抗血管新生融合蛋白的制作方法

专利名称：抗血管新生融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体说地涉及抑制血管新生的重组DNA序列、该 DNA序列表达的融合蛋白及其在病理性血管新生疾病治疗药物中的应用。
背景技术：
在正常情况下，成人体内的血管绝大多数处于静止状态，血管新生只见于少数病 理或生理状态。生理状态仅发生于创伤修复，组织再生和妇女的生理周期。病理情况发生 于肿瘤，类风湿性关节炎，糖尿病性视网膜病和干癣，年龄相关的黄斑变性(AMD)。肿瘤血管 新生是肿瘤生长和转移的“命脉”。(Hanahanand Folkman，Cell，1996，86 :353_364)。近年 来，抗血管新生治疗成为肿瘤等疾病治疗的热点和最有前途的领域。血管生成由多个血管生成促进因子和抑制因子组成的复杂系统调节，成人的血 管生成严格受此促进和抑制平衡调节。VEGF对血管内皮细胞基膜的水解、迁移和血管 构建的调节作用强，特异性高，是目前发现的主要特异促血管生成因子。(Folkman J, et al.Sciencel987 ；235 442 ；Giampietro G, etal. Cancer Metastassis Rev 1994 ；Ferrara. Endocrine Reviews2004, 25 (4) :581_611)因此，针对VEGF信号通路的抗血管新生治疗成 为抗肿瘤和类风湿性关节炎等疾病的重要治疗靶点。VEGF受体有 3种，flt-l(fms-like tyrosine kinase, VEGFR-1) ,Flk-l/KDR(fetal liver kinase 1-murine homologue/Kinase insert Domain containingReceptor-human homologue, VEGFR-2)和 flt_4 (VEGFR-3)。VEGFR-1，2，主要分布于血管内皮细胞表面， VEGFR-3主要分布于淋巴内皮。他们由含7个免疫球蛋白样结构的细胞外区、膜区及酪氨酸 激酶区组成。该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，由受体磷酸化而引起细胞 内许多酶和其他反应。其中Flk-l(KDR)在内皮细胞的增殖和血管生成起决定作用。通过抗VEGF抗体和可溶性VEGF受体片断可以阻断VEGF与血管内皮细胞上VEGF 受体(flt-1，KDR等)之间的相互作用，从而阻止由VEGF介导的信息传导，抑制由VEGF 高表达而引起的病理性新生血管的生长。这类VEGF抑制剂包括Avastir^bevacizumab)， Lucentis, VEGF-Trap等，用于治疗血管新生相关的疾病。2004年美国FDA批准的针对 血管新生的抗癌药物Avastin就是特异性结合VEGF的单克隆抗体，其机理就是通过结 合VEGF达到阻断VEGF与其受体结合的目的(Ferrara et al，Nature Reviews Drug Discovery. 2004,3 =391-400)。但是 Avastin 有两个主要缺点1.亲和力较低 2. 3 * 10、 抗体用量大。2.没有PLGF结合能力。因此，理想化的VEGF阻断剂是VEGF受体的细胞外片段，其具有天然的针对VEGF 的高特异性禾口亲禾口力(Kuo et al, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, 2001,98 4605-4610),比 Avastin 的亲禾口力高 20—100 倍(Ferrara N et al, Nature medicine. 2003,9 669-676) 0近年来的研究表明，抗PLGF可以抑制肿瘤的血管新生和转 移，可以显著增强抗VEGF的抗血管新生治疗效果，并且可以抑制一些抗VEGF治疗无效的肿 瘤生长(Fischer C. et al, cell,131 :463_475)。因此利用flt-1与PLGF也具有高亲和力(Christinger, HW. Et al，J. Biol. Chem. 2004，279 (11) 10382-8)的特点，用含有 flt_l 受 体片段的融合蛋白可以结合VEGF和PLGF具有更加优良的抗血管新生治疗效果。美国专利6100071，5952199等描述了几种用Fit 1部分片段和KDR的部分片段融 合的蛋白，但由于其不稳定，副作用大，没有进一步开发。虽然Fltl胞外区第2-3免疫球蛋 白结构域具有大部分的Fltl对VEGF和PLGF的结合活性，但是它的第三免疫球蛋白样结构 域的成串碱性氨基酸导致在体内的有效活性很低。因此本发明采用Fltl和KDR的其它部分 免疫球蛋白样结构域与Fit 1第2免疫球蛋白结构域组合以保持融合蛋白的对VEGF和PLGF 的结合活性。此外，一些正在进行临床试验的药物_如Regeneron公司VEGF trap-与VEGF 分子结合比例是1 1。本发明不仅保留了人VEGF受体Fltl (VEGFR I)和KDR(VEGFR II) 与VEGF的结合性能，及Fltl与PLGF的结合活性，而且由于两个与VEGF结合的免疫球蛋白 结构域距离较远，提供了双价结合能力。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抑制血管新生的融合蛋白，该融合蛋白包括(a) 编码VEGF受体成分的氨基酸序列，该序列连接于(b)编码一种多聚成分的氨基酸序列上， 形成(a)-(b)结构。其中，所述VEGF受体成分是这种融合多肽的唯一的VEGF受体成分；所 述多聚成分通常为免疫球蛋白Fc片段。本发明的另一目的在于提供所述的融合蛋白的用途及组合物。在本发明的第一方面，提供一种融合蛋白，即VEGF结合物SR1-3，它们包括(a)编 码VEGF受体成分的氨基酸序列，该序列连接于(b)编码一种多聚成分的氨基酸序列上，形 成(a)-(b)结构。其中，所述VEGF受体成分是这种融合多肽的唯一的VEGF受体成分，与多 聚成分Fc多肽链结合，然后两个Fc作为二聚体来提高体内的作用半衰期和生物活性。在一优选例中，所述融合蛋白SR1具有SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的融合蛋白SR2具有SEQ ID NO 7所述的氨基酸序列。在另一优选例中，所述的融合蛋白SR3具有SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列。在本发明的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码SEQ IDN0 :6_8所 述的融合蛋白SR1-3。在一优选例中，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列的融合蛋 白 SR1。在另一优选例中，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列的融合 蛋白SR2。在另一优选例中，所述核酸分子编码具有SEQ ID NO :8所述的氨基酸序列的融合 蛋白SR3。在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。在一优选例中，所述的载体是pcDNA3. 1表达载体。在本发明的第四方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞含有所述的载体；或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。在本发明的第五方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞，表达和分离出所述的融合蛋白。在本发明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备治疗或预防血管新 生或者VEGF相关疾病的组合物。在一优选例中，所述的组合物用于治疗或预防血管新生或者VEGF相关疾病。在另一优选例中，所述的VEGF相关疾病包括各种实体肿瘤，AMD，关节炎，等等。在本发明的第七方面，提供一种特异性结合VEGF的组合物，所述的组合物含有(i)有效量的所述的融合蛋白；(ii)其它VEGF拮抗剂；(iii)药学上可接受的载体。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。


图1. Fit 1胞外区氨基酸序列图2 :KDR胞外区氨基酸序列图3 融合蛋白SR1-3结构示意图
具体实施例方式本发明人经过研究，意外地发现将VEGF受体的部分氨基酸序列与多聚成分如人 免疫球蛋白的Fc片段相融合，获得的融合蛋白具有极其优异的结合VEGF的效果，且稳定性 好、半衰期长，可多价结合VEGF分子。如本文所用，除非另外说明，Fltl，flt-1，VEGFR-1可互换使用，都指第一种VEGF 受体。如本文所用，除非另外说明，Flk-1，KDR或VEGFR-2可互换使用，都指第二种VEGF 受体。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多 肽或分子无联系，是重组宿主细胞培养的纯化产物或作为一种纯化的提取物。本发明的目的在于提供三种用于抑制血管新生的VEGF结合物SR1-3。它们包括 (a)编码VEGF受体成分的氨基酸序列，该序列连接于(b)编码一种多聚成分的氨基酸序列 上，形成(a)-(b)结构。其中，所述VEGF受体成分是这种融合多肽的唯一的VEGF受体成分， 该受体成分和Fc链结合，利用两个Fc单链形成二聚体来提高体内的作用半衰期。SR1-3中的VEGF受体成分(a)分别具有以下三种结构SR1 由Fit 1的胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域，和KDR的胞外结构域的第 2和第3免疫球蛋白样区域，融合而成FltlD2-KDRD2-KDRD3 ；SR2 由Fit 1的胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域，和KDR的胞外结构域的第 4免疫球蛋白样区域融合而成FltlD2-KDRD4 ；
SR3:由Fit 1的胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域，和Fit 1胞外结构域的第4免疫球蛋白样区域融合而成FltlD2-FltlD4 ；其中FltlD2代表Fltl胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域氨基酸序列，FltlD4 代表Fltl胞外结构域的第4免疫球蛋白样区域氨基酸序列，KDRD2代表KDR胞外结构域的 第2免疫球蛋白样区域氨基酸序列，KDRD3代表KDR胞外结构域的第3免疫球蛋白样区域 氨基酸序列，KDRD4代表KDR胞外结构域的第4免疫球蛋白样区域氨基酸序列。Fltl和KDR的各免疫球蛋白样区域的氨基酸序列可以从公用数据库获得，由于 Fltl和KDR中各个免疫球蛋白样区域的氨基酸序列之间并没绝然的分界，因此各免疫球蛋 白样区域的氨基酸序列的长度可以有一定的变化。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的氨 基酸序列也可以有一定的变化。它们都属于本发明保护的范围。(b)编码多聚成分的氨基酸序列，通常为但不限于人免疫球蛋白Fc序列，它们都 属于本发明保护的范围。其中的免疫球蛋白Fc片段选自人免疫球蛋白Fc如IgG，IgM，IgA 或亚型IgGl，IgG2，IgG3，IgG4。其中的免疫球蛋白Fc片段是Fc全长或是部分Fc序列，选 自CH2片断，CH3片断，绞链区域片段。研究表明，fltl的N端第2个免疫球蛋白样区域fltlD2和KDR的N端第3个免 疫球蛋白样区域KDRD3分别是fltl和KDR与VEGF结合的区。fltl的N端第3个免疫球 蛋白样区域fltlD3，和KDR的N端第2个免疫球蛋白样区域KDRD2分别对维持fltl和KDR 与VEGF结合的亲和力具有非常重要的作用。在一个实施例中，本发明提供了一种结构利用由Fltl的胞外结构域的第2免疫球 蛋白样区域，和KDR的胞外结构域的第2和第3免疫球蛋白样区域融合，从而保证了融合蛋 白具有Fltl与VEGF和PLGF的结合亲和力，并具有足够的空间距离进行双价结合。在另一个实施例中，本发明提供了一种结构利用由Fltl的胞外结构域的第4免疫 球蛋白样区域，融合于Fltl的胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域从而保证了融合蛋白具 有Fltl与VEGF和PLGF的的结合亲和力。在另一个实施例中，本发明提供了一种结构利用KDR的胞外结构域的第4免疫球 蛋白样区域，融合于Fltl的胞外结构域的第2免疫球蛋白样区域从而保证了融合蛋白具有 Fltl与VEGF和PLGF的的结合亲和力。融合蛋白质的构建技术基于分子克隆方法，具体实验方法可参考《分子克隆》第二 版和第三版等实验手册。编码上述融合蛋白的DNA的获得可以通过常规技术，如通过全基 因合成或分别从Fltl，KDR的片断拼接形成。所用载体可以是分子生物学所常用的质粒载 体。各融合蛋白的氨基末端前加上蛋白分泌信号序列以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载 体序列中包括用于驱动基因表达的启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸 ((PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包 括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的筛选。在完成上列各种融合蛋白的质粒构建以后，即可用质粒DNA转染细胞，表达相应 的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括(但不限于)哺乳动 物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞，等等。从哺乳动物细胞所表达的蛋白质具有糖基修饰。由于 本发明的融合蛋白质的氨基酸序列中包括可糖基化的氨基酸，因此，哺乳动物细胞是表达 这些蛋白质的最佳细胞。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，例如293细胞，CHO细胞，SP20细胞，NSO细胞，COS细胞，BHK细胞，PerC6细胞，等等。许多其他细胞也可用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包括在本发明所能使用的细胞之列。编码多肽的质粒可经转染进入细胞。转染方法包括(但不限于)电穿孔，脂质体 (liposome)介导等等。融合蛋白质表达后，可用酶联免疫吸附试验(ELISA)或其他方法测 定细胞培养液中融合蛋白质的浓度。由于这些融合蛋白质具有免疫球蛋白Fc片断，因此可 用蛋白A亲和层析法提取所表达的融合蛋白质。由于本发明的各种融合蛋白质的基本作用是阻断VEGF信号通路，因此这些融合 蛋白质可能应用于与血管新生或者VEGF相关的疾病。这些疾病可能包括(但不限于)各 种实体肿瘤，AMD，关节炎，等等。融合蛋白可以作为提取的重组蛋白质注射到病人体内。也 可以将融合蛋白DNA序列插入到适当的载体中，用基因治疗或细胞治疗的方法在病人体内 表达。所以，本发明所涉及的融合蛋白质的使用方法有多种形式，不仅包括蛋白质本身，也 包括编码融合蛋白氨基酸序列的对应DNA序列。本发明还包括含有本发明融合蛋白的药物组合物，组合物中可以含有药物可接受 的载体。组合物可以以任何形式的药物制剂形式存在，优选的是注射剂，最优选的是冷冻干 燥注射剂。该药物制剂形式药物组合物，可以按照制剂学常规技术制备，包括将药物活性成 分，本发明的融合蛋白与药物载体混合，按照制剂学常规技术制成所需要的剂型。本发明的融合蛋白，特别优选的融合蛋白是SR1，与现有技术相比，优点明显，具有 多价，副作用小的特点。实施例1 融合蛋白质及其质粒的构建。构建本发明的SR1-3融合蛋白的氨基酸序列来自Fltl (NP_002010)和 KDR(NP_002244) cDNA编码区相应的胞外区免疫球蛋白域氨基酸序列，融合于人免疫球蛋白 IgGlFc (P01857,104-330)氨基酸序列，信号肽来自Fltl的信号肽序列(NP_002010 :1_26)。SR1-3的结构见图3。SR1，2，3氨基酸序列分别见序列6，7，8。DNA序列分别通过基因合成和拼接的方式获得，在两端分别加上Xbal/Hindlll酶 切位点，克隆入pcDNA3. 1。实施例2 融合蛋白质在细胞中的表达和纯化。本发明的组成部分之一是在在完成各质粒的构建以后，提取获得高纯度质粒DNA， 在瞬时转染细胞中表达所构建的融合蛋白质。在蛋白质被纯化后，递药给特定的动物模型 来证实生物学活性。然后将质粒转染至稳定的CHO细胞用于生产。瞬时转染表达首先用生长良好的CHOs细胞，在转染的前一天以8女IOVcm2的密度用含10%胎 牛血清的DMEM培养基接种至6孔板或需要的平皿，第二天先将培养液换为optimem，然后以 0. 4ugDNA/cm2的量将质粒DNA与lipofectamine2000的复合物加入细胞培养液中。继续培 养三天，然后收集上清液。用ELISA法定量测定上清液中表达的融合蛋白，用protein A柱 纯化表达的少量融合蛋白。稳定转染表达转染同上。但是，在转染第二天，将细胞用胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM培养 基以5女104/ml的密度分至96孔板，每孔lOOul，第三天加入G418。5天后换一次液，大约 14天后，挑取新酶素抗性单克隆，进行细胞的扩大培养。最后，细胞在发酵罐中培养生产融合多肽。实施例3 融合蛋白质体外活性测定
融合蛋白与VEGF和PLGF的结合能力分析本发明利用高特异性和高灵敏度的VEGF和PLGF ELISA定量检测试剂盒来确定各 融合蛋白与VEGF和PLGF的亲和力。实验中，将不同浓度((^IjlOOOpM)的融合蛋白和40pM 的人VEGF或PLGF在室温下相混合，37度2小时，或4度过夜后用VEGF或PLGF ELISA定量 检测试剂盒检测游离的VEGF或PLGF浓度。计算各融合蛋白的结合亲和力。BIAcore分析SRl对VFGF 165的分子结合比例SRl融合蛋白被首先用胺偶联化学方法固定在BIAcore芯片(BIAC0RE)上的抗Fc 专一性杭体所固定。用空白抗体表面作负对照，以10微升/分钟的速度用1个小时将VEGF 165以InM，IOnM和50nM注射在融合蛋白的表面。记录实时结合信号，并在每一次注射结束 时达到饱和结合。计算SRl融合蛋白对VEGF 165的分子结合比例。在溶液中，将浓度为InM的SRl融合蛋白与各种浓度的VEGF 165混合。在培养1小 时之后，以与胺结合的VEGF 165表面结合信号形式测定溶液中游离的融合蛋白的浓度.利 用校正曲线将BIAcore结合信号转换成它的摩尔浓度。计算SRl融合蛋白对VEGF 165的 分子结合比例。内皮细胞生长分析选用生长良好的人脐带静脉内皮细胞悬液(Cambrex Bio Scienceffalkersville, Inc.)，调整细胞浓度为2. 5 X IO4个/ml，接种于96孔培养板(100 μ 1/孔)，生长培养液为 EGM基本培养基(Cambrex)，37°C 5% CO2培养至贴壁状态，用含0. 2%明胶的PBS系列稀释 纯化的VEGF抑制剂待测样品，加入抑制剂浓度为l-5000ng/ml，2-3小时后每孔加VEGF165 至终浓度3ng/ml，2-3天后，每孔加入10微升CCK-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育2小 时。以加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照，在 450nm测定吸光度，以650nm作为参考波长双波长测定。实施例4 融合多肽抑制小鼠肿瘤的生长。将培养的人A673成横纹肌细胞瘤细胞(ATCC;CRL 1598)悬浮于生理盐水中。在 6-10周龄的雌性BLAB/c裸鼠背部区域皮下注射100微升体积、IX IO6个肿瘤细胞。在肿 瘤细胞接种开始后24小时，用融合蛋白或同剂量的提纯人免疫球蛋白Fc注射动物。注射 剂量为每小鼠每次400微克，每周两次。每组由10只小鼠构成。每周测定肿瘤大小。在肿 瘤细胞接种4周后，动物被安乐死亡，然后取出肿瘤并称量分析。序列表<110>欣润(上海)生物药业有限公司<120>抗血管新生融合蛋白<160>8
<210>1<211>103<212>PRT<213>人工序列<400>l(FltlD2)
1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IID<210>2<211>204<212>PRT<213>人工序列<400>2(KDRD2-KDRD3)1 PFIASVSDQH GVVYITENKN KTVVIPCLGS ISNLNVSLCA RYPEKRFVPD51 GNRISffDSKK GFTIPSYMIS YAGMVFCEAK INDESYQSIM YIVVVVGYRI101 YDVVLSPSHG IELSVGEKLV LNCTARTELN VGIDFNWEYP SSKHQHKKLV151 NRDLKTQSGS EMKKFLSTLT IDGVTRSDQG LYTCAASSGL MTKKNSTFVR201 VHEK<210>3<211>93<212>PRT<213>人工序列<400>3 (KDRD4)1 FVAFGSGMES LVEATVGERV RIPAKYLGYP PPEIKffYKNG IPLESNHTIK51 AGHVLTIMEV SERDTGNYTV ILTNPISKEK QSHVVSLVVY VPP<210>4<211>96<212>PRT<213>人工序列<400>4(FItlD4)1 FITVKHRKQQ VLETVAGKRS YRLSMKVKAF PSPEVVffLKD GLPATEKSAR51 YLTRGYSLII KDVTEEDAGN YTILLSIKQS NVFKNLTATL IVNVKP<210>5<211>227<212>PRT<213>人工序列<400>5 (IgGlFc)1 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED51 PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDffLNGKEYK101 CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK151 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRffQQG201 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
<210>6<211>534
<212>PRT<213>人工序列<400>6 (SRl)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IIDPFIASVS DQHGVVYITE NKNKTVVIPC LGSISNLNVS LCARYPEKRF151 VPDGNRISffD SKKGFTIPSY MISYAGMVFC EAKINDESYQ SIMYIVVVVG201 YRIYDWLSP SHGIELSVGE KLVLNCTART ELNVGIDFNW EYPSSKHQHK251 KLVNRDLKTQ SGSEMKKFLS TLTIDGVTRS DQGLYTCAAS SGLMTKKNST301 FVRVHEKDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV351 VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDff401 LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SRDELTKNQV451 SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD501 KSRffQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK<210>7<211>423<212>PRT<213>人工序列<400>7(SR2)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT101 IIDFVAFGSG MESLVEATVG ERVRIPAKYL GYPPPEIKffY KNGIPLESNH151 TIKAGHVLTI MEVSERDTGN YTVILTNPIS KEKQSHVVSL VVYVPPDKTH201 TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK251 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDffL NGKEYKCKVS301 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP351 SDIAVEffESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRffQQGNVFS401 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK<210>8<211>426<212>PRT<213>人工序列<400>8 (SR3)1 SDTGRPFVEM YSEIPEIIHM TEGRELVIPC RVTSPNITVT LKKFPLDTLI51 PDGKRIIffDS RKGFIISNAT YKEIGLLTCE ATVNGHLYKT NYLTHRQTNT
101 IIDFITVKHR KQQVLETVAG KRSYRLSMKV KAFPSPEVVff LKDGLPATEK151 SARYLTRGYS LIIKDVTEED AGNYTILLSI KQSNVFKNLT ATLIVNVKPD201 KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP251 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DffLNGKEYKC
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权利要求
一种抗血管新生融合蛋白，其特征在于，包括(a)编码VEGF受体成分的氨基酸序列，该序列连接于(b)编码一种多聚成分的氨基酸序列上，形成(a)-(b)结构。其中，所述VEGF受体成分是这种融合多肽中唯一的VEGF受体成分；所述多聚成分通常为免疫球蛋白Fc片段。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)编码VEGF受体成分的多肽具有SEQ ID NO :6所述的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)编码VEGF受体成分的多肽具有SEQ ID NO :7所述的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(a)编码VEGF受体成分的多肽具有SEQ ID NO :8所述的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于(b)编码一种多聚成分的氨基酸序列可 为来源于人 IgG，IgM, IgA 或亚型 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4 的 Fc 段。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其特征在于(b)编码一种多聚成分的氨基酸优选为 来源于人IgGl的Fc段。
7.—种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求1-6任一所述的融合蛋白。
8.—种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括在适合 表达所述融合蛋白的条件下，培养权利要求10所述的宿主细胞，表达和分离出所述的融合 蛋白。
9.权利要求1-6任一所述的融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备治疗或预防血管 新生或者VEGF相关疾病的组合物。
10.一种用于制备治疗或预防血管新生或者VEGF相关疾病的组合物，其特征在于，所 述的组合物含有⑴有效量的权利要求1-6所述的融合蛋白；和/或 ( )其它VEGF拮抗剂；和/或 (iii)药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及了一种抗血管新生融合蛋白及其用途。本发明利用分子生物学、细胞生物学和免疫学技术，构建了几种人VEGFR受体片断与IgFc片断的融合蛋白，可用于治疗或预防血管新生或者VEGF相关疾病。该融合蛋白具有优良的VEGF及PLGF结合能力，且稳定性好、半衰期长，并可多价结合VEGF分子。
文档编号A61K38/17GK101838329SQ20091005695
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者周新华, 孙九如, 赵建阳 申请人:嘉和生物药业有限公司