专利名称：一种uspio-pla-rgd复合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医疗检测试剂技术领域，涉及一种USPIO-PLA-RGD 复合物及其制备方法和应用，尤其是其作为在磁共振成像中能特异性 使肺瘤新生血管显像的对比剂的应用。
二、 背景4支术
肿瘤的生长、浸润、转移、预后与纟敖血管生成密切相关。传统的 定量评价肿瘤血管生成的"金标准，，——肿瘤MVD(Mean Vascular Density)计数由于其有创性、对准确取材的依赖性且无法对肿瘤血管 生成活性进行功能评价等缺点，并不是一种理想的检查手段。因此， 寻找一种无创、准确、在活体上可重复实施、能获取肿瘤微血管生成 过程直接定量信息的成像方法， 一直是现代肺瘤影像学研究的重要课 题之一。分子影像学的出现为肿瘤血管生成的深入研究引入了新的思 维方式和研究手段。目前有关肺瘤血管生成的分子影像学研究主要集 中于核医学、光学成像、超声成像、磁共振成像等领域。由于核医学 的辐射性和较低分辨率、光子成像的低穿透性以及超声成像的低分辨 率，其应用受到限制。MRI具有空间分辨力高和多序列、多参数、 多方位成像的优点，在分子成像中具有广阔的发展前景。用于MRI 耙向标记的磁性纳米微粒对比剂主要包括顺磁性Gd3+类对比剂和超 顺磁性氧化铁微粒(Superparamagnetic Iron Oxide, SPIO)对比剂。有关 肿瘤血管生成的MR分子成像研究，主要集中于Gd"类对比剂。由于 其在体内清除速度快、分布无特异性、常规场强下MR成像所需Gd"浓度高；同时新近研究表明，肾功能不良者应用Gd"类对比剂后，出 现肾源性系统纤维化(NSF)的风险大大增加，因此实际的临床应用需 要进一步深入研究。SPIO根据颗粒大小分为普通的SPIO(—般直 径>50nm)和超微型超顺磁性氧化铁纳米微粒USPIO (Ultrasmall Suprparamagnetic Iron Oxide,,最大不超过50nm)。 USPI0^4圣更小、 穿透力更强，弛豫率约为同样条件下Gd"的7 IO倍，血循环半衰期 长，且具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，参与 体内生理代谢过程。因此，USPIO是目前较理想的MR示踪剂， 一方 面主要用于靶向肝、脾、淋巴结、骨髓等富含网状内皮细胞的组织和 器官的MR成像；另一方面国内外学者先后采用不同的生物活性材料 包裹USPIO,并与特定的抗体或配体结合制成新的靶向性纳米磁探 针，用于MR分子成像研究，包括巨噬细胞受体成像、肿瘤细胞转铁 蛋白受体、叶酸受体成像、动脉粥样硬化斑块分子成像及干细胞移植 后迁徙、分化的示踪成像，显示了广阔的应用前景。Zhang等[ZhangC, Jugold M, Woe皿e EC, Lammers T, Morgenstern B, Mueller MM, Zentgraf H, Bock M， Eisenhut M， Semmler W, Kiessling F. Specific targeting of tumor angiogenesis by RGD-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a clinical 1.5-T magnetic resonance scanner. Cancer Res, 2007, 67(4): 1555画1562.]利用APTMS包 被USPIO并与RGD肽偶联形成靶向肿瘤新生血管的纳米磁性探针，进 行了体外细胞学水平与活体MR分子成像研究。结果表明，RGD肽修 饰的USPIO纳米磁探针在体外具有良好的靶向肿瘤新生血管内皮细 胞整合素avP3受体的作用，而在活体内分子成像效果并不理想。我们 采用聚乳酸(Poly lactic acid, PLA)作为包裹材料，结果显示其具有更好的生物相容性和稳定性。
发明内容
本发明要解决的技术是提供一种USPIO-PLA-RGD复合物及其 制备方法和应用，将其作为在磁共振成像中能特异性使肿瘤新生血管 显像的对比剂，具有特异性高、选择性强、毒副作用低、生物相容性 和稳定性好等优点。
一种USPIO-PLA-RGD复合物，所述的USPIO-PLA-RGD复合物 为以USPIO为核心，外面包裹PLA,记为PLA-USPIO;然后利用 PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所 述的USPIO-PLA-RGD复合物；所述USPIO-PLA-RGD复合物的水合 粒径为90-105nm;所述的USPIO即超微型超顺磁性氧化铁微粒，所 述的PLA即聚乳酸，所述的RGD肽即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽。
本发明中所述USPIO-PLA-RGD复合物的核心USPIO的粒径优 选为3-5nm。
本发明中所述的PLA-USPIO的水合粒径优选为60-75nm。 本发明提供了 一种上述USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，所 述的制备方法包括如下步骤 (1 ) PLA-USPIO的合成
取FeCl2.4H20、 FeCl3.6H20和PJLA，使之均匀分散在15 25%乙 醇水溶液中，混合溶液中Fe"与Fe"摩尔比为1: 1.6 2.2，所述 FeCl2.4H20与PLA的投料质量之比为1: 6~7,所述15~25%乙醇水 溶液的体积用量以FeCl2.4H20的质量计为60 70ml/g;在化学惰性气 体保护下，滴加氨水使pH值达到9~10，剧烈搅拌反应，然后取出反应溶液陈化、洗涤、离心得到PLA-USPIO,并重新分散到去离子水
中；
(2 ) RGD与PLA-USPIO的偶联
在pH为4~6的緩冲液体系中，以EDC和sulfo-NHS为活化剂， 所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比为1-1.5: 1，使PLA-USPIO 表面的羧基活化，所述PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比为1:25 35, 所述pH为4 6的緩冲液体系中控制Fe离子的终浓度为 0.8 1.5mg/ml;然后调节緩冲液体系的pH值在7 9,加入RGD肽使 PLA-USPIO和RGD肽搅拌反应，充分反应后终止反应，即得到 USPIO-PLA-RGD;所述PLA-USPIO和RGD肽的才殳泮+摩尔比为1: 25 35，所述pH值在7 9的緩冲液体系中控制RGD肽的才更料终浓度 为1 1.5mg/ml;所述的EDC即l-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亚胺， 所述的sulfo-NHS即N-羟基硫代琥珀酰亚胺。本发明中PLA-USPIO 的摩尔数是以其中USPIO的摩尔数计；
所述步骤(1)中，乙醇水溶液的浓度推荐为15 25%,优选20%; 步骤(l)中剧烈搅拌反应时间一般在15 30分钟。所述的剧烈搅拌 反应在化学惰性气体保护下进行，所谓的化学惰性气体除了狭义上的 惰性气体外，还包括不参与本发明反应的气体，如氮气等，本发明优 选在氮气保护下进行反应。本发明具体推荐所述反应溶液的陈化条件 为在75 85°C陈化1.5~2 h，优选在80°C陈化2h。
本发明所述步骤(2)分为两个过程， 一是活化过程，二是偶联 过程。在活化过程中，在活化剂EDC和sulfo-NHS的作用下， PLA-USPIO表面的羧基被活化，此过程在pH为4 6的活化緩沖液体 系中进行，最优选在pH为5.5的活化緩冲液体系中进行；随后经过
7活化的PLA-USPIO与RGD肽在pH值在7 9的偶联緩冲液中发生偶 合反应得到RGD-PLA-USPIO,最优选在pH为8.8的偶联i爰沖液体 系中反应。活化緩冲液和偶联緩沖液可选择不同的緩冲液，也可选择 相同的緩冲液，本发明所述的pH为4 6的活化緩冲液和pH值在7 9 的偶联缓沖液可独立选自下列之一PBS (磷酸盐缓沖液)，borate buffer(硼酸盐緩冲液)，bicarbonate/ carbonate(碳酸盐緩沖液)，HEPES 緩冲液。 一般为操作方便，活化緩冲液和偶合緩沖液可选用同一类緩 沖液，本发明优选使用硼酸盐緩冲液。
本发明所述的PLA-USPIO和RGD肽的投料摩尔比推荐为1: 25 35，优选1: 30;所述的PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比推荐 为1: 25 35，优选l: 30;所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比 为1-1.5: 1
本发明在活化过程中，优选控制活化緩沖液中Fe离子的终浓度 为0.8 lmg/ml。
所述PLA-USPIO和RGD肽的反应时间推荐为1.5~2h 。
本发明所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为磁共振肿瘤新生血 管耙向对比剂的应用，利用USPIlCmA-RGD肽复合物与肺瘤新生血 管内皮细胞上的av|33受体高亲和力的特性来实现靶向显影。
本发明的有益效果在于 'a)本发明利用av(33整合素受体与其配体RGD肽亲和力高的特 性来实现靶向显影，是受体-配体导向系统，其结合具有特异性、选 择性、饱和性、亲和力强和生物效应明显等特点。利用配体RGD肽 作为USPIO的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓 度，降低毒副作用，达到靶向肿瘤新生血管活体显像目的。b )本发明以PLA作为包裹材料，具有很好的生物相容性和稳定性。
四、 附图i兌明
图1是实施例1制得的PLA-USPIO的透射电镜图2是实施例1制得的PLA-USPIO的动态光散射谱；
图3是实施例1制得的RGD-PLA-USPIO的动态光散射谱；
图4为实施例2中HUVECs细胞和RGD-PLA-USPIO共同孵育
3 0分钟后的Prussian Blue Stain结果；
图5是实施例2中HUVECs细胞和PLA-USPIO共同孵育30分
钟后Prussian Blue Stain结果；
图6是实施例3中兔VX2肿瘤在RGD-PLA-USPIO注射前后的
磁共振T1WI与T2WI信号强度变化结果；
图7是实施例3中兔VX2肿瘤在RGD-PLA-USPIO注射前后的
磁共振T2*W{与SWI信号强度变化结果。
五具体实施例方式
下面以具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发 明的保护范围不限于此 实施例1: USPIO-PLA-RGD复合物的制备 1、 PLA-USPIO的合成
730毫克FeCl3.6H20和300毫克FeCl2.4H20溶于20ml含20%乙 醇的去离子水与乙醇的混合溶液中，Fe"与Fe"摩尔比约为1: 2。取 2g聚乳酸溶于上述溶液中，必要时以超声作用使各项组分充分均一分散在溶液体系中。在氮气保护条件下，逐滴加入5MNaOH或者 28%NH3.H20，使pH值达到10，剧烈搅拌反应半小时。耳又出反应溶 液在80。C水浴中陈化2小时促使晶体成熟。以去离子水洗涤，10000 转离心10分钟5次后得到磁性纳米粒子，调整Fe离子浓度为5mg/ml。 2、 RGD与PLA-USPIO的偶耳关
取100 M 1 Fe离子浓度为5mg/ml PLA-USPIO,加入100 ju 1蒸馏 水等比稀释后，以活化緩冲液(pH5.7、 20Mm borate buffer)配成 lmg/ml的溶液。分别取5mg的EDC和sulfo-NHS溶于活化緩冲液， 终浓度lmg/ml。取EDC和sulfo-NHS各30 |i 1依次加入PLA-USPIO 体系，以磁力搅拌器在室温搅拌反应10分钟。以460jul反应緩冲液 (pH9、 10mM borate buffer)调节pH值到8.8。加入200 ja 1 RGD(7-8mg/ml),磁力搅拌室温反应2小时后以lMTris-HCl终止反 应。用磁铁除去多余的淬灭试剂，调整RGD-PLA-USPIO的Fe浓度 为0.5mg/ml。
实施例2: RGD-PLA-USPIO复合物的体外表征
1 )透射电镜透射电镜图如图l所示，图l显示，USPIO-PLA-RGD 复合物的核心USPIO的粒径在3-5nm左右。
2 )动态光散射将实施例1制得的PLA-USPIO水溶液和 RGD-PLA-USPIO水溶液分别置于粒度仪中，其动态光散射谱分别如 图2和图3所示，结果显示PLA-USPIO的水合粒径为62nm左右， RGD-PLA-USPIO的水合粒径在95nm左右。
3)FT.IR:将RGD-PLA-USPIO冻干后取固体行FT-IR，在谱线 上可以观察到羧基峰。
104 ) RGD-PLA-USPIO的体外实验
将人脐静脉内皮细胞HUVECs (上海交通大学药学院馈赠)种植 于六孔板，分别给与实施例1制得的含RGD-PLA-USPIO的培养基 2ml或含PLA-USPIO的培养基2ml，孵育2小时后收集细胞，分散 于明胶中进行MR检测。对于Prussian Blue Stain则将细胞离心后重 新种植于玻片上，孵育过夜。以4%多聚曱醛固定细胞半小时，用蒸 馏水洗涤，加入2%稀盐酸和2%亚铁氰化钾的混合溶液，反应半小 时后再以蒸馏水洗涤3次，以核快红染色，脱水透明后封片。HUVECs 细胞和RGD -PLA-USPIO共同孵育30分钟后，可见在细胞周围有蓝 色的铁颗粒呈花环样附着(如图4所示)，表明RGD-PLA-USPIO与 内皮细胞表面整合素受体特异性结合；HUVECs细胞和PLA-USPIO 共同孵育30分钟后，在内皮细胞周围没有见到蓝色4失颗粒(如图5 所示)，表明没有连接RGD的PLA-USPIO不能与内皮细胞表面的整 合素受体进行有效的特异性结合。
实施例3: RGD-PLA-USPIO荷瘤动物实验
1) 兔VX2肿瘤模型制备
纯种新西兰大白兔，月龄2~3个月，雌雄不限，体重1.6~ 1.8kg。 利用咪唑安定注射液(5mg/kg)与盐酸氯胺酮注射液(25mg/kg)混 合溶液肌肉注射麻醉成功后，对其一侧大腿近段外侧皮肤常规脱毛、 消毒，将0.1ml VX2肿瘤组织悬液注入大腿股外侧肌内，约2周成模。 肿瘤呈类圆形实质性肿块， 一皮膜清晰，内部信号均匀一致。
2) 实验动物MR成傳—新西兰大耳白兔在后肢接种VX2肺瘤，约两周后备用。在注药
前先行麻醉并在耳缘静脉置管，在1.5T磁共振行平扫。完成扫描后， 按Fe3mg/kg经耳缘静脉留置管分别注射实施例1制得的 RGD-PLA-USPIO和PLA-USPIO并进行即时、15分钟、30分钟、1 小时、6小时、24小时动态扫描并测量各时段MR信号强度。
3) MR信号测量
在相同层面分别在肺瘤、瘤周组织、对侧后月支月几肉和肝脏耳又一致 的感兴趣区(面积为3mm)，测量丁1\￥1/丁2\￥1/丁2*\\^1等序列的信号 强度，计算T2值，并做时间-信号强度曲线。
4) 数据处理
采用SPSS 10.0以ANOVA方法对所得数据进行统计学处理。在 RGD-PLA-USPIO药物注射后30分钟，肺瘤周边信号开始下降，其 后信号逐步降低，在6小时达到最低。而注射PLA-USPIO后，肿瘤 部位未出现明显的信号降低。
MR成像结果如图6、图7所示，其中
图6是注射前在T1WI肿瘤基本为等信号，T2WI为高信号，注 射RGD-PLA-USPIO之后显示Tl WI肿瘤整体信号略有提高，在T2WI 在肺瘤边缘可见多个信号减低区。
图7是注射RGD-PLA-USPIO之后在T2*WI图像可以发现比 T2WI更为显著的信号减低区，在SWI图像的相应解剖区域可见更为 明显的影像学表现，提示SWI和T2*WI比T2WI对于USPIO的检测 更为敏感。
权利要求
1、一种USPIO-PLA-RGD复合物，所述的USPIO-PLA-RGD复合物为以USPIO为核心，外面包裹PLA，记为PLA-USPIO；然后利用PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所述的USPIO-PLA-RGD复合物；所述USPIO-PLA-RGD复合物的水合粒径为90-105nm；所述的USPIO即超微型超顺磁性氧化铁微粒，所述的PLA即聚乳酸，所述的RGD肽即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽。
2、 如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其特征在于所述 的USPIO的核心冲立径为3~5nm。
3、 如权利要求1或2所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其特征在于 所述的PLA-USPIO的水合粒径为60-75nm。
4、 一种如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法， 其特征在于所述的制备方法包括如下步骤(1 ) PLA-USPIO的合成取FeCl2.4H20、 FeCl3.6H20和PLA,使之均匀分散在15 25%乙 醇水溶液中，混合溶液中Fe"与Fe^摩尔比为1: 1.6~2.2,所述 FeCl2.4H20和PLA的投料质量之比为1: 6~7,所述15 25%乙醇水 溶液的体积用量以FeCl2.4H20的质量计为60~70ml/g;在化学惰性气 体保护下，滴加氨水或氢氧化钠溶液使pH值达到9 10，剧烈搅拌反 应，然后取出反应溶液陈化、洗涤、离心得到PLA-USPIO，并重新 分散到去离子水中；(2 ) RGD与PLA-USPIO的偶联在pH为4~6的緩沖液体系中，以EDC和sulfo-NHS为活化剂， 所述的EDC与sulfo-NHS的投料摩尔比为1-1.5: 1，使PLA-USPIO 表面的羧基活化，所述PLA-USPIO与EDC的投料摩尔比为1:25~35，所述pH为4~6的緩沖液体系中Fe离子的终浓度为0.8 1.5mg/ml; 然后调节緩沖液体系的pH值在7~9，加入RGD肽使USPIO-PLA和 RGD肽搅拌反应，充分反应后终止反应，即得到USPIO- PLA - RGD; 所述PLA-USPIO和RGD肽的投料摩尔比为1: 25 35，所述pH值 在7 9的緩沖液体系中控制RGD肽的终浓度为1 1.5mg/ml;所述的 EDC即l-乙基-3-(3-二曱胺基丙基)碳二亚胺，所述的sulfo-NHS即 N-羟基硫代琥珀酰亚胺；所述的PLA-USPIO的摩尔数是以其中 USPIO的摩尔数计。
5、 如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特 征在于所述步骤(1 )中剧烈搅拌反应时间在15 30分钟。
6、 如权利要求l所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特 征在于所述反应溶液的陈化条件为在75 85°C陈化1.5~2 h。
7、 如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特 征在于所述步骤(2 )中，pH为4 6的緩冲液和pH为7 9的IC冲液 各自独立选自下列一种磷酸盐緩沖液，硼酸盐緩冲液，碳酸盐緩沖 液，HEPES緩沖液。
8、 如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物的制备方法，其特 征在于所述PLA-USPIO和RGD肽的反应时间为1.5~2 h。
9、 如权利要求1所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为f兹共振肿瘤新 生血管耙向对比剂的应用。
全文摘要
本发明公开了一种USPIO-PLA-RGD复合物及其制备方法和应用，所述的USPIO-PLA-RGD复合物为以USPIO为核心，外面包裹PLA，记为PLA-USPIO；然后利用PLA表面暴露的官能基团羧基与RGD肽的氨基进行共价偶联得到所述的USPIO-PLA-RGD复合物，其水合粒径为90-105nm。本发明所述的USPIO-PLA-RGD复合物作为磁共振肿瘤新生血管靶向对比剂应用。本发明利用αvβ3整合素受体与其配体RGD肽亲和力高的特性来实现靶向显影，其结合具有特异性、选择性、饱和性、亲和力强和生物效应明显等特点。利用配体RGD肽作为USPIO的载体，通过受体介导作用，增加药物在病灶局部的浓度，降低毒副作用，达到靶向肿瘤新生血管活体显像目的。
文档编号A61K49/06GK101590245SQ200910099979
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月29日 优先权日2009年6月29日
发明者张敏鸣, 张景峰, 林冰影, 武新英, 晖 毛, 谭延斌 申请人:浙江大学