对于探针大小>IOO个核苷酸的探针，该温度为42'C)8下实际杂交20小时，然后在2(TC于2xSSC+2。/。SDS中洗涤两次，每次20分钟，在20。C于0.1xSSC+0.1。/。SDS中洗涤一次，20分钟。对于探针大小>100个核苷酸的探针，最后一次洗涤于6(TC在0.1xSSC+0.1%SDS中进行30分钟。本领域技术人员可以根据Sambrooketal.(1989,Molecularcloning:alaboratorymanual.2ndEd.ColdSpringHarbor)的教导，对用于特定大小多核苷酸的上述高严格杂交条件进行修改以适应较大或较小的寡核苷酸。本发明还涉及包含以上定义的核酸，特别是SEQIDNo.5和SEQIDNo.10的核酸的载体。本发明的目的特别是包含本发明核苷酸序列的克隆载体和/或表达载体。9.例如，本发明的目的在于包含以上定义的核酸序列，特别是SEQIDNa5和SEQIDNo.10核酸序列的杆状病毒转移载体。本发明的载体优选包含可以在指定宿主细胞中表达和/或分泌核苷酸序列的元件。因此，所述载体必须包含启动子、翻译起始和终止信号以及适当的调控转录区。所述载体必须能够以稳定的方式保持在宿主细胞中，并能够任选具有弓I导分泌所翻译蛋白的特定信号。本领域技术人员可以根据所使用的宿主细胞的功能选择并优化这些不同的元件。为此目的，可以将本发明的核苷酸序列插入到所选宿主中的自复制载体中，或者所选宿主的整合载体中。可以通过本领域技术人员目前使用的方法制备此载体，并且可以通过标准方法例如脂质转染法、电穿孔法、热休克或化学方法将所得克隆引入到适当的宿主中。本发明的载体为，例如源自质粒或病毒的载体。它们可以用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的核苷酸序列。本发明还包括被本发明载体转化的或包含本发明载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以选自原核系统或真核系统，例如细菌细胞和酵母细胞或动物细胞，特别是哺乳动物细胞。还可能使用昆虫细胞或植物细胞。因此，根据另一方面，本发明涉及分泌以上定义的抗R7V人抗体的细胞系。例如，上述抗体可以获自于EBV永生化的B淋巴细胞，昆虫细胞例如使用杆状病毒载体的Sf9细胞，或者其它产生抗体的细胞系，例如CHO(ATCC号为CCL-61，经基因修饰以产生低岩藻糖基化抗体的CHO)，或者YB2/0(ATCCCRL-1662)细胞系。9根据另一方面，本发明涉及产生本发明抗体或其一种功能片段的方法，其包括以下步骤a)在培养基和适当的培养条件下培养本发明的宿主细胞；和b)从所述培养细胞的培养介质中提取所述抗体。能够通过上述方法获得的抗体或其一种功能片段也在本发明的范围之内。根据另一方面，本发明涉及作为药物的上述定义抗体或其一种功能片段。本发明还涉及包含作为活性成分的本发明抗体或其一种功能片段以及赋形剂和/或药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个实施方式中，本发明涉及进一步包含以至少一种目前用于AIDS治疗的药剂和上述抗体作为用于同时、单独或顺次使用的组合产品的上述组合物。"同时使用"的含义理解为以同一个药物剂型施用本发明组合物的两种化合物。"单独使用"的含义理解为以不同的药物剂型同时施用本发明组合物的两种化合物。"顺次使用"的含义理解为分别以不同的药物剂型连续施用本发明组合物的两种化合物。例如，可将抗R7V抗体与以下组合施用依法韦伦(efavirenz)+齐多夫定(zidovudine)+拉米夫定(lamivudine)依法韦伦+泰诺福韦(tenofovir)+恩曲他滨(emtricitabine)司他夫定(stavudine)+拉米夫定+奈韦拉平(nevirapine)利托那韦(ritonavir)强化的洛匹那韦(lopinavir)+齐多夫定+拉米夫定利托那韦强化的洛匹那韦+泰诺福韦+恩曲他滨。本发明包括本文所述抗体在制备药物中的应用，特别是用于治疗HIV感染AIDS的药物，例如接受HAART治疗的患者，特别是HAART治疗失败的患者中的HIV感染AIDS的药物。将参考以下附图和实施例对本发明做进一步的说明。图1:用于表达抗R7V抗体的免疫球蛋白特异转移载体的示意图。图1A:可以表达轻链的转移载体pVT-Ck的示意图。图1B:可以表达重链的转移载体pVT-CYl的示意图。图2:在利用从根据R7V抗原选择的永生化B-淋巴细胞中提取的总RNA合成的cDNA上的VH(图2A)或VL(图2B)序列的PCR扩增。利用适当的恒定3'引物和特异于给定VH或VL基因家族的一组5'引物，根据材料和方法中的阐述进行扩增。在1.5%琼脂糖凝胶上对20|11PCR反应物进行电泳分离，并用溴化乙锭进行染色。Cvh泳道对照VH序列；Cvl泳道对照VL序列；MW泳道SmartLadder分子量标准物(Eurogentec):200、400、600、800、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、8000、10,000bp。图3:在永生化B-淋巴细胞中表达的抗体的轻链(K4)和重链(M4)可变区的核苷酸序列(图3A和图3C)和氨基酸序列(图3B和图3D)与最同源种系基因的比较。氨基酸序列以单个字母代码表示。所使用的编号系统基于IMGT(h加:〃imgt.cines.fr)的惯例。突出显示了VH和VL序列的互补决定区(CDR)。序列中的虚线表示与上行给出的残基相同。IGHJ、IGHD和IGKJ基因用框图标出。图4:用50叫/ml抗R7V抗体或无关抗体中和HIV,分化株(HIViclades)。实施例实施例l:有效的人重组抗R7V抗体的分离和构建1.1材料和方法l丄l细胞和病毒利用Ficoll-Paque(Amersham)梯度离心从血清反应阴性的健康捐赠者的新鲜K2E-EDTA血液样品中分离人外周血单核细胞(PBMC)。培养的细胞以lxl()S细胞/ml的密度在具有以下组成的完全RPMI培养基中培养:RPMI1640(Biowhittaker)，补充有10。/。热灭活胎牛血清(GIBCO)、1%青霉素/谷氨酰胺(GIBCO)、10Ul/mlIL2(Euromedex)、10pg/mlPHA-P(Difco，最初3天中)禾口2fig/ml聚凝胺(polybrene,Biowhittaker)。CEM细胞系以0.5xl()S细胞/ml在RPMI-10%培养基(含10%热灭活胎牛血清、1%青霉素/谷氨酰胺、2lag/ml聚凝胺的RPMI1640)中培养。由受感染的CEM细胞产生NDK(分化株D)和抗AZT的RTMC(分化株B)病毒。92UG029(分化株A)、92BR021(分化株B)、92BR025(分化株C)和93BR029(分化株F)病毒最初由美国国立卫生研究院(NIH)过敏和传染性疾病研究所(NIAID)AIDS系的AIDS研究和参考试剂组(AIDSResearchandReferenceReagentProgram)提供，并由PBMC产生。病毒BCF06(分化株O)禾卩YBF30(老分化株)由F.Barre-Sinoussi(PasteurInstitute,法国)惠赠。来自感染细胞上清液的滴定病毒试样在-8(TC冷冻保存。Sf9细胞在28。C补充有5。/。热灭活胎牛血清(GIBCO)的TC100培养基(GIBCO)中培养。在Sf9细胞中繁殖野生型苜蓿丫纹夜蛾(JMtograp/^cfl/z/wro'ca)多核多角体病(AcMNPV)病毒克隆1.217和重组杆状病毒。l丄2从无进展患者分离外周血单核细胞(PBMC)在本研究中募集知情同意的HIV血清反应阳性无进展患者，并通过Ficoll-Paque密度梯度分离从新鲜K2E-EDTA静脉血中纯化PBMC。这些PBMC在补充有15%热灭活FCS和1%青霉素/谷氨酰胺而不含IL2和PHA的RPMI1640培养基中预培养2天，这有利于在永生化之前促进B淋巴细胞的生长。1.1.3利用Epstein-Barr病毒(EBV)使B淋巴细胞永生化此后，通过在含补充有10。/。热灭活FCS、l。/。青霉素/谷氨酰胺的3mlRPMI1640的50ml圆锥瓶中将2mlB-95.8培养上清液(产生EBV的细胞系)和9x106预培养的PBMC混合，从而使B-淋巴细胞永生化。在37"C水浴温育2小时后，加入补充有10。/。热灭活FCS、1吗~1环孢霉素A(Calbiochem)和1%青霉素/谷氨酰胺的5mlRPMI1640。将10ml细胞悬液转移到37°C、5%C02的加湿培养箱中的25cn^组织培养瓶中，并静置培养4周。在4周培养结束时，EBV-永生化细胞形成肉眼可见的团块，并以10S细胞/ml在RPMI-20c/()中每周传代两次来保持该细胞系。l丄4分泌抗R7V抗体的B淋巴细胞的分离使用氨基己酸形式的R7V肽包被磁珠在缓慢倾斜转动下，将lOjigR-8-Ahx肽(Neosystem)与107个甲苯磺酰基-活化磁珠(DynalDynabeadsM450)在37'C—起温育16-24小时。按照生产商说明的程序洗涤磁珠并以4.1()8珠子/ml重悬在pH7.4的PBS中。分泌抗R7V抗体的B淋巴细胞的磁性筛选于4"C将含107EBV-永生化B淋巴细胞的lml无菌PBS与24106个R-8-Ahx包被的磁珠混合20分钟，并重复三次直至不再有细胞固定在磁珠上。通过将试管置于磁场中2分钟来分离莲座细胞。在不打乱磁珠的情况下除去上清液，并将细胞重悬在PBS洗涤缓冲液中。该洗涤步骤重复3次，随后将固定在磁珠上的细胞于37'C、5%C02的RPMI-20%FCS中培养。一天后，细胞从磁珠脱离并以106细胞/1111进行培养。在按照与培养分泌抗R7V抗体的预选B淋巴细胞相同的方案培养2周后，重复该磁性筛选。1.1.5ELISA方法根据生产商的说明，通过抗R7VELISA试验(AntiR7VTMIVR96000,IVAGEN，法国)检测抗R7V抗体。简而言之，将阳性对照、阴性对照、截留校准物(cut-offcalibrator)和稀释抗体(100iu1/孔)加入到R7V-包被的试验平板中，并在室温下温育30分钟。通过偶联辣根过氧化物酶的抗人IgG抗体检测结合的抗R7V抗体。1.1.6.中和试验提前根据以下稀释度滴定病毒储液，从而使每个试验中的TCID50为10018:HIV-lNDK(稀释度10—5)、HIV-lRTMcAZT-耐性株(稀释度510—5)、92UG029(稀释度10—2)、92BR021(稀释度1(T3)、92BR025(稀释度1(T2)、THA92022(稀释度10-2)、93BR029(稀释度10—2)、BCF06(稀释度10'4)和HIV-1YBF3Q(稀释度10—3)。在37°C、5%C02的加湿培养箱中，将病毒稀释液(50pl)在含50MlRPMI-0%(含100吗/ml抗体，终浓度为50吗/ml)的96孔微滴定板中预温育1小时。将PBMC(50^含lxlO勺加入到病毒-抗体混合物中，并于37r温育l小时，然后用培养基洗涤细胞三次，并在最初3天以106细胞/1111培养在包含50pg/ml抗体的完全RPMI-10。/。的24孔微滴定板中。将培养物培养10天，并每3天进行传代。对病毒对照(未加入抗体的HIV感染细胞)、细胞对照(未加入抗体的非感染细胞)和抗体对照(靶向与HIV无关的表位的无关抗体)进行同样的试验。为了测定各个样品中的病毒复制，对反转录酶进行如下的定量测量。将每3天收集的lml不含细胞的上清液样品以95,000rpm在4"C超离心5分钟(TL100Beckman)。将病毒沉淀重悬在10pl0.1%TritonX-100NTE(100mMNaCl、10mMTris、1mMEDTA)缓冲液中，以释放病毒的酶。在含50mMTris(pH7.8)、20mMMgCl2、20mMKCl、2mM二硫苏糖醇(DTT)、0.25OD/ml寡聚-dT、0.25OD/ml多聚-rA和50^Ci/m3HdTTP的50pl反应混合物中进行酶促反应。在37"C温育1小时后，用lml含焦磷酸钠的5n/。TCA终止反应，并用20%的三氯乙酸沉淀合成的DNA产物，通过用Millipore0.45ym过滤收集，并在Packard闪烁计数器上以dpm/ml测量卩放射性。中和百分比表示为。l丄7具有抗R7V特异性的抗体可变区的分离和克隆该方法在所述用于扩增鼠可变抗体区的技术19上进行了改进。利用RNeasy试剂盒(Qiagen)从约5.106永生化B淋巴细胞中提取总RNA。简而言之，用600plRLTTM/p—巯基乙醇缓冲液裂解细胞，并连续通过20号针以使其均质化。加入600)il70。/。的乙醇后，将混合物置于RNeasy柱上并以12,000rpm(Biofuge,Heraeus)离心15秒。依次用700plRWFM缓冲液和500jilRPETM缓冲液洗涤柱子。用50pi不含RNAse的水洗脱RNA，并将其保存在-S(TC备用。利用总RNA和与人免疫球蛋白的恒定区hCLa、hCLb、hCK、hCG和hCM杂交的5条特异引物(表3)合成分别对应于XmRNA、kmRNA、YlmRNA和pmRNA的第一链cDNA。反转录的进行如下所述l|ng总RNA、4pl10xRTTM缓冲液(Qiagen)、4jaldNTP(每种5mM，Qiagen)、4pl浓度为10pM/pl的特异引物、20单位的RNAse抑制剂(Roche)和8单位Omniscript反转录酶(Qiagen)，总体积为40pl。将混合物在37。C温育1小时。在93。C持续5分钟以热灭活反转录活性。利用在人免疫球蛋白的重链和轻链的信号肽序列中设计的特异引物(表3)，以X链、k链、链或P链的第一链cDNA作为模板(matrix)，通过PCR扩增全长VH和VL序列。PCR反应在20pl的总体积中进行，其中包含2pl10xVentDNA聚合酶(Biolabs)、2pldNTP(每种10mM，Biolabs)、各种引物(每种20pM)、1.5pl25mMMgS04、1单位VentDNA聚合酶(Biolabs)、0.5pl反转录混合物。进行30个扩增循环，包括95'C持续30秒、55'C持续45秒和72'C持续1分钟。在72'C延伸10分钟后，在1.5。/。琼脂糖凝胶(SeaKem，FMC)上电泳分离PCR产物，并用溴化乙锭染色。通过凝胶纯化PCR产物，利用AdvantageTaq聚合酶(Clonetech)扩增并克隆到pGemTeasy质粒(Promega)中。利用PCR扩增中使用的3'和5'引物在两条链上对插入物进行测序。利用BLAST20禾nIMGTDatabase21对可变区进行序列比对和种系基因分析。l丄8表达抗R7V抗体的重组杆状病毒的构建将VH和VL序列分别插入到含有人免疫球蛋白信号肽序列、两个唯一的限制性位点和人Yl和k恒定区编码序列的特异转移载体pVTCYl和pVTQc(图l)中。pVTCYl载体含有位于信号肽序列中的唯一AflII位点以及涵盖Yl序列起始两个密码的Nhel位点，而pVTCK含有位于信号肽中的唯一BssHII位点以及与J区的最后一个保守氨基酸以及恒定k区的第一个氨基酸重叠的BsiWI位点。利用以下引物通过PCR在VH和VL序列的5'和3'末端弓I入适当的限制性位点FOR-M4:AGGACTGGTGAAGC(SEQIDNo.16),17),No.18)和BAC-K4:CGATCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCCTGGCC(SEQIDNo.19)。将用AflII-NheI消化的VH的PCR产物和用BssHII-BsiWI消化的VL的PCR产物纯化并插入到其各自的转移载体pVTCyl和pVTQc中。通过测序验证最终的构建体pVTCYl-M4和pVTCK-K4。如此前的描述(22'1Q、")，在共转染Sf9细胞后，产生表达所述抗体的重组杆状病毒。通过ELISA筛选生产性克隆23。简而言之，将用100pi1pg/ml抗人重链Fdyl多克隆抗体(TheBindingSite)包被的微滴定板与梯度稀释的细胞培养上清液一起在37。C温育2小时。利用辣根过氧化物酶标记的抗人k轻链抗体(Sigma)检测结合的重组IgG。通过DNA印迹验证重组病毒的基因组。使7ml细胞培养上清液中的病毒颗粒在35,000rpm沉降40分钟(TL100.4，Beckman)。在存在浓度为20mg/ml的10pl蛋白酶K水溶液(Roche)和浓度为10%(w/v)的10pl十二烷基肌氨酸(Sigma)水溶液的条件下，将沉淀重悬在lmlTEK缓冲液(O.lMTris、0.1MNa2EDTA2H20、0.2MKC1，pH7.5)中，并在50。C温育过夜。依次用苯酚和氯仿-异戊醇(24:l，v/v)提取病毒DNA，并用乙醇沉淀。重悬在水中后，用HindIII消化DNA。然后通过在1%琼脂糖凝胶电泳分析经限制性酶切的DNA，并将其转移到Nitmn膜(SchleicherandSchull)上。根据生产商的推荐，利用地高辛(Roche)标记分别编码人恒定Yl区和恒定k区的cDNA，并将其作为杂交探针。洗涤之后，将印迹与偶联碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(Roche,稀释度1:10,000)—起温育。利用化学发光底物CSPD(Roche)进行标记DNAl丄9重组抗体的生产和纯化以500,000个细胞/ml的密度将Sf9细胞接种在含400ml无血清培养基的旋转瓶中，并以每细胞2倍的感染倍数进行感染。在28'C温育4天后，收集上清液，并根据生产商的说明在蛋白A琼脂糖凝胶柱(Amersham)上纯化分泌的重组抗体。通过ELISA测定纯化IgG的量23。还在相似条件下，在CHO-表达系统中构建重组抗R7V抗体。1.2结果1.2.1分泌抗R7V抗体的B淋巴细胞的筛选利用R7V包被的磁珠从无进展的HIV-感染患者中筛选产生抗R7V抗体的B淋巴细胞。在首次筛选中获得了27%的分泌抗R7V抗体的B淋巴细胞，对预筛选的分泌抗R7V抗体的B淋巴细胞进行的第二次筛选获得了14%的所述细胞。通过抗R7VELISA，没有从B细胞培养上清液中检测到游离的抗R7V抗体，这表示抗体与分泌性B淋巴细胞膜结合或者低于ELISA试验的检测限。1.2.2由所选永生化B-淋巴细胞表达的VH和VL序列的分离和克隆。根据发明人此前关于小鼠免疫球蛋白的描述19，通过RT-PCR扩增由所选B淋巴细胞表达的抗体的VL区和VH区。如图2所示，仅有少数引物的组合可以扩增出大小适当的片段(VH约为450bp，VL为400bp)。当利用hCG/hVH5、hCM/hVH2和hCM/hVH3时仅观察到微弱的条带，而利用hCM/hVH4可以观察到更多的产物。利用hCK/hVK4还合成出了主要产物。然而，利用hCLa和hCLb引物对任何组合都没有检测到扩增(未显示)。PCR产物的测序和BLAST分析表明其中仅有两个片段M4片段(hCG/hVH4)和K4片段(hCK/hVK4)分别与人重链和轻链的可变区对应。这些结果表明，筛选的永生化B-淋巴细胞群可能是单克隆的，表达膜IgMk抗体。这些序列和IMGT数据库的比较表明，VH-M4重链可变区序列来自IGHV-4-59*0124、IGHD2-21*0125和IGHJ4*0226种系基因的重排(图3C)。其Vk-K4对应物显示为轻链可变区IGKV4-1*0127/IGKJ2*0228的重排(图3A)。有趣的是，该抗体使用来自k轻链库的最接近j区的IGKV4-1基因。此轻链区大体上没有被突变，仅在互补决定区3的IGKV/IGKJ连接处有一个突变(图3B)。另一方面，在VH-M4序列中观察到在互补决定区3中导致四个氨基酸突变的7个核苷酸取代，而在框架区仅观察到2个沉默核苷酸取代(图3C、3D)。1.2.3抗R7V抗体在杆状病毒表达系统中的表达将抗R7V抗体可变区的编码序列插入到轻链盒杆状病毒转移载体和重链盒杆状病毒转移载体(i)pVT-CK(经设计在多角体蛋白(polyhedrin)位点重组)和(ii)pVT-CYl(经设计在P10位点重组)中。在这些构建体中，轻链和重链基因分别在合成的P10启动子、P'10"和P10启动子的控制下(图1)。如图l所示，所用特异引物经设计而使扩增的K4和M4可以直接克隆到带有免疫球蛋白信号肽序列和恒定区的框架内。通过测序检验两个最终的构建体pVT-Ck-K4和pVT-CYl-M4，并在纯化的病毒DNA存在下用于共转染Sf9细胞。如之前的阐述^11，在两轮重组后获得双重组病毒。通过空斑纯化重组病毒并扩增。通过抗人抗体ELISA分析感染细胞的细胞培养上清液中是否存在抗体。利用人Yl和K恒定区DNA作为探针，通过DNA印迹检验4个生产性克隆的基因组。选择被称为v4cR7VI/K4-M4的一个病毒克隆进行进一步试验。1.2.4重组抗R7V抗体的特异性甚至在6.25吗/ml(对应浓度为孔中含有0.625pg抗体)时，重组抗R7V抗体在IVAGENAnti-R7VELISA试剂盒中也呈阳性。无关抗体无论其浓度如何均为阴性。如之前关于从无进展患者纯化到的抗R7V抗体的报道，通过流式细胞术分析证明重组单克隆抗体不与任何细胞结合(数据未显示)。1.2.5对多个HIV-1分化株的中和试验从患者纯化出的抗R7V抗体显示了宽中和谱，因此在相同条件下使用数种分化株对该抗R7V单克隆抗体进行检测。为了确定其作为治疗性抗体的应用，还利用耐药病毒(RTMC)进行了中和试验。为了测定抗R7V重组抗体的中和作用，在感染细胞前将50pg/ml的抗体稀释液与数种HIV-1分化株混合。所述抗R7V抗体中和了8种HIV-1的分化株和AZT抗性分化株BRTMC病毒(图4)。在相同条件下没有观察到在杆状病毒系统中表达并用作对照的无关抗体的中和作用。在5种分化株(B、C、D、F和0)中获得高于85。/。的中禾口。对于不同的病毒，利用50pg/ml重组抗R7V抗体获得了不同的中和百分数。这种不同的结果与由从HIV无进展患者纯化出的抗R7V抗体获得的结果一致，可能是由于病毒上存在的R7V表位的数量可变造成的。在CHO表达系统中构建重组的抗R7V抗体1)K4M4批号13.11.06:40(ig/ml时抗R7VELISA结果为阳性表l.抗R7V抗体的中和百分数<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>发明人在此公开了通过杆状病毒表达系统生产重组人抗R7V抗体的结果。该系统对于大量生产功能性重组抗体而言非常快速有效"'29。在鳞翅目昆虫细胞表达的重组蛋白中发现了在哺乳动物细胞中观察到的所有翻译后修饰。然而，AA-连接的寡聚糖较短且主要为高甘露糖型或寡甘露糖型3"3'31。抗体的生物活性很大程度上依赖于与免疫球蛋白CH2恒定区中Asn-292相连的1聚糖32'33。尽管该糖基化图谱不完整，但在Sf9细胞中表达的重组抗体具有特异的生物活性，例如通过Clq和FcyR结合的补体依赖性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性14'16'13。为了分离和表征HIV-1无进展患者产生的抗R7V抗体，从一名患者筛选EBV永生化的R7V反应性B细胞，并利用RT-PCR特异扩增了编码IgG或IgM免疫球蛋白可变区的cDNA。为此目的，设计了3对原始共有引物以特异扩增不论哪个V基因家族的人VH和VL区。将这些在信号序列中杂交的引物与分别靶向人恒定区Y、P、k和X的一组193'引物组合使用。与"FR"扩增策略34'35靶向的能够进行体细胞突变的框架1域相比，信号序列内突变的频率非常低，所以在该区中启动扩增可以扩增出不带突变的整个序列。对这些cDNA序列的分析表明，这些永生化细胞可能为仅表达一种膜1gMk抗体的单克隆。虽然VL序列大体上未突变而仅在VJ连接处具有一个沉默突变，但在CDR3的VH域的VDJ连接处发现6个突变氨基酸，而在FR3中仅2个沉默突变。尽管在其可变区内观察到低突变率，但由于根据流式细胞术分析发现该重组抗体不与任何细胞反应，所以其不是多反应性的。该完整人重组抗体对HIV-1亚型A、B、C、D、E、F、N、O和抗逆转录病毒疗法耐性病毒的中和能力与来自无进展患者的多克隆抗体明显相同。这些结果证明所有HIV-1变体都可以获得来自于细胞的R7V表位。利用50pg/ml抗R7V抗体获得的不同中和百分比可以与病毒上存在的R7V的数量不同有关。为了100%中和各分化株，必须对抗体的增量进行测试。为了作为HIV感染患者的治疗剂，对于单克隆抗体而言最重要性质之一是具有广谱中和性。已知HIV随着感染时间和抗逆转录病毒治疗(逃逸突变体的出现)而在个体之间持续变化，从而解释了免疫系统控制病毒复制的难点。目前，除了抗R7V抗体外，针对HIV-1亚型B产生的其它4种广谱中和的单克隆抗体均显示此种潜能。现已借助噬菌体展示技术36'37'38由无症状的HIV阳性个体产生了靶向gpl20表面的CD4结合位点的IgGlbl2。2F5和4E10抗体识别gp41的恒定区39'4G，而2G12是针对gpl20上的表位产生的41'42。据报道，这4种抗体为广谱中和抗体，但将其混合在一起时可以获得最有效的作用&44。根据本发明人的结果，已经证明重组抗R7V抗体中和HIV-1亚型C分离株。单克隆抗体2F5和2G12对该亚型无效，IgGlbl2部分有效，而仅4E10显示显著活性45。因此，抗R7V抗体似乎是迄今为止对HIV-1最普遍有效的Mab之一。由于产生抗R7V抗体的患者没有任何自身免疫疾病的临床体征，所以尽管其起源于细胞，但R7V表位并不引起自身免疫应答5。这证明该抗R7V抗体是用于治疗HIV感染患者的有效候选物。表3:用于筛选人淋巴细胞CDNA以鉴定轻链和重链可变区的基因家族特异性PCR<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>标准縮写用于混合位点！^A或G,Y二T或C,W:A或T。参考文献1.OelrichsR，TsykinA,RhodesD,SolomonA,EllettA,McPheeD,etal.:GenomicsequencesofHIVtype1fromfourmembersoftheSydneyBloodBankCohortoflong-termnonprogressors.AIDSResHumRetrovir1998;14:811-814.2.SanchezG,XuX,ChermannJCandHirschI:Accumulationofdefective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