专利名称：一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种新的HER2/neU基因改造的树 突细胞疫苗的制备。本发明可应用于HER2/neU阳性肿瘤的预防和治疗。
背景技术：
HER2/neu是一种癌基因，属于表皮生长因子受体家族。HER2/neu基因的过表达频 繁发生于乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和胃肠道肿瘤，其在乳腺癌的过表达是预后不 良的相关因素。针对HER2/neU的单抗药物Here印tin能有效降低HER2阳性乳腺癌的复发 风险。最新的研究表明HER2/neU的过表达能促进肿瘤干细胞的增殖并增强其侵袭性。以 上事实说明HER2/neu是治疗HER2/neu阳性肿瘤的一个理想标靶。树突细胞(DC)是迄今发现的功能最强大的抗原递呈细胞，能刺激机体免疫系统 产生针对特异抗原的免疫反应，这些反应包括抗体对特异抗原的中和作用，T细胞对携带特 异抗原细胞的直接和间接的杀伤作用等。因此，将HER2/neU基因导入树突细胞后对人体进 行免疫可以抑制HER2蛋白的信号转导活性，杀伤过表达HER2抗原的肿瘤细胞，达到预防和 治疗HER2阳性肿瘤的目的。目前，已经有几种基因导入方法被用于制备HER2/neU基因改造的树突细胞(简写 为DChek2)，主要包括重组腺病毒，重组逆转录病毒和mRNA电穿孔。Sakai等用携带neu基因 片段的重组腺病毒感染小鼠骨髓来源的树突细胞，然后对小鼠进行免疫注射，发现这种腺 病毒改造的DChek2疫苗能显著阻止或延迟转基因小鼠乳腺肿瘤的发生，另外两个研究发现 腺病毒改造的DChek2疫苗能部分或全部阻止小鼠neu阳性移植肿瘤的发生。Nabekura等用 携带HER2基因片段的逆转录病毒感染小鼠骨髓来源的树突细胞制备DChek2疫苗，发现后者 能部分阻止小鼠HER2阳性移植肿瘤的发生，此外还能部分延迟转基因小鼠乳腺肿瘤的发 生。此外国内有研究者采用mRNA电穿孔的方法制备DChek2疫苗，体外实验表明这种疫苗能 激发T细胞对neu阳性肿瘤细胞的杀伤。上述提到的三种基因导入方法虽然都能制备有效的DChek2疫苗，但各自都有一些 不足腺病毒感染DC后转基因的表达时间较短，后者可能导致免疫效应的持久性和强度不 够；逆转录病毒只能感染分裂期的细胞，而临床上多采用病人外周血单个核细胞分化诱导 成DC，这一过程很少伴有细胞增殖，因此部分限制了其可能的临床应用；mRNA电穿孔同样存 在递呈抗原的半衰期较短的问题，此外，有研究表明mRNA电穿孔会削弱DC刺激免疫的功能。实际上，重组慢病毒也能高效感染树突细胞，同时不会削弱DC的功能。另外，重组 慢病毒感染的一个重要特点是转基因的长期表达，这一特点对于DC则有可能刺激免疫系 统产生持久和增强的免疫反应，但另一方面也有可能导致免疫耐受，也就是说用它制备的 疫苗可能没有效果。目前并没有使用重组慢病毒制备DChek2疫苗的报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的HER2/neU基因改造的树突细胞疫苗。
本发明提供的疫苗是是通过将HER2/neU重组到慢病毒载体上，再转染树突细胞 来制备的。在任意一个商业化或私人开发的慢病毒转运载体上构建一个HER2/neU基因片段 的表达序列。这里的慢病毒转运载体指慢病毒包装系统中提供目的基因的载体，通常是一 个质粒，此外它还提供病毒所携带核酸的转录表达所需的顺式作用元件。HER2/neU基因片 段的表达序列包括5’端的启动子，可选用广谱的强启动子如巨细胞病毒(CMV)启动子和延 长因子2(EF2)启动子等或者树突细胞特异的启动子如CDllc启动子等，3’端的多聚腺苷 酸加尾信号，以及位于启动子和加尾信号之间的HER2/neU基因片段(通常去除其具有酪氨 酸激酶活性的胞内段)。构建中可能遇到的具体情况包括如果转运载体没有其它的目的 基因，直接在适当位置插入HER2/neU基因片段。如果转运载体已具备了目的基因，则需用 HER2/neu基因片段替换原有的目的基因。如果载体没有提供启动子，则需要在适当的位置 插入目的启动子。如果这一转运载体已具备目的启动子，则只需在启动子下游插入HER2/ neu基因片段，转运载体通常会提供加尾信号。所要用到的分子生物学技术可参考已出版的 相关书籍，如《分子克隆》。1.利用上述构建的载体包装制备携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒，说明如 下采用任意一个商业化或私人开发的慢病毒包装系统包装制备携带HER2/neU基因片段 的重组慢病毒。完整的慢病毒包装系统通常包含数个质粒和一个包装细胞系，前者 用于提供慢病毒包装所需的病毒结构基因和病毒所携带核酸的转录表达所需的顺式作用 元件，后者提供病毒包装所需的反式作用因子。包装制备过程可遵循生产商的说明书以及 发表的文献或相关书籍。包装所得的携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒可进一步纯化 和/或浓缩，相关操作可参考试剂盒生产商的说明书以及相关文献或书籍。2.利用2中提到的重组慢病毒感染树突细胞来制备新的DChek2疫苗，说明如下树突细胞来源可包括小鼠骨髓细胞，人类外周血单个核细胞或CD14阳性细胞群， 造血干细胞及其亚群，人类胚胎干细胞。通常经过数天的培养，在细胞因子的作用下这些具 有分化潜能的细胞将大部分分化为树突细胞。从不同的前体细胞诱导培养树突细胞所花费 的时间不太一样，除人类胚胎干细胞外通常需6-10天，也有3天的快速诱导方法。在树突 细胞的诱导培养过程中，将制备好的携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒在适当时机对 培养体系中的细胞进行感染，感染方式可包括多种，简单的共培养感染，或者将病毒和细胞 一起离心的共离心感染，或者重复甚至多次感染，或者这些方法的组合。在培养后期可向培 养体系中加入刺激树突细胞成熟的因子如肿瘤坏死因子α，磷酸脂多糖等以刺激树突细胞 成熟，原因是未成熟的树突细胞有可能会导致免疫耐受。最终可得到这种新的DChek2疫苗。 相关操作可参考已发表的关于树突细胞培养诱导以及慢病毒感染树突细胞的文献，本说明 书中的具体实施方式
将提供从小鼠骨髓细胞中制备这种新的DChek2疫苗的操作方法。根据本发明的研究，上述用携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒对来源于骨髓 细胞诱导培养的第4天所获得的DC进行感染。按照常规的方法，一般应在第2天进行感染。 本发明人发现，在第4天感染获得了更好的出乎意料的效果。有益效果在基于小鼠的体内实验中发现，这种新的DChek2疫苗只需一次低剂量(1.5X105)
4的免疫接种就可以完全预防HER2/neU阳性移植肿瘤在小鼠体内的生长，保护时间至少超 过100天。而采用其他方法制备得到的DChek2疫苗通常需要大剂量(5 X IO5-I X IO6)，并且经 过2-3次免疫接种才能达到甚至还达不到类似效果(表1)。说明这种慢病毒制备的DChek2 疫苗比用其他方法制备的DChek2疫苗更有效。另一个支持上述结论的依据是，用这种新DChek2 疫苗低剂量单次免疫后，即可在小鼠体内检测到足够水平的抗HER2/neU抗体，而在此前的 两个采用腺病毒和逆转录病毒制备DChek2疫苗的研究中，单次较高剂量的免疫只能在小鼠 体内诱导产生少量或者根本无法产生抗体，而体内相关抗体的产生是评价疫苗效果的一个 重要指标。这种新的DChek2疫苗的预防效应被进一步证明是长效的免疫后100天小鼠血浆 中的HER2/neU抗体仍然维持在较高的水平(平均7倍于未接种DChek2疫苗的小鼠)，对这 些免疫后100天的小鼠进行第二次HER2/neU阳性肿瘤细胞接种，50天后发现小鼠仍未发生 肿瘤。除预防效应外，这种新的DChek2疫苗对小鼠已发生的HER2/neU阳性移植肿瘤还具有 治疗效果，一次低剂量(2X105)的皮下注射即能显著抑制肿瘤的生长。在这个发明中，包含了一系列本领域技术人员已知的操作。但本发明的创造性在 于成功地运用已知的慢病毒载体将HER2/neU基因转染到树突细胞上，实现了稳定高效表 达，并能是动物体产生相应的免疫反应。表1慢病毒制备的DChek2疫苗与其他方法制备的DChek2疫苗预防效果比较
研究团队 改造方法 DCheri剂量
免疫 肿瘤细 次数 胞剂量
小鼠种系 预防效果*
Chen 等， 2002 年 Sakai 等， 2004 年 Chan 等’ 2006 年 Nabekura
腺病毒
腺病毒
腺病毒
等，2008年
我们 慢病毒
Ixio6
IxlO0
Ixio0
逆转录病毒 5X105
1.5x10'
3x10s
BALB/c 60 天，25%
3 5x10s,两次 BALB/c 121 天，100%
3χ IO5 BALB/c, FVB/N 60 天，100%
5x10'
,6
C57BL/6 12 天，50%
2χ105，两次 C57BL/6 150 天，100% ·显示为观察持续时间(肿瘤细胞接种计为第0天)和最后一次观察时健康无瘤 小鼠的百分比。
图1为实施例中pSin-EF2-neuET-Pur阳性克隆的PCR筛选；其中预期阳性克隆应 扩增出大小为2100bp的片段，可见4个菌落都扩增出了这一条带，说明可能均为阳性克隆。 neg为阴性对照，一个无关质粒，pos为阳性对照pMMTV-neu ；
图2为pSin-EF2-neu-Pur的酶切鉴定图；其中预期单酶切片段为8500bp，双酶切 片段为6400bp，2100bp。酶切结果与预测一致。E+S表示EcoR I和Spe I双酶切；图3为预防实验中各组小鼠的无瘤生存曲线图；其中小鼠经过DPBS或DC免疫 (1. 5X IO5/只，5只/组)后7天，用Bieneu细胞(2X IO5/只)进行皮下接种，持续观察各 组小鼠的肿瘤发生情况。可见DCnw免疫组的所有小鼠在肿瘤细胞接种后第100天仍未发 生肿瘤，而DPBS组和DCetel组分别在第24和31天全部发生了肿瘤；图4为治疗实验中各组小鼠的肿瘤生长曲线图；首先用2X 105B16neU对每只小 鼠进行肿瘤接种，然后在7天或15天后用DPBS或DC进行治疗。DC剂量为2X IO5/只， 之后每周对小鼠肿瘤进行两次观察和测量，小鼠肿瘤体积使用椭圆体积公式进行计算 aXb2X0. 5236，其中a和b分别代表肿瘤的长短径，0. 5236为计算椭圆体积的一个常数。 左图和右图分别为小鼠在肿瘤接种后第7天和第15天接受治疗的肿瘤生长曲线。图中数 据显示为均数士标准误的均值，箭头下数字表示免疫治疗的时间。第7天治疗实验每组5 只小鼠，其中DPBS治疗组有一只荷瘤小鼠在第17天不明原因死亡，DCneu治疗组有一只无瘤 小鼠在第25天不明原因死亡，这两只小鼠从死亡时间开始均不参与统计，在观察期最后一 天(肿瘤接种后25天)的各组小鼠肿瘤平均体积分别为2627mm3 (DPBS)，2359mm3 (DCetel)， 374mm3 (DCneu) ’第15天治疗实验中，DBPS, DCctrl和DCneu三组小鼠数目分别为4只，4只和6 只。治疗观察期间没有小鼠死亡，在观察期最后一天(肿瘤接种后21天)各组小鼠肿瘤平 均体积分别为1052mm3，2306mm3and 472. 6mm3。对两次实验观察期结束时各组小鼠肿瘤平均 体积进行统计学分析发现，相比DCctrl (P = 0. 023)和DPBS (P = 0. 03)，DCneu能显著抑制小 鼠肿瘤生长，而DPBS组和DCetel组的小鼠肿瘤平均体积没有显著性差异(P = 0. 587)。
具体实施例方式实施例1携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒载体的构建1. Neu基因片段的PCR扩增和纯化弓丨物序列上游 5，-ggaattccagcctggtccagcctgag-3，；下游 5，-gactagttcactgtct ccttcgtttgatt-3’。反应模板为携带neu全长cDNA的质粒pMMTV-neu，系本单位按现有技术 中的方法构建。扩增反应使用NEB公司的Phusion超保真PCR试剂盒。反应体系如下(体
积单位均为μ 1)
权利要求
一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗，其特征在于是通过将HER2/neu重组到慢病毒载体上，再转染树突细胞来制备的。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于用携带HER2/neU基因片段的重组慢病毒对 树突细胞进行感染。
3.权利要求1或2所说的疫苗在制备治疗或预防HER2/neU阳性肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗的制备方案。它包括1.构建携带HER2/neu基因片段的慢病毒载体；2.利用上述载体制备携带HER2/neu基因片段的重组慢病毒；3.用上述重组慢病毒感染树突状细胞并最终获得疫苗。动物实验证明这种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗能有效预防和治疗HER2/neu阳性肿瘤。
文档编号A61K39/00GK101966335SQ20091004397
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者卢光琇, 卢光莹, 李工博, 陈濂生 申请人:湖南惠霖生命科技有限公司