使用抗原性肽和化疗剂的胰腺癌组合疗法的制作方法

专利名称：使用抗原性肽和化疗剂的胰腺癌组合疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用抗原性肽和化疗剂的用于胰腺癌的新组合疗法。
背景技术：
胰腺癌在所有恶性肿瘤中是死亡率最高的之一，患者的5年存活率为4%。每年 约有28000位患者被诊断为胰腺癌，而几乎全部患者都会死于该病(Greenlee，R. Τ.，等 (2001) CA Cancer J Clin，51 15-36)。这种恶性肿瘤的预后不良是因为难于早期诊断以 及对目前治疗方法的响应不佳(Greenlee，R. Τ.，等(2001)CA Cancer J Clin,51 =15-36, Klinkenbijl, J. H.，等(1999) Ann Surg, 230 :776_82 ；discussion 782-4·)。具体而言，目 前还没有鉴定出允许在疾病早期、有治愈可能的阶段进行可信筛选的肿瘤标志物。人们为了阐明致癌机理进行的研究揭示了许多可用于抗肿瘤剂开发的候选靶分 子。例如，在动物模型中已经证明，法尼基转移酶抑制剂(FTI)对Ras依赖性肿瘤的治疗 有效(Sun J等，(1998) Oncogene, 16 1467-73.)。继而开发了这种药剂来抑制与Ras相关 的生长信号途径，其依赖于转录后的法尼基化。在人类临床试验中，将抗肿瘤剂与一种抗 HER2单克隆抗体——曲妥单抗(trastuzumab)组合应用，对抗原癌基因HER2/neu，该临床 试验已经在改善临床响应方面取得了成功，而且改善了乳腺癌患者的总体存活率。酪氨酸 激酶抑制剂STI-571是一种选择性去活bcr-abl融合蛋白的抑制剂。继而开发了这种药 剂用于慢性髓细胞白血病的治疗，该病中bcr-abl酪氨酸激酶的持续活化在白细胞的转变 中起重要作用。这些药剂被设计来抑制特定基因产物的致癌活性(Molina MA，等，(2000) Cancer Res，16 :4744_9)。由此，在癌细胞中，表达提升的基因产物一般是用于开发新抗肿 瘤剂的潜在靶物。或者，核酸合成抑制剂也可用作抗肿瘤剂。例如，吉西他滨(gemcitabine) (GemzarE)是胰腺癌的一线治疗药。吉西他滨和紫杉醇(paclitaxel)的组合疗法已应用于 胰腺癌的治疗。同时，肿瘤血管发生与肿瘤进展有重要关系。先前证明了能够依据基于内皮细胞 的方法开发针对肿瘤血管发生的有效疫苗，其靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)I和2， 因为I类HLA分子在内皮细胞中没有下调(Wada S等，Cancer Res 2005Jun 1,65(11) 4939-46 ；Ishizaki H等，Clin Cancer Res 20060ct 1,12(19) :5841_9)。先前还描述了这 样的肽，其诱导对表达VEGFR的细胞特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)并由此以特异性 且有效的CTL应答抑制肿瘤血管发生(参见W0/2004/024766，通过述及并入本文)。本发明通过提供新的用于胰腺癌的组合疗法解决了本领域对改进的胰腺癌疗法 的需求，所述疗法利用抗原性肽，特别是靶向VEGFR2的癌症疫苗和抗原性肽，以及化疗剂 如吉西他滨。

发明内容
发明概述鉴于癌症治疗领域的状况，本发明的目的是寻求一种增强化疗的治疗效果的手 段。VEGFR2在肿瘤组织内皮细胞中强烈表达并被认为参与了涉及VEGF信号的内皮细胞增 殖。因此，本发明聚焦于可能的靶向VEGFR2(KDR/flk-l ；以下称作KDR)的癌症疫苗疗法。 继而发现了化疗剂如吉西他滨的治疗效果被能诱导针对表达VEGFR2的细胞的细胞毒性T 细胞的VEGFR2(KDR/fIk-I ；以下称作KDR)肽所加强。由此，本发明的一个目的是提供[1],治疗受试者中癌症的方法，包括向所述受试者施用(i)和(ii)的步骤(i) 一种或多种选自下组的肽；(a) —种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI(SEQ IDN0:1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2), GYRIYDVVL(SEQ ID NO 3), SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO :5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO 6)，(b) (a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有 细胞毒性T细胞诱导能力；(c) (b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色 氨酸；(d) (b)或(C)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或 甲硫氨酸；(e) —种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽:AMFFWLLLV(SEQID NO :7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8)、AVIAMFFWL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID N0:10)、 YMISYAGMV (SEQ ID NO 11), IQSDVffSFGV (SEQ ID NO :12)、和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)；(f) (e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有 细胞毒性T细胞诱导能力；(g) (f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h) (f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸，(ii) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。[2], [1]的方法，其中所述受试者是HLA-A24-阳性的或HLA-A02-阳性的。[3], [1]的方法，其中所述癌症是胰腺癌。[4],用于治疗受试者中癌症的试剂盒，含有包括分别作为活性成分的⑴和(ii) 以及可药用载体的药物组合物；⑴一种或多种选自[l]-(i)的(a)-(h)中的肽；和(ii) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。[5], [4]的试剂盒，其中所述受试者是HLA-A24阳性的或HLA-A02阳性的。[6], [4]的试剂盒，其中所述癌症是胰腺癌。[7],用于治疗受试者中癌症的抗癌剂，其包括⑴与(ii)的组合⑴一种或多种选自[l]-(i)的(a)-(h)中的肽；和(ii) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。[8], [7]的抗癌剂，其中所述受试者是HLA-A24阳性的或HLA-A02阳性的。
[9], [7]的抗癌剂，其中所述癌症是胰腺癌。[10]. (i)和(ii)的组合在治疗受试者中的癌症中的用途⑴一种或多种选自[l]-(i)的(a)-(h)中的肽；和(ii) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。[11]. [10]的用途，其中所述受试者是HLA-A24阳性的或HLA-A02阳性的。[12]· [10]的用途，其中所述癌症是胰腺癌。[13]. —种或多种选自由[l]_(i)的(a)-(h)组成的组的肽用于制造药物组合物 的用途，所述药物组合物增强吉西他滨的治疗效果。[14]. [13]的用途，其中要增强的治疗效果是吉西他滨在受试者中治疗癌症的治 疗效果，其中所述受试者是HLA-A24阳性的或HLA-A02阳性的。[15]. [14]的用途，其中所述癌症是胰腺癌。本领域技术人员会理解本发明的一个或多个方面满足某些目的，而一个或多个其 它方面能够满足某些其它目的。每个目的在其各个方面可以不均等地应用于本发明的每 个方面。同样，在关于本发明任一方面的可选方式中可以考虑前述各个目的。在结合随附 的附图和实例阅读以下详述时，本发明的这些和其它的目的和特性会变得更充分地显而易 见。然而，要理解的是前文的发明内容和下文的详述均为优选的实施方案，而不是对所述发 明或发明的其它可选实施方案的限制。附图简述本发明的多个方面和应用在考虑了下列本发明的附图简述和详述及其优选实施 方案时对于本领域技术人员会是显而易见的[

图1]图1显示用于本文实施例中利用的抗原性肽和化疗剂的施用规程。[图2]图2显示对⑶8阳性τ细胞中原初(na_ive)τ细胞、记忆τ细胞和效应τ细
胞的流式细胞术分析，其中通过穿孔蛋白染色来测定功能性淋巴细胞级分。[图3]图3显示在用四种颜色染色后通过流式细胞术测量的调节性T细胞在疫苗 施用之前和之后的数量变化(例如，⑶4阳性T细胞中的⑶25高和Foxp3阳性细胞)。[图4]图4显示对病例3，特别是对接种之后接种部位附近的淋巴结病的PET扫 描结果。[图5]图5显示病例3中肿瘤标志物浓度随时间的变化。[图6]图6显示病例3中接种之前和之后发生的特异性CTL反应的水平。[图7]图7显示对病例4的一系列CT扫描，描绘了治疗对胰腺癌原发性病灶的减 小效果。[图8]图8显示对病例4的一系列CT扫描，描绘了对胰腺癌肝脏转移病灶1的肿 瘤减小效果。[图9]图9显示对病例4的一系列CT扫描，描绘了对胰腺癌肝脏转移病灶2的肿 瘤减小效果。[图10]图10显示病例4中在治疗过程期间产生的肿瘤标志物CEA和CA19-9的变化。[图11]图11显示病例4中接种之前和之后产生的特异性CTL反应。[图12]图12显示对病例6的一系列CT扫描，描绘了对胰腺癌原发性病灶的肿瘤减小效果。[图13]图13显示对病例6的一系列PET扫描，描绘了对胰腺癌原发性病灶的肿 瘤减小效果。[图14]图14显示病例6中接种之前和之后产生的特异性CTL反应。[图15]图15显示对病例7的一系列CT扫描，描绘了胰腺癌原发性病灶中的变 化。[图16]图16显示在病例7中在治疗过程期间产生的肿瘤标志物CA125的变化。[图17]图17显示在接种之前和之后病例7中产生的特异性CTL反应。[图18]图18显示对病例10的一系列CT扫描，描绘了胰腺癌原发性病灶中的变 化。[图19]图19显示在病例10中在治疗过程期间产生的肿瘤标志物CA125的变 化。发明详述尽管与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本 发明的实施方案，现在还是对优选的方法和材料进行描述。然而，要理解的是，本发明不限 于在此描述的特定的分子、组合物、方法或规程，因为这些可以依据常规实验法和优化法而 变化。还要理解的是，说明书中使用的术语仅是出于描述特定的形式或实施方案的目的，而 不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅会通过随附权利要求来限定。除非另外限定，此处使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员 所通常理解的含义相同。然而，在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。因此， 在本发明的上下文中，适用以下定义定义除非另有具体指明，此处使用的词汇“一个”、“一种”和“所述”的意思是“至少一 个/ 一种”。在本发明的上下文中，术语“几个”如用于氨基酸添加、缺失和/或取代是指3-7， 优选3-5，更优选3-4，甚至更优选3个氨基酸残基。如本文所用的，术语“生物体”是指任何由至少一个细胞组成的活的实体。活的生 物体可以简单到例如单个真核细胞，或是复杂到像哺乳动物(包括人类)。如本文所用的，术语“生物样品”是指完整的生物体或其组织、细胞或组成部分的 亚群(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊膜液、羊膜脐带 血、尿液、阴道液和精液)。术语“生物样品”还指从完整生物体或其细胞、组织或组成部分 的亚群制备的勻浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物，或其级分或部分。最后，“生 物样品”指含有细胞成分(如蛋白质或多核苷酸)的培养基，如生物体已在其中增殖的营养 液或凝胶。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语 运用于其中一个或多个氨基酸残基是经修饰的残基或非天然存在的残基(如相应的天然 存在氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，也运用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此可互换使用， 指核酸残基的聚合物，并且除非另有指明，它们与它们通常承认的单字母编码所指的氨基酸类似。与氨基酸类似，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物二者。
术语“化疗剂”用于此处是指在癌症的治疗中有用的化合物。化疗剂的实例 包括但不限于以下的和它们的可药用盐、酸和衍生物烷化剂如如噻替哌(thiotepa) 和环膦酰胺(cyclosphosphamide)；烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡 (improsulfan)禾口 喊泊舒凡(piposulfan)；氣丙 口定类(aziridines)如 benzodopa, 卡波醌(carboquone)，美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙撑亚胺 (ethylenimine)和甲基密胺(methylamelamine)包括六甲蜜胺(altretamine),曲他 胺(triethylenemelamine)，三亚乙基憐酉先胺(trietylenephosphoramide)，三亚乙基硫 代磷酉先胺(triethiylenethiophosphoramide)禾口三轻甲蜜胺(trimethylolomelamine)； 氮芥(nitrogen mustards)如苯丁酸氮芥(chlorambucil)，萘氮芥(chlornaphazine)， 胆磷酰胺(cholophosphamide)，雌莫司汀(estramustine)，异环磷酰胺(ifosfamide)， 氮芥(mechlorethamine),盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride),美 法仑(melphalan)，新氮芥(novembichin)，胆留醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)，松龙 苯芥(prednimustine)，曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosureas) 如卡莫司汀(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine),洛 莫司汀(Iomustine),尼莫司汀(nimustine)，雷莫司汀(ranimustine)；抗生素诸如 阿克拉霉素(aclacinomysins),方文身寸菌素(actinomycin)，氨茴霉素(authramycin), 氮丝氨酸(azaserine)，博来霉素(bleomycin)，放线菌素C (cactinomycin)，加利车 霉素(calicheamicin)，卡柔比星(carabicin)，洋红霉素(carminomycin)，嗜癌霉 素(carzinophilin)，色霉素(chromomycinis)，放线菌素 D(dactinomycin)，柔红霉 素(daunorubicin)，地托比星(detorubicin)，6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星 (doxorubicin),表柔比星(epirubicin),7(衣索比星(esorubicin),伊达比星(idambicin), 麻西罗霉素(marcellomycin)，丝裂霉素(mitomycin)，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin)， 橄榄霉素(olivomycin)，培洛霉素(ρ印lomycin)，泊非霉素(poffiromycin)，嘌呤 霉素(puromycin)，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin)，链黑菌素 (streptonigrin),链脲菌素(streptozocin),杀结核菌素(tubercidin),乌苯美司 (ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药如氨甲蝶呤 (methotrexate)和5_氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸(denopterin)，氨甲蝶呤， 蝶罗呤(pteropterin)，三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物氟达拉滨(fludarabine)， 6_ 巯基嘌呤(6-mercaptopurine)，硫咪嘌呤(thiamiprine)，硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧 啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞苷(azacitidine)，6_氮尿苷(6_azauridine)， 卡莫氟(carmofur)，阿糖胞苷(cytarabine)，双脱氧尿苷(dideoxyuridine)，去氧氟尿 苷(doxifluridine)，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷(floxuridine) ,5-FU ；雄激素 类如卡普睾酮(calusterone)，丙酸甲雄烧酮(dromostanolongpropionate)，环硫雄醇 (印itiostanol)，美雄烧(m印itiostane)，睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类如氨鲁 米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane)，曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂 如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酉先丙酸(aminolevulinic acid)；安口丫唆(amsacrine) ；bestrabucil ； 比生群(bisantrene)；依达曲沙、(edatraxate) ；defofamine ；秋水il]胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)； 依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(Ientinan)；氯尼达明(Ionidamine)； 米it月瓜月宗(mitoguazone)；米托惠酉昆(mitoxantrone)；莫喊达酉享(mopidamol) ； 二月安 硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁 (pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星 (pirarubicin)；鬼白酸(podophyllinic acid) ；2-乙基酉先月井(2-ethylhydrazide)； 丙卡巴胼(procarbazine) ；PSK ;雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺 (spirogermanium)；细交链 包菌丽酸(tenuazonic acid)；三亚月安酉昆(triaziquone)； 2,2 ‘，2 〃 -三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine)；乌拉坦(urethan)；长春地 辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine) ；二溴甘露酉享 (mitobronitol) ；二漠卫矛酉享(mitolactol)；喊泊漠烧(pipobroman) ；gacytosine ；阿 拉伯糖苷(“Ara-C")；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇 (TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)和多烯紫杉醇(doxetaxel) (TAXOTEff, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西 他滨；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤；氨甲喋呤；钼类似物如顺钼(cisplatin) 和卡钼(carboplatin)；长春花碱(vinblastine)；钼；依托泊苷(etoposide) (VP-16)；异 环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素COiiitomycinC)；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)； 长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷 (teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐 (ibandronate) ； CPT-11 ；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄 酸(retinoicacid) ;±矣斯培拉霉素(esperamicin)禾口卡培他滨(capecitabine)；本定 义中还包括调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬 (tamoxifen)，雷洛昔芬(raloxifene)，芳香酶抑制性4 (5)-咪唑，4羟基他莫昔芬，曲沃 昔芬(trioxifene)，盐酸雷洛昔芬(keoxifene)，奥那司酮(onapristone)，和托瑞米芬 (toremifene) (Fareston)；和抗雄激素如氟他胺(flutamide)，尼鲁米特(nilutamide)，比 卡鲁胺(bicalutamide)，亮丙瑞林(Ieuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和它们上述任 一的可药用盐、酸或衍生物。抗原性肽如上所述，本发明涉及增强或改进化疗治疗效果的药剂，更特别是以VEGFR2为靶 标，诱导针对表达VEGFR2的细胞的细胞毒性T细胞，并继而增强或改善化疗剂(如吉西他 滨)的治疗效果的抗原性肽。具有VEGFR2亚序列的抗原性肽可用于本发明的方法、试剂盒或组合物。适合在本 发明的情况下使用的抗原性肽优选具有选自下文所示的那些的氨基酸序列。VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2),GYRIYDVVL(SEQ ID NO 3),SYMISYAGM(SEQ ID NO 4),RFVPDGNRI(SEQ ID NO 1),KffEFPRDRL (SEQ ID N0:5)，或DFLTLEHLI(SEQ ID NO :6)。已知突变的或修饰的肽、具有通过 失、添加和/或替换某个氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基来修饰的氨基酸序列的肽保有原始生物学活性(Mark， D. F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, Μ. J. and Smith, Μ., Nucleic Acids Research(1982)10,6487-6500, Wang, A.等，Science 224,1431-1433, Dalbadie-McFarland, G.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79，6409-6413)。因此，本发 明考虑对以上序列的变化和修饰。具体而言，其中将一个、两个或几个氨基酸用上述氨基酸 序列之一取代的或向上述氨基酸序列之一添加一个、两个或几个氨基酸的抗原性肽在本发 明的语境中也是有用的，只要所得的修饰的肽保有必需的细胞毒性T细胞诱导能力。本文 考虑这样的修饰的肽，其具有CTL诱导能力以及如上所述添加或取代一个、两个或几个氨 基酸的氨基酸序列，只要这些肽与另一蛋白质的氨基酸序列不一致。因此，在一个优选的实施方案中，优选将自N末端起的第二个氨基酸取代成苯丙 氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸，或优选将C末端氨基酸取代成苯丙氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸；或将一个或两个氨基酸添加至N末端和/或C末端。或者，选自具有下文所示的氨基酸序列的九肽或十肽也是作为具有高CTL诱导能 力的肽所优选的。AMFFffLLLV(SEQ ID NO 7),VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8),AVIAMFFffL (SEQ ID NO 9),KLIEIGVQT(SEQ ID NO: 10)，YMISYAGMV(SEQ ID NO: 11)，IQSDVffSFGV(SEQ ID NO : 12)，或VLAMFFffLL(SEQ ID NO: 13)。在本发明的语境下，具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中在如上所述的氨基 酸序列之一的基础上取代或添加一个、两个或几个氨基酸，这样的肽也可使用。如上所述具 有由九个或十个氨基酸组成的氨基酸序列的肽，其中取代或添加一个、两个或几个氨基酸， 这样的肽可具有CTL诱导能力，只要它们与另一蛋白质的氨基酸序列不一致。具体而言，例 如，优选将自N末端起的第二个氨基酸取代成亮氨酸或甲硫氨酸，或优选将C末端氨基酸取 代成缬氨酸或亮氨酸；或将一个或两个氨基酸添加至N末端和/或C末端。这样的修饰的肽的实例是在肽VIAMFFWLL(SEQ ID NO 8)中将自N末端起第二个 氨基酸取代为亮氨酸(VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13))；然而，本发明不限于这个实例。自使用 这些修饰的肽进行的刺激获得的CTL克隆能够识别原来的肽，并且引起损伤。所考虑的氨基酸序列插入的实例包括长度范围从一个到几个残基的氨基和/或 羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括N末端甲 硫氨酰残基或与细胞毒性多肽融合的抗体。用于本发明的肽也可含有修饰，如糖基化、侧链 氧化或磷酸化，只要该修饰不破坏如本文所述的肽的生物学活性。其他修饰包括与肽的N 或C末端融合的增加抗体血清半衰期的酶或多肽的融合物。后者的实例包括D-氨基酸或 其他氨基酸模拟物。在氨基酸插入的情况下，其中将一个或多个氨基酸残基添加至本发明的肽，本发 明还考虑融合蛋白。融合蛋白通常由感兴趣的多肽或蛋白质与已知用途的多肽或蛋白质构 成。融合蛋白可以通过本领域技术人员熟知的技术制备，如通过将编码本发明的肽的DNA与编码另外的肽或蛋白质的DNA连接，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达。对于与本 发明的蛋白质融合的肽或蛋白质没有限制。然而，能够在融合蛋白的情况中使用的已知肽 的实例包括，但不限于，FLAG(Ηορρ,Τ. P.等，Biotechnology (1988) 6，1204-1210)、含有六个 His (组氨酸)残基的6xHis、lOxHis、流感凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、pl8HIV 片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、Ick标签、α -微管蛋白片段、B-标 签、蛋白C片段等。可以与本发明的蛋白质融合的蛋白质的实例包括GST (谷胱甘肽-S-转 移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。 在氨基酸取代的情况下，优选将要取代的氨基酸残基突变成保守氨基酸侧链性质的不同氨 基酸(该过程称作保守氨基酸取代)。氨基酸侧链的性质的实例是疏水氨基酸(Α，I，L，Μ， F，P，W，Y，V)，亲水氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，Τ)，和共同具有以下官能团或特征的 侧链脂族侧链(G，Α，V，L，I，P)；含羟基的侧链(S，Τ，Y)；含硫原子的侧链(C，Μ)；含羧酸 和酰胺的侧链(D，N，E，Q)；含碱的侧链(R，K，H)；和含芳基的侧链(H，F，Y，W)。注意，圆括 号内的字母表示氨基酸的单字母编码。本发明的抗原性肽能够使用熟知的技术制备。例如，所述肽能够使用重组DNA技 术或化学合成来合成制备。对于多个肽，可以个别合成或者合成为更长的由两个或更多个 肽组成的多肽。这些肽优选是分离的，即，基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其 片段。本发明的抗原性肽可以以鸡尾酒(cocktail)提供或者可以使用标准技术彼此缀 合。例如，所述肽可以作为单个多肽序列表达。组合中的肽可以是相同的或不同的。通过 施用本发明的肽，所述肽以很高的密度呈递在抗原呈递细胞的HLA抗原上，该抗原呈递细 胞继而诱导出特异性地针对由被展示的肽与HLA抗原形成的复合物反应的CTL。或者，可以 用本发明的肽来刺激在其细胞表面固定了本发明的肽的抗原呈递细胞，后者通过从受试者 取出树突细胞获得。将这些细胞再次施用给各受试者诱导CTL，结果能够增加针对靶细胞的 攻击性。药物组合物及其使用方法本发明提供用于治疗和/或预防胰腺癌的药物，其用于与化疗剂如吉西他滨联 用。用于本发明的肽在胰腺癌的治疗中特别有用。用本发明的抗原性肽对树突细胞的体内和体外刺激，可以通过下述方式容易地实 施使细胞暴露于高浓度的肽，导致这些肽替换所述细胞上原来固定的肽。因此，抗原性肽 必须至少具有一定水平对HLA抗原的结合亲和力方能用于本发明的语境中。含有这些肽的药物可以直接施用所述肽本身，或者可以作为通过常规配制方法配 制成的药物组合物施用。在这样的情况中，所述药物除了所述肽之外还可以适当地包括平 常用于药物的载体、赋形剂等，对此没有特别限制。可以将所述药物与吉西他滨组合用于胰 腺癌的治疗和预防。包括本发明的抗原性肽作为活性成分的用于治疗和/或预防胰腺癌的药物可以 与有效诱导细胞免疫力的佐剂一起施用；可以与其他活性成分如抗肿瘤剂一起施用；并且 可以以颗粒形式施用。合适的佐剂在文献中有记载(Clin. Microbiol. Rev.，7 :277-289， 1994)。另外，本发明的药物可以作为脂质体制剂施用，可以作为与几微米直径的珠子结合 的颗粒状制剂施用，也可以作为与脂质结合的制剂施用。
例如，施用方法可以口服、皮内或皮下进行，或通过静脉注射等进行。可以进行系 统施用，或局部施用至目标肿瘤附近直接施用到目标肿瘤中。本发明的肽的剂量可以适当 地根据要治疗的疾病、患者的年龄和重量、施用方法等来调整。通常，优选在几天到几个月 中施用0. OOlmg-1, OOOmg,优选0. OOlmg-1, OOOmg,更优选0. Img-IOmg的所述肽一次。更具 体地，为了增强吉西他滨的治疗效果，在优选的实施方案中，可以在几天至几个月中，更优 选在一周(7天)中，与吉西他滨一起施用0.5mg-2. Omg的所述肽一次。本领域技术人员能 够适当地选择合适的剂量。或者，在本发明的情况中，可以施用在其表面上呈递本发明的肽和HLA抗原之间 形成的复合物的胞内小泡用于本发明的目的。这些胞内小泡称作外来体(exosome)。外 来体的制备可以按照例如在公开的国际
公开日文译本特表平11-510507和2000-512161 号(Published Japanese Translation of InternationalPublication Nos.Hei ll-510507and 2000-512161)中具体记载的方法进行。优选可以使用从作为治疗或预防目 标的受试者获得的抗原呈递细胞来制备外来体。就本发明的肽而言，本发明的外来体可以 作为癌症疫苗接种。要使用的HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者的HLA抗原类型匹 配。例如，对于日本人，HLA-A24或HLA-A02，特别是HLA-A2402或HLA-0201通常是合适的。类似地，在本发明的情况中，由所述肽诱导的分离的细胞毒性T细胞也可以用于 本发明的目的。通过用呈递本发明的肽的抗原呈递细胞进行刺激而诱导出的细胞毒性T细 胞，优选源自作为治疗和/或预防的目标的受试者。细胞毒性T细胞可以单独施用，或为了 抗肿瘤效果的目的，与其他药物，包括本发明的肽、外来体等，组合施用。获得的细胞毒性T 细胞特异性地针对呈递本发明的肽的靶细胞起作用，或优选地特异性地针对呈递与用于诱 导的肽相同的肽的靶细胞起作用。所述靶细胞可以是内源表达KDR的细胞或被强迫表达 KDR的细胞。另外，因本发明的肽的刺激而在其细胞表面呈递这些肽的细胞也可以作为靶。在本发明的情况中，呈递HLA抗原和所述肽之间形成的复合物的抗原呈递细胞也 可以用于本发明的目的。通过接触所述肽或编码所述肽的核苷酸获得的抗原呈递细胞优选 源自作为治疗和/或预防目标的受试者。抗原呈递细胞可以单独作为疫苗施用，或与其他 药物如本发明的肽、外来体和细胞毒性T细胞组合作为疫苗施用。在本发明的情况中，所述肽优选与吉西他滨组合施用。吉西他滨是化合物2'-脱 氧-2'，2' -二氟胞苷单盐酸盐(2‘ -deoxy-2'，2' -difIuorocytidinemonohydrochlo ride) (b-异构体)的通用名。一种由吉西他滨的盐酸盐(吉西他滨HCl)构成的药物组合 物以Gemzar (商品名)的名称普遍有市售。在本发明的情况中，可以将吉西他滨、吉西他滨 的可药用盐、或其前药中的至少一种与前述的肽组合施用。因此，除非另有声明，此处所称 吉西他滨包括它的盐或前药。吉西他滨是一种化疗剂，已经在临床中作为治疗剂用于包括胰腺癌在内的几种癌 症。成人施用吉西他滨治疗胰腺癌的标准治疗方案包括每周施用1000mg/m2的吉西他滨最 多七周。吉西他滨通常通过静脉内输注施用。通常，在胰腺癌治疗中，将给药三周然后停止 治疗一周的时间表作为一个周期，再视需要继续和重复所述治疗。在这期间，可以使用血液 学毒性等指标来调节吉西他滨的剂量。在本发明中，按照该吉西他滨给药时间表来施用所 述肽。本发明的抗原性肽可以在吉西他滨给药期间内的任何阶段施用。或者，可以将这些肽在吉西他滨给药之前施用，只要由本发明的抗原性肽所诱导的CTL在体内保持它们的活 性即可。通常合理的做法是将它们按照与用于吉西他滨给药相同的时间表来施用，由此将 患者的时间负担保持在最低。 如此处所发现的，施用具有氨基酸序列如RFVPDGNRI(SEQ ID NO 1)的VEGFR2衍 生肽能够改善吉西他滨的治疗效果。在下文再次描述能够用在本发明的情况下的示例性 VEGFR2衍生肽的氨基酸序列。在本文的情况中，这些氨基酸序列的修饰或突变版本也能够 用在本发明中，只要它们保有期望的CTL诱导能力即可。VYSSEEAEL(SEQIDNO2),
GYRIYDVVL(SEQIDNO3),
SYMISYAGM(SEQIDNO4),
RFVPDGNRI(SEQIDNO:1)，
KffEFPRDRL(SEQIDNO5),
DFLTLEHLI(SEQIDNO6),
AMFFffLLLV(SEQIDNO J),
VIAMFFffLL(SEQIDNO8),
AVIAMFFffL(SEQIDNO9),
KLIEIGVQT(SEQIDNO10),
YMISYAGMV(SEQIDNO11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO: 12)，或VLAMFFWLL (SEQ ID NO: 13)。因此，本发明提供增强吉西他滨的胰腺癌治疗效果的药剂，这些药剂包括上述 VEGFR2衍生肽作为活性成分。或者，本发明提供所述VEGFR2衍生肽在生产增强吉西他滨对 胰腺癌的治疗效果的药物组合物中的用途。此外，本发明提供在使用吉西他滨的胰腺癌治 疗中VEGFR2衍生肽的联用(组合)。根据本发明，VEGFR2衍生肽可以与吉西他滨组合用于胰腺癌治疗。更具体地，本 发明提供用于治疗胰腺癌的试剂盒，所述试剂盒由含有可药用载体、前述VEGFR2衍生肽、 以及吉西他滨中的每一种作为活性成分的药物组合物构成。此外，本发明提供用于治疗胰 腺癌的抗癌剂，其包括前述VEGFR2衍生肽和吉西他滨的组合。或者，本发明提供用于治疗 胰腺癌的试剂盒，其包括前述VEGFR2衍生肽和说明书，所述说明书说明当将所述肽与吉西 他滨组合施用于胰腺癌患者时吉西他滨的治疗效果得到增强。在另一实施方案中，本发明还提供所述VEGFR2衍生肽与一种或多种选自吉西他 滨、其可药用盐、及其前药的化疗剂的组合在制备用于治疗癌症包括胰腺癌的药物组合物 中的用途。或者，在另一实施方案中，本发明提供所述VEGFR2衍生肽在制备用于治疗癌症 包括胰腺癌的药物组合物中的用途，其中所述药物组合物与一种或多种选自吉西他滨、其 可药用盐、及其前药的化疗剂组合使用。在另一实施方案中，本发明进一步提供所述VEGFR2 衍生肽在制备如下药物组合物中的用途，所述药物组合物用于增强一种或多种用于治疗癌 症包括胰腺癌的选自吉西他滨、其可药用盐、及其前药的化疗剂的治疗效果。或者，本发明进一步提供用于制备药物组合物的方法或工艺，所述药物组合物用 于增强一种或多种用于治疗癌症包括胰腺癌的选自下组的化疗剂的治疗效果吉西他滨、其可药用盐、及其前药，其中所述方法或工艺包括将药学上或生理学上可接受的载体与作 为活性成分的VEGFR2衍生肽一起配制的步骤。在另一实施方案中，本发明进一步提供用于 制备药物组合物的方法或工艺，所述药物组合物用于增强一种或多种用于治疗癌症包括胰 腺癌的选自下组的化疗剂的治疗效果吉西他滨、其可药用盐、及其前药，其中所述方法或 工艺包括使VEGFR2衍生肽与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤。在另一实施方案中，本发明还提供用于制备用于治疗癌症包括胰腺癌的试剂盒的 方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将包含VEGFR2衍生肽和药学上或生理上可接受的 载体的药物组合物，与一种或多种选自下组的化疗剂组合或包装在一起的步骤吉西他滨、 其可药用盐、及其前药。或者，在另一实施方案中，本发明还提供VEGFR2衍生肽和一种或 多种选自下组的化疗剂的组合在制备用于治疗癌症包括胰腺癌的试剂盒中的用途吉西他 滨、其可药用盐、及其前药。在本发明的上述实施方案中，要治疗癌症的受试者可以是HLA-A24-阳性或 HLA-A02-阳性的。要治疗的癌症包括胰腺癌。
实施例在下文中，参考实施例详细描述本发明，更具体而言是参考一项临床试验，该试验 是测定靶向新肿瘤血管的表位肽与吉西他滨的组合用于治疗不能切除的晚期复发性胰腺 癌的用途。然而，其中描述的材料、方法等只是示例本发明的多个方面并且决不意在限制本 发明的范围。同样，与其中描述的相似或等同的材料、方法等可以用于本发明的实践和测试 中。介绍此处描述的是用于不可切除的晚期复发性胰腺癌患者的新疫苗化疗方法的 临床试验，其中将血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR)衍生的表位肽与不完全弗氏 佐剂(IFA)混合，然后皮下施用于患者。预期所述肽疫苗将通过抑制肿瘤新血管形成 (neovascularization)显示抗肿瘤效果。在此将他们与吉西他滨(目前胰腺癌化疗的标 准)组合使用。本临床试验意在通过在一组三名患者中对所施用的表位肽进行剂量增加来 验证新疫苗化疗的安全性，所述新疫苗化疗的目的是经由化疗抑制新肿瘤血管并产生抗肿 瘤效果。次要目的是评估应答率、存活时间和免疫应答。外科手术切除是治愈胰腺癌所必需的治疗手段；然而，早期检测是困难的，在确 诊时约60%的患者处于不可能切除的情况[Matsuno S等Int J ClinOncol. 5 :153_157， 2000.，Pantalone D等18 =41-46, 2001.]。目前，吉西他滨被用作针对不可切除的胰腺癌 的标准治疗；然而存活期中值和一年存活率分别为5. 7个月和18%，虽然与仅施用5-FU 的组相比有所改善，但绝非令人满意。另外，应答率不高，为5. 4%-14. 3% [Burris HA等 J.Clin Oncol. 15 :2403_2413，1997.，Casper ES 等 12 :29_34，1994.，Carmichael J 等 Br JCancer. ；73 101-105，1996.，Rothenberg ML 等 Ann Oncol. 7 :347_53，1996.]，需要检验 通过与吉西他滨联用而可以改善应答率和存活期的新治疗方法。另一方面，在近几年中，已经阐明了 T细胞识别抗原的机制，另外也已经发现了由 CTL识别作为肿瘤抗原的蛋白质，并且已经开始了对使用肿瘤抗原或抗原基因的治疗方法 的研究。使用这种鉴定的肿瘤排斥抗原肽的免疫疗法很快被用于恶性黑素瘤，自1998年起，已有人(主要有 Rosenberg 等)报道了成功[Celis E.等 Cancer Biology 6 =329-336, 1995. ,Marchard M，等 Int. J. Cancer 63 :883_885，1995.]。其后，进行了与 IL-2 或 GM-CSF 的联用、用施用多种肿瘤排斥抗原肽的方案的开发、修饰的肽的开发、和对肽冲激树突细 胞的临床试验，并且直至今日，使用肿瘤排斥抗原肽的抗肿瘤免疫疗法作为常规治疗方法 (如外科手术和化疗)的补充治疗方法都在获得人们的关注。发现了被细胞毒性T细胞(CTL)所识别并攻击的肿瘤抗原，其后，接连鉴定了多种 肿瘤特异性抗原，并且对使用表位肽的癌症疫苗疗法的临床试验也在进行中，所述疫苗疗 法是针对这些抗原的特异性免疫疗法。然而，也发现了新的问题。尽管能够诱导强的CTL， 但是肿瘤细胞中MHC分子表达的降低或丧失、肿瘤细胞中靶分子的缺乏等可能导致CTL抗 肿瘤效果的丧失。另外，迄今为止鉴定的肿瘤抗原肽存在于某些肿瘤类型中，而它们未涵盖 所有肿瘤。因此，为了克服这些问题，将疫苗疗法中CTL的靶细胞设定为肿瘤新血管内皮 细胞而非肿瘤细胞本身，并制定了靶向新肿瘤血管衍生分子的疫苗疗法。作为靶分子，人们 的注意力集中在血管内皮生长因子受体2(VEGFR2/KDR)上，它在正常内皮细胞中几乎不表 达，但在肿瘤新血管内皮细胞中高表达，并且是这些细胞生长所不可或缺的血管内皮细胞 生长因子受体。已知VEGFR2在许多实体瘤如乳腺癌、结肠癌、肾癌、恶性黑素瘤和肺癌的肿瘤 组织中表达[Folkman J. Nature Biotechnol. 15,510，1997.，Folkman J. EXS 79，1-8, 1997.]。也已经揭示了 VEGFR2表达与癌细胞增殖有很大关系[Kranz A，等Int J Cancer 84 293-298,1999.，Nakopoulou L, φ Hum Pathol33 863-870, 2002.，Reden L,^ Breast Cancer Res. and Treat. 82 :147-154，2003.]。另一方面，关于VEGFR2是否可以成为免疫疗法的靶标，使用VEGFR2蛋白和DNA疫 苗接种进行了基础研究，结果显示，无论是何种类型的肿瘤中，都通过抑制新肿瘤血管而表 现出了抗肿瘤效果；由此，确认了 VEGFR2特异性细胞毒性T细胞是这种抗肿瘤效果的原因。 以上证明7 VEGFR2可以成为肿瘤免疫疗法的靶[Yiwen，Li.等J. Exp. Med. 195，1575-1584， 2002. Niethammer,A. G.等Nature Med. 8，1369-1375，2002.]。另外，作为我们在人类中的基 础分析的结果，证实了可识别和损坏VEGFR2的CTL克隆的存在，并且鉴定了几类能够诱导 强CTL的HLA-A24或A02限制型表位肽。由这些肽诱导的CTL损坏了培养的以HLA限制型方 式内源表达VEGFR2人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。另外，在使用表达有HLA的A2/Kb转基因小 鼠的体内抗肿瘤效果检查中，确认了通过使用VEGFR2衍生表位肽的癌症疫苗疗法具有强 力抗肿瘤效果，不论何种癌症类型。由于CTL也能够使用本临床试验中使用的肽从癌症患 者外周血诱导出来，所以发现CTL前体细胞也存在于癌症患者中[Wada S，Cancer Res. 65, 4939-4946,2005.]。根据以上内容，通过施用本文的肽并且通过在患者中诱导VEGFR2特异 性CTL，能够抑制肿瘤新血管形成，并且可以获得强力抗肿瘤效果。由此，设计了新疫苗化疗方法，其中将预期通过抑制肿瘤新血管形成而显示抗肿 瘤效果的肽与作为目前针对胰腺癌的标准化疗的吉西他滨组合使用。将源自VEGFR2且 为 HLA-A24 或 HLA-A02 限制型表位肽的 RFVPDGNRI (SEQ ID NO 1)、VYSSEEAEL (SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL (SEQ ID NO 3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO 4)、KffEFPRDRL(SEQ ID NO 5)、DFLTLEHLI (SEQ ID NO 6)、AMFFffLLLV(SEQ ID NO 7)、VIAMFFffLL(SEQ ID NO 8)、 AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO 10)、YMISYAGMV (SEQ ID N0:11)、IQSDVffSFGV(SEQ IDNO :12)、或VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)[Wada S,Cancer Res.65，4939-4946， 2005. , W02004/024766]使用在疫苗配制剂中用于联用。基本原理的概要如下1. VEGFR2是肿瘤新血管内皮细胞生长中涉及的一种重要分子，这种肽能够用于在 体外诱导特异性 CTL [Wada S, Cancer Res. 65，4939-4946，2005.，W02004/024766]。2.使用VEGFR2衍生的HLA-A24或HLA-A02限制型表位肽也能在体外从癌症患者 外周血单核细胞诱导特异性 CTL [Wada S, Cancer Res. 65，4939-4946，2005.]。3.大多数日本人携带 HLA-A24 或 HLA_A02[Date Y,等 Tissue Antigen, 47, 93-101，1996.]。4.这些在生物化学上是稳定的并且适合用于临床试验[Wada S, CancerRes. 65, 4939-4946,2005.]。5.吉西他滨已经被批准用作胰腺癌的化疗剂。6.已知吉西他滨可增强免疫活性如CTL诱导能力[Correale P，等JImmunol. 175， 820-828，2005.，Dauer M，等 J Im-munother. 28，332-342，2005.]，并且能够预期与疫苗制 剂联用的效果。本临床试验是基于上述基本原理进行的。材料和方法受试者 根据以下选择标准和排除标准来选择受试患者。选择标准1.因以下原因判断为不可能根治切除的原发性胰腺癌根据多种诊断(如通过CT 或超声检查的图像诊断)的远处转移如肝脏转移、腹膜转移和骨转移；如由日本胰腺协会 (Japan Pancreas Society) 白勺月夷—ig^liiK (Classification of Pancreatic Carcinoma, 5th Ed)所定义的远处淋巴结转移；或浸润进入大血管(无法重建的腹主动脉、 肝固有动脉、左右肝动脉、肠系膜上动脉和肠系膜上静脉)；或复发性胰腺癌。2.是否存在可由RECIST测量的病灶不是问题，但是必须有可能对肿瘤的临床效 果进行评估。3. ECOG 性能状态为 0-2。4.在取得同意时年龄大于等于20岁且小于等于80岁。5.在开始吉西他滨和疫苗疗法时预期的生存预后必须为三个月或更长。6.如果患者接受过某种手术，该患者应该已经从所述手术的影响中恢复。或者，自 前次治疗起必须已经过去四周或更久。7.主要器官的功能必须得以保持骨髓功能(白细胞计数大于等于2000/mm3或小 于等于15000/mm3，且血小板计数为7. 5/mm3或更高)；肝功能(GOT为150IU/L或更低，GPT 为150IU/L或更低，且T-bil 3. 0g/dL或更低)；和肾功能(Cr为3. 0或更低)。8.存在合适的HLA。9.无针对原发性疾病使用吉西他滨治疗的历史。排除标准1.怀孕的女性(具有怀孕能力的女性在开始本临床研究之后应采用避孕措施)。
2.哺乳的女性(在开始本临床研究之后应停止哺乳)。3.想要怀孕的患者(在试验期间男性和女性都应采取合适的避孕措施)。4.具有难以控制的活性感染的患者。5.在试验期间必须施用以下药剂的患者系统性施用肾上腺类固醇剂；或系统性 施用免疫抑制剂。6.患有未受控的双重癌症(double cancer)的患者。7.具有尚未治愈的外伤性损伤的患者。8.怀疑患有肠麻痹或间质性肺炎的患者。9.由医师或主治医师确定为不合适的患者。治疗计划警试癌症患者的诜择受试患者是携带合适的HLA并患有已判断为不可能根治性切除的原发性胰腺癌 或患有复发性胰腺癌的那些患者。在受试患者中还包括通过图像诊断胰腺癌的疑似度最高 的病例。检验HLA表汰的方法外部检验请求SRL，Inc (Tokyo)进行。吉西他滨的剂量施用l，000mg/m2的吉西他滨(吉西他滨HCl)(其是批准为保险所覆盖范围的护 理剂量和给药方式)三周，接着一周不进行施用。用于施用所述i禾Π佐齐I丨的齐!W"禾Π方法将0. 5mg、Img和2mg的合成肽分别与0. 5mL、ImL和2mL的不完全弗氏佐剂 (M0NTANIDE*ISA51VG，SEPPIC, France)混合，并皮下施用于患者腋下或腹股沟区域附近。施用安排所述安排示于图1。一个疗程从首次施用开始设定为28天。剂量增加方法和三名患者的组确定吉西他滨的剂量和给药方式(l，000mg/m2，施用三周和不施用一周)，并且疫 苗施用的给药剂量按照肽剂量0. 5mg、lmg和2mg增加。具体地，向三名患者施用0. 5mg肽。 如果没有一个人显示不可否认的相关的4级(NCI-CTC 3.0版本)以上的血液学毒性(除 了恶心/呕吐之外)或3级(NCI-CTC 3.0版本)以上的血液学毒性，那么向所述三名患者 施用下一剂量的肽(Img)。如果二人以上表现出副作用，那么中断此临床试验。如果一人表 现出副作用，那么在同一剂量下再纳入三名额外的患者，并且如果在此六例病例之一中表 现出副作用，那么试验前进到下一剂量。在此阶段中即使是在一人中观察到副作用，那么也 停止本临床试验。从Img到2mg的剂量增加以相同方式进行。质量控制关于施用的肽，cGMP级肽(Neo-MPS，San Diego)是来自东京大学医学研究所人 类基因组中心(Human Genome Center, Institute of Medical Science, University of Tokyo)的馈赠。关于佐剂，符合GMP级的不完全弗氏佐剂(M0NTANIDE*ISA51VG)购自SEPPIC Co.，France。肽的储藏和肽疫苗的制备在和歌山医科大学医院的药物部(Pharmaceutical Department of WakayamaMedical University Hospital)进行。
关于“预测试施用”:出于避免意料之外的不良事件(如过敏性休克)的目的，在第一次疫苗施用之前， 向实际施用部位之外的部位皮下施用IOmg肽作为预测试施用，并且进行30分钟的监测。 如果未能观察到3级或更高的局部反应或系统性不良事件，那么进行实际施用。“预测试施 用”未在任何病例中观察到局部不良事件和系统性不良事件。MM试验数据评估安全件评估安全性评估针对施用了至少一次吉西他滨和所述肽的患者。不良事件的存在和程 度通过参考国家癌症研究所常用毒性标准(National CancerInstitute-Common Toxicity Criteria) (NCI-CTC)(日文译本JCOG版本)版本3来测定。免疫学评估在疫苗施用之前，在完成每个疗程之后(初次施用之后28天)收集50mL外周血， 并通过Ficoll-paque密度离心分离和测量外周血单核细胞(PBMC)。CTL反应分析使用IFN-γ ELISP0T 测定法(ELISPOT Human IFN-gamma set, BD)测量因施用的 肽产生的CTL反应。更具体而言，通过将VEGFR2-169(SEQ ID NO 1)和HIV-A24肽冲激到 A24-LCL(HLA-A*2402-阳性)中来制备刺激细胞(stimulator)，并使用HIV肽作为阴性对 照。对于每个R/S比例和刺激细胞同时进行三孔测定，并计算每一个孔的斑点数的平均值。 在 ELISPOT 读数器(IMMUN0 SPOT, Cellular Technology Ltd.)上读取斑点数。用得自 VEGFR2-169冲激的斑点数减去得自HIV冲激的斑点数，获得的值作为针对VEGFR2-169的特 异性IFN-γ产生斑点(特异性斑点)。如果在一个疗程之后和两个疗程之后观察到了特异 性IFN-Y产生斑点的增加，那么认为已经存在因疫苗施用而产生的免疫应答。CD8阳性T细胞的群体分析(图2)通过流式细胞术(FACS Calibur, BD)用四种颜色染色来分析在⑶8阳性T细胞 中原初(Iiaive)T细胞、记忆T细胞、效应记忆T细胞和效应T细胞这些级分各自的比例是 否有变化。如图2中所示，对PBMC的淋巴细胞级分设门，并对CD8阳性级分设门。针对 ⑶8阳性级分使用⑶27 (BD)和⑶45RA(SD)进一步显影以获得效应细胞级分(⑶27-阴性/ ⑶45RA-阳性)、效应记忆细胞级分(⑶27-阴性/⑶45RA-阴性)、记忆细胞级分(⑶27-阳 性/⑶45RA-阴性)、和原初细胞级分(⑶27-阳性/⑶45RA-阳性)。同时，利用穿孔蛋白染 色测定功能性淋巴细胞级分(Cytofix/Cytoperm试剂盒，BD)。调节性T细胞的分析(图3):将CD4 阳性体细胞中的 CD25 高及 Foxp3 阳性(CD25high andFoxp3_positive)细 胞作为调节性T细胞，并测量它们在疫苗施用前后的数量变化，方法是用四种颜色染色之 后再进行流式细胞术(FACS Calibur, BD)。更具体地，如图3中，对PBMC的淋巴细胞级分 设门，使用⑶4和⑶25显影，然后计算⑶4阳性T细胞中⑶25高及Foxp3阳性细胞的比例 (HumanRe gu 1 at or y Staining 试剂盒，eBioscience)。临床功效评估细胞减少效果(cytoredutive effects)
选择完成了至少一个本方案中定义的疗程的患者作为受试者。对于能够通过影 像测定的肿瘤，在每个疗程的最后一次接种之后评估临床效果，主要根据《New Guidelines to Evaluate the Effect of Treatment in Solid Tumors (评估实体瘤治疗效果的新指 南)(RECIST指南版本2)日文译本，JCOG版本》来进行。即使对于进行临床评估时尚未完 成四周时间的病例，也记录他们的客观应答并且评估他们的临床显著性作为参照数据。将 CT和PET用于抗肿瘤效果评估。存活时间进行长期随访观察，并且调查存活时间和存活率。患者结果在每个水平有三人参与，安全性评估变得可行。将7月31日的病例总结在表1中 (见下文)。病例1 (水平 I/O. 5mg)病例1是一位68周岁的女性，她曾经用使用TS-I的化疗，变为无应答性，此后纳 入本试验中。进行了两个疗程，而没有系统性不良事件，并且在接种部位也没有局部不良事 件(表1，见下文)。影像评定结果为PD。肿瘤标志物也有增加。根据免疫学监测，未观察 到针对施用的肽的特异性CTL反应(表2，见下文)。在接种之前，它在调节性T细胞的正常 范围内(正常平均值为3. 9+/-1. 2%),而在一个疗程之后观察到了超出正常范围的增加， 并且在两个疗程之后也观察到了(表6，见下文)。患者在初次接种3. 3个月后因原始疾病 加重而死亡。病例2 (水平 I/O. 5mS)病例2是一位66周岁的男性，他接受了两次接种，但应其自身要求转院至另一家 医院，然后放弃了该试验(图1，见下文)。不存在系统性不良事件，并且在接种部位也不存 在局部不良事件。病例3 (水平 I/O. 5mg)病例3是一位64周岁的男性。进行了一个疗程。作为系统性不良事件，观察到了 3级嗜中性粒细胞减少和肝功能异常(表1，见下文)。吉西他滨停药一周后，病人从上述 两种状况中恢复，然后再继续施用。作为局部不良事件，在接种部位观察到了 2级硬化和发 红，并且在接种部位附近观察到了淋巴结病(腹股沟肿胀)。使用PET在肿胀部位观察到了 显示强烈积累的影像(图4)，活检结果观察到组织病理学上强烈的炎症，提示响应于肽接 种的免疫应答。影像评定为SD且肿瘤标志物(CA19-9)降低(图5)。根据免疫学监测，观 察到了针对施用的肽的特异性CTL反应(图6)，并且在CD8阳性T细胞级分分析中，观察到 了原初T细胞级分和效应T细胞级分的增加(表3，见下文)。调节性T细胞在接种开始之 前在正常范围以上(正常平均值为3. 9+/-1.2%)，但在一个疗程之后降低至正常范围(表 6，见下文)。其后，在初次接种7. 3个月之后该患者因原始疾病加重而死亡。病例4 (水平 I/O. 5mS)病例4是一位61周岁的男性。进行了两个疗程。不存在系统性不良事件，而作为 局部不良事件，在接种部位观察到了 2级硬化和发红(表1，见下文)。影像评定为“客观应 答”。更具体地，发现胰尾区中的原发性病灶在一个疗程之后为SD，而在两个疗程之后其明 显减小，并且该效果保持了几乎两个月(图7)。在肝门区中的肝转移灶在两个疗程后变得彻底不明显(图8)。胆囊附近的肝转移灶在一个疗程之后变得不明显，并且在两个疗程之 后几乎消失(图9)。另一方面，在接种之前处于高水平的肿瘤标志物(CA19-9和CEA)在一 个疗程之后和两个疗程之后降低，并且甚至在一个月后该肿瘤标志物的降低趋势仍在继续 (图10)。根据免疫学监测，观察到了针对施用的肽的特异性CTL反应(图11)。在接种开 始前、一个疗程后和两个疗程后调节性T细胞在正常范围内(表6，见下文)。距离第一次 接种6. 3个月时，该受试者存活。病例5 (水平 11/Img)病例5是一位65周岁的男性。进行了两个疗程。不存在系统性不良事件和局部 不良事件(表1，见下文)。图像评定为PD。肿瘤标志物也有增加。根据免疫学监测，观察 到了针对施用的肽的特异性CTL反应(表2，见下文)，并且在CD8阳性T细胞级分分析中， 观察到了原初T细胞级分和效应T细胞级分的增加(表4，见下文)。在接种开始前、一个 疗程后和两个疗程后调节性T细胞在正常范围内(表6，见下文)。其后，在初次接种之后 4. 5个月该患者因原始疾病加重而死亡。病例6 (水平 11/Img)病例6是一位57周岁的女性。进行了两个疗程。作为系统性不良事件观察到了 3 级嗜中性粒细胞减少(表1，见下文)。停药GEM—周使其恢复，然后再继续施用。作为局 部不良事件，在接种部位观察到了 2级硬化和发红，并且在接种部位附近观察到了淋巴结 病(腹股沟肿胀)。图像评定为“客观应答”。更具体地，在两个疗程之后在胰头区中的原 发性病灶减小，并且这种效果保持了几乎2. 5个月(图12)。比较了接种之前和完成两个疗 程之后的PET扫描。在两个疗程后肿瘤的积累明显降低(图13)。通过比较客观表明肿瘤 积累量的SUV值，从6到4. 5的降低明显提示了存在抗肿瘤效果。另外，自两个疗程之后肿 瘤标志物(除DUPAN2之外的肿瘤标志物自纳入时起是正常的)降低，并且该降低效果甚至 在两个月后仍在继续(表7，见下文)。根据免疫学监测，观察到了针对施用的肽的特异性 CTL反应(图14)，并且在CD8阳性T细胞级分分析中，观察到了原初T细胞级分的增加，并 且观察到了效应T细胞级分的减少(表4，见下文)。在接种开始前、一个疗程后、和两个疗 程后调节性T细胞在正常范围内(表6，见下文)。在第一次接种之后六个月，QOL保持良 好并且受试者存活。病例7 (水平 IIZlmgl病例7是一位69周岁的男性。进行了两个疗程。作为系统性不良事件观察到了 3 级嗜中性粒细胞减少(表1，见下文)。停药GEM—周使其恢复，然后再继续施用。作为局 部不良事件，在接种部位观察到了 2级硬化和发红，并且在接种部位附近观察到了淋巴结 病(腹股沟肿胀)。影像评定结果为SD(图15)。更具体地，在两个疗程后胰头区中的原发 性病灶大小没有显示任何变化，并且这种效果保持了几乎两个月(图15)。另外，在一个疗 程后肿瘤标志物(除CA125之外的肿瘤标志物自纳入时起是正常的)降低，并且该降低效 果甚至在两个月之后仍在继续(图16)。根据免疫学监测，观察到了针对施用的肽的特异性 CTL反应(图17)，并且在CD8阳性T细胞级分分析中，观察到了原初T细胞级分的减少，并 且观察到了效应T细胞级分的增加(表4，见下文)。在接种开始前、一个疗程后和两个疗 程后调节性T细胞在正常范围之内(表6，见下文)。第一次接种之后4. 3个月，QOL保持 良好且受试者存活。
病例8 (水平 III/2mg)病例8是一位58周岁的男性。完成了一个疗程，在进行第二个疗程时，因肿瘤扩 大产生了胃肠出血。经判断确定为肿瘤的扩大所致，并停止了试验(表1，见下文)。作为 系统性不良事件，观察到了肝功能异常。不存在局部不良事件。在完成一个疗程时的影像 评定结果为PD。肿瘤标志物也增加了。病例9 (水平 III/2mg)病例9是一位73周岁的男性。在一次施用之后，由于肿瘤扩大引起的胃肠缢缩而 推迟了研究(表1，见下文)。病例10(水平 III/2mg)病例9是一位62周岁的男性。进行了一个疗程。不存在系统性不良事件，作为局 部不良事件，观察到了 2级或更低的发红和硬化(表1，见下文)。影像评定结果为SD (图 18)。另外，肿瘤标志物(除CA125之外的肿瘤标志物自纳入时是正常的)降低，并且肿瘤 标志物的降低持续了大约一个月(图19)。根据免疫学监测，观察到了针对施用的肽的特异 性CTL反应(表2，见下文)，并且在CD8阳性T细胞级分分析中，观察到了原初T细胞级分 的增加，并观察到了效应T细胞级分的减少(表5，见下文)。在接种开始前调节性T细胞 在6. 4的高值，但在一个疗程之后降低至2. 1的正常范围(表6，见下文)。与单独的吉西他滨比较在表8(见下文)中，从病例中抗肿瘤效果的观点和DTH反应(其为免疫应答之 一)的观点，将目前为止获得的数据与单独的吉西他滨进行比较。对抗肿瘤数据在疾病控 制率(CR数+I^R数+SD数/全部病例)和明显抗肿瘤效果表现率(客观应答)方面进行比 较。尽管单独的GEM的所述比率为45% -48%，但是用这种方案该比率大大超过62. 5%。 客观应答也超过了 2倍或更多。观察到了高度频繁的DTH反应(其为免疫应答之一)。由 于在单独的VEGFR2的场合该反应几乎观察不到(个人交流)，认为吉西他滨增强了免疫应 答。事实上，在发生DTH反应的病例中，在临床上获得了 SD或更高的反应，而PD病例和不 存在DTH的病例完全匹配。因此，将其中引起了某种免疫应答的病例也认为是在临床上有 效的。[表1]对临床试验病例的概括
23 [表2]针对施用的肽的特异性CTL反应/DTH反应 ※附未测[表3]对水平I⑶8阳性T细胞级分的分析
※病例3 1个疗程后终止NT 来测[表4]对水平11⑶8阳性T细胞级分的分析 [表5]对水平IIICD8阳性T细胞级分的分析 病例810:1个疗程后终止NT 未测
[表6]分析⑶4阳性/⑶25高/Foxp3阳性调节性T细胞 健康个体的平均值(SD)…CD4+CD25皇Foxd3+:3· 9% (士 1.2)[表7]在病例6中随着治疗进程的肿瘤标志物变化 (CEA, CA19-9, CA125 ；正常范围)[表8]对与本发明的治疗有关的抗肿瘤效果和DTH反应的概括 讨论
毫无疑问胰腺癌是顽固的，并且是一种预后最差的肿瘤。目前，针对胰腺癌仅有的 药物治疗是吉西他滨，但是它在临床上仍不能令人满意。另一方面，在鉴定了针对肿瘤抗原的表位肽之后，对于癌症疫苗疗法已存在着很 大的期待；然而，公知的事实是迄今为止的临床表现还不能满足这样的期待。主要原因是肿 瘤细胞中MHC分子的低表达或缺乏。更具体而言，即使用疫苗诱导了强CTL，如果缺乏MHC 分子，也不能展现抗肿瘤效果。鉴于即使在疫苗引起的CTL反应能够通过免疫学监测检测时，它们也不与抗肿瘤 效果有直接关联，所以针对MHC分子低表达和缺乏的测量是非常重要的目标。另外，肿瘤 的异质性也是一个严重的问题。即使在能够针对一种肿瘤抗原诱导CTL时，在表达的分子 不是肿瘤生长的关键分子的情况下，该分子的缺失使其不再是CTL的靶而肿瘤得以继续生 长。出于解决与这些疫苗疗法抗肿瘤效果相关的关键问题的目的，发明人将注意力集中 于在肿瘤新血管内皮细胞中高表达的VEGFR2和能够用作疫苗的表位肽上[WadaS，Cancer Res. 65，4939-4946，2005.，WO 2004/024766]。通常，人们根据疫苗疗法和化疗的生物学特征，认为它们的联用是相冲突的。然 而，从肿瘤免疫力的立场上看，如调节性T细胞的发现和它们的消除(cancellation)，提示 出与化疗联用的可能性。因此，计划用临床试验来检查由吉西他滨和针对新肿瘤血管的肽 疫苗疗法的联用产生的效果是否有望用于胰腺癌。结果，首先发现了在安全性方面是完全可以接受的。关于剂量增加，对3级或更高 级系统性不良事件(在完成一个疗程时)的分析显示，在水平I于三个病例中的一个病例 中，在水平11的三个病例的两个病例中，并在水平111的两个病例的一个病例中，表现出嗜 中性粒细胞减少和肝功能异常；然而，停用药物或施用G-CSF使得施用能够继续进行。根据 上述，目前，全部水平均在可接受的范围内。因为这是一种针对肿瘤新血管内皮细胞的疫苗 疗法，所以关注出血倾向和其它不良事件；然而，在实施该方法之前的理论基础，诸如在正 常血管内皮细胞中几乎不表达，在某种程度上已经证实是正确的。当对通过免疫学监测和 临床效果分析的剂量增加进行DTH反应、CTL反应和疾病控制率方面的分析时，在水平I的 三个病例的两个病例中，且在水平111的两个病例的一个病例中，均为阳性的。在水平11， 在全部三个病例中只有CTL反应是阳性的(DTH反应和疾病控制率与水平I和III相同)。 尽管病例数较少，以上还是提示了水平II会是推荐剂量的可能性。关于抗肿瘤效果，尽管用疫苗化疗明显观察到联用效果，但还是讨论了疫苗增强 吉西他滨抗肿瘤效果的可能性。如在表8的比较中，与单独的吉西他滨比较明显肿瘤减小 效果超过了两倍或更多。这意味着吉西他滨的直接抗肿瘤效果被该疫苗所增强。更具体而 言，可以想到的是由疫苗诱导的CTL破坏了肿瘤新血管内皮细胞，使得吉西他滨能够有效 地达到肿瘤，并因而展现强力抗肿瘤效果。然后，讨论吉西他滨增强所述疫苗的抗肿瘤效果 的可能性。分析针对施用的肽的免疫应答，确认了强的CTL反应主要在临床有效病例(包 括SD病例)中被诱导。另外，由于DTH反应的增强，这有力地提示了吉西他滨增强CTL反 应(其是疫苗抗肿瘤效果的核心要素)的可能性。在临床上也是，对于五个病例中的四个， 抗肿瘤效果包括SD持续了很长的一段时间(病例4 一个月；病例6 两个月；病例7 两个 月；和病例10 —个月)，并且这被认为是所述疫苗长效抗肿瘤效果的结果。更具体地，这提 示了如下的可能性，即吉西他滨高效地诱导出CTL，这种CTL导致长效抗肿瘤效果。另外，有这样的可能性，即吉西他滨导致肿瘤经历细胞死亡，并且这与所述疫苗激活的抗肿瘤免疫 反应协同性地发挥作用。这样一来，通过组合使用吉西他滨和VEGFR2肽的疫苗化疗，非常 有望实现抗肿瘤效果的增强(包括寿命的延长)而没有副作用的增加。这对于改善预后不 良的胰腺癌的治疗效果而言，可以认为是个好消息。工业实用件本文发现针对胰腺癌的化疗剂(例如，吉西他滨)的治疗效果在与合适的抗原性 肽组合时能够显著改善或增强，所述抗原性肽例如在W02004/024766中鉴定为癌症疫苗的 KDR肽，将WO 2004/024766的内容通过述及整体并入本文。同样，本发明提供用于有所需要 的受试者中治疗胰腺癌的改进方法。将本文引用的全部出版物、数据库、序列、专利和专利申请通过述及并入本文。尽管已经参考本发明的具体实施方案详细地描述了本发明，但是对于本领域技术 人员显而易见的是在不背离本发明的宗旨和范围的前提下可以对其进行多种变化和修改， 这些变化和修改的范围和限度由所附权利要求来规定。
权利要求
一种治疗受试者中的癌症的方法，包括向所述受试者施用(i)和(ii)；(i)一种或多种选自下组的肽(a)一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI(SEQ IDNO1)、VYSSEEAEL(SEQ ID NO2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO4)、KWEFPRDRL(SEQ ID NO5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸；(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫氨酸；(e)一种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV(SEQ IDNO7)、VIAMFFWLL(SEQ ID NO8)、AVIAMFFWL(SEQ ID NO9)、KLIEIGVQT(SEQ ID NO10)、YMISYAGMV(SEQ ID NO11)、IQSDVWSFGV(SEQ ID NO12)和VLAMFFWLL(SEQ ID NO13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h)(f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；(ii)一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。
2.权利要求1的方法，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
3.权利要求1的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
4.用于治疗受试者中的癌症的试剂盒，包含药物组合物，该药物组合物包含分别作为 活性成分的(i)和(ii)以及可药用载体；(i)一种或多种选自下组的肽；(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO :3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO :5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO :6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起的第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸；(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQ IDNO 7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8), AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h)(f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；(ii) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。
5.权利要求4的试剂盒，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
6.权利要求4的试剂盒，其中所述癌症是胰腺癌。
7.用于治疗受试者中癌症的抗癌剂，包含(i)与(ii)的组合；(i)一种或多种选自下组的肽(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO :3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO :5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO 6),(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸；(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQ IDNO 7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8), AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO: 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h)(f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；(ii)一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。
8.权利要求7的抗癌剂，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
9.权利要求7的抗癌剂，其中所述癌症是胰腺癌。
10.(i)和(ii)的组合在治疗受试者中的癌症中的用途；(i)一种或多种选自下组的肽；(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO :3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO :5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO :6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸;(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQ IDNO 7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8) , AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO: 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h) (f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸；( ) 一种或多种选自下组的化疗剂吉西他滨、其可药用盐、及其前药。
11.权利要求10的用途，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
12.权利要求10的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
13.增强吉西他滨治疗癌症的治疗效果的方法，包括向受试者施用选自下组的一种或 多种肽的步骤；(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO 3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO 5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO 6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸；(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQID NO :7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8), AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO: 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h)(f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
14.权利要求13的方法，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
15.权利要求13的方法，其中所述癌症是胰腺癌。
16.一种或多种选自下组的肽在制备用于增强吉西他滨在受试者中治疗癌症的治疗效 果的药物组合物方面的用途(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO :3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO :5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO :6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸;(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQID NO :7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8) , AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO: 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和4(h) (f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
17.权利要求16的用途，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
18.权利要求16的用途，其中所述癌症是胰腺癌。
19.一种增强吉西他滨的治疗效果的药剂，其包含一种或多种选自下组的肽作为活性 成分(a)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽RFVPDGNRI (SEQ IDNO 1)、 VYSSEEAEL(SEQ ID NO 2)、GYRIYDVVL(SEQ ID NO 3)、SYMISYAGM(SEQ ID NO :4)、 KffEFPRDRL(SEQ ID NO 5)、DFLTLEHLI(SEQ ID NO 6)，(b)(a)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(c)(b)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、或色氨酸；(d)(b)或(c)的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、或甲硫 氨酸；(e)—种或多种具有选自下组的氨基酸序列的肽AMFFWLLLV (SEQ IDNO 7)、 VIAMFFffLL (SEQ ID NO 8), AVIAMFFffL (SEQ ID NO :9)、KLIEIGVQT (SEQ ID NO: 10)、 YMISYAGMV(SEQ ID NO 11),IQSDVffSFGV(SEQ ID NO: 12)和 VLAMFFWLL(SEQ ID NO 13)；(f)(e)的肽，其中取代、缺失或添加1个、2个或几个氨基酸，并且其中所述肽具有细胞 毒性T细胞诱导能力；(g)(f)的肽，其中自N末端起第二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸；和(h)(f)或(g)的肽，其中C末端氨基酸是缬氨酸或亮氨酸。
20.权利要求19的药剂，其中要增强的治疗效果是吉西他滨在受试者中治疗癌症的治 疗效果，其中所述受试者是HLA-A24-阳性或HLA-A02-阳性的。
21.权利要求20的药剂，其中所述癌症是胰腺癌。
全文摘要
本文描述了适合于治疗胰腺癌等的组合疗法。还描述了加强化疗剂如吉西他滨的治疗效果的方法。
文档编号A61P35/00GK101883577SQ200880113389
公开日2010年11月10日 申请日期2008年8月19日 优先权日2007年8月24日
发明者山上裕机 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司