专利名称：三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因治疗领域，特别涉及一种利用人5型腺病毒(Ad5)骨架来 嵌合人11型腺病毒(Adll)纤维蛋白(fiber)的三靶向嵌合型溶瘤腺病毒载 体的构建方法及携带所有具有杀伤、抑制癌症的外源基因如IL_24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-S0CS1的应用。
背景技术：
恶性肿瘤严重危害人类健康，目前临床上对绝大多数晚期肿瘤患者仍然缺 乏有效的治疗手段。当细胞生物学和分子生物学理论与技术得到飞速发展，基 因治疗肿瘤策略应运而生。而随着病毒学和肿瘤学快速发展，人们又尝试将改 造后的病毒用于肿瘤治疗的研究工作。
癌症的耙向基因一病毒治疗策略是利用溶瘤病毒在肿瘤细胞内特异性裂 解、增殖来提高抗癌基因对癌细胞的强烈杀伤作用或抑制作用。这与传统肿瘤 基因治疗的病毒载体有本质上的不同，后者是一种非复制性病毒，仅仅作为运 载工具将抗癌基因运输到组织或细胞内，而载体本身无靶向性和复制能力也无 治疗作用。靶向基因一病毒治疗充分利用病毒体积小、能复制和扩散能力强的 优点，可在肿瘤原发病灶和转移灶局部形成高浓度病毒，并激发免疫系统应答 来增强杀瘤效应；同时还可以将抗癌基因靶向地运至肿瘤细胞内，抗癌基因能 随着病毒的复制而增加拷贝数，提高抗癌基因的表达量，两者协同作用从而进 一步提高抗肿瘤的疗
目前作为基因治疗的载体分为病毒型和非病毒型两大类。病毒载体包括 腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、和疱疹病毒等。病毒载体转染率 高，表达时间长，但免疫原性强，有一定危险性。非病毒载体包括裸露DNA、 脂质体和其它物质包裹的DNA。非病毒载体则免疫原性小及安全性好，但转染率 低，基因稳定性差，表达时间短。目前使用最多还是病毒载体。而在众多病毒 载体中腺病毒以其宿主范围广，致病性低，包装容量大，产生滴度高等优点成 为应用最广的基因治疗载体。根据http:〃www.wiley. co.uk/genmed的最新统 计，全球共有1145个基因治疗方案进入临床，其中67%用于癌症的治疗，而以 腺病毒为载体的研究最为广泛且高达25%。
而关于5型腺病毒(Ad5)的研究已经进行了很长的时间，对其所具有的特 点及安全性均一定的了解和认识，目前腺病毒基因治疗仍以Ad5为主导。由于Ad5对细胞的感染效率高度依赖于细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsakie and adenovirus rec印tor， CAR)的表达水平，但在近50%的上皮细胞源性的肿 瘤细胞表面CAR非常缺乏，甚至在血液肿瘤细胞表面几乎不表达，这就使得腺 病毒对这些肿瘤细胞感染效率低下，甚至对血液系统肿瘤无感染能力。这一特 性限制了其在上皮细胞源性的肿瘤细胞和血液肿瘤细胞的治疗中的应用。因此 再此基础上研制高效、靶向转染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至 关重要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种三耙向嵌合型溶瘤腺病 毒Ad5/Fll载体的构建方法及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 一种三耙向嵌合型溶瘤腺病毒 Ad5/Fll载体的构建方法，该方法是以双靶向溶瘤腺病毒载体pCN103和pCN205 做为基础，通过将5型腺病毒Ad5的骨架与人11型腺病毒Adll的纤维蛋白fiber 进行嵌合并利用端粒酶逆转录酶hTERT启动子来调控缺失了 CR2区与Rb蛋白结 合所必需的24bp的E1A基因。
进一步地，该方法具体包括以下步骤
(1) 通过PCR的方法，将人11型腺病毒的Fiber基因装载于穿梭质粒 pllzf-ad5-adllp。
(2) 通过同源重组的方法将人11型病毒Fiber基因替换PCN103骨架质粒中的 5型病毒Fiber基因。
(3) 用酶切连接的方法构建E3区缺失6. 7K和gpl9K基因的载体质粒pCN204;
(4) 将所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-S0CS1克隆进pCN204的多克隆位点，构建成质粒 pCN204-IL-24。
(5) 将质粒pCZ204-IL-24通过酶切和片段回收后，电转化在BJ5183同源重组， 获得三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体，命名为pCN205-llp载体。
用获得的载体pCN205-llp构建三靶向嵌合型溶瘤腺病毒如 AdCN205—11—IL-24、 AdCN205-11-TRAIL、 AdCN205-11-S0CS3 、 AdCN205-11-cpp-S0CS3， AdCN205-11 -S0CS1和AdCN205-ll-cpp-S0CS1，可用 于制备治疗肿瘤的药物的用途。
本发明的有益效果是 1.本发明将肿瘤的病毒疗法和基因治疗有效地结合了起来，可高效表达外源基 因，相对于单纯的病毒疗法增强了对肿瘤的杀伤能力。2. 本发明采用了一种三重靶向肿瘤的策略，从病毒对细胞的感染到病毒在细胞 内的复制都做到了特异性，可以有效地靶向肿瘤细胞，并在其中特异性增殖。 从而大大增强了腺病毒基因治疗载体的安全性。
3. 本发明采用肿瘤特异性启动子和病毒复制相关基因缺失两种方式，确保了病 毒的肿瘤内特异性复制，大大增强了腺病毒基因治疗载体的安全性。
4. 本发明通过构建的新型三靶向嵌合型溶瘤腺病毒基因治疗载体使所有杀伤、
抑制癌症的基因如IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-S0CS1 发挥了较好的肿瘤杀伤效果。
图1是穿梭质粒pllzf-ad5-adllp构建流程图2是质粒pCN103-llp、质粒pCN205-EGFP-llp及质粒pCN205-IL24-llp 构建流程图3是嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11 (AdCN205-11-EGFP)对CD46+肿瘤细胞 和正常血液细胞感染复制效率示意图4是MTT法检测CD46+肿瘤细胞和正常细胞经不同病毒处理后4天的存活
率示意图5是MTT法检测AdCN205-EGFP与AdCN205-11-IL-24对实体瘤细胞的毒 性比较图6是嵌合型病毒AdCN205-ll-EGFP和AdCN205-11-IL-24在血液肿瘤细胞
中的复制能力示意图7是嵌合型病毒AdCN205-11-EGFP和AdCN205-11-IL-24在血液肿瘤细胞
中抗癌因子IL-24的表达示意图。
具体实施例方式
本发明以5型腺病毒(Ad5)骨架嵌合人11型腺病毒(Adll)纤维蛋白(fiber) 来构建出可高效表达外源基因的嵌合型溶瘤腺病毒载体，该病毒除拥有Ad5骨 架外，还拥有Adll的fiber。本腺病毒载体还利用人端粒酶逆转录酶(hTERT) 启动子调控腺病毒E1A基因，同时将E1A序列上该基因产物CR2区与Rb蛋白结 合所必需的24bp缺失，因此该病毒载体既有Ad5的安全性，又有Adl 1靶向CD46+ 的上皮细胞源性的肿瘤细胞和血液肿瘤细胞的特性。因而具有高效地肿瘤内特 异性增殖能力。本发明提供一种三重靶向肿瘤的策略，使病毒可以特异地在肿 瘤细胞内复制从而提高对人体的安全性。该特点己经通过实验证明该病毒载体 具有更高效的靶向性和基因表达效果。本发明更加高效和安全地将基因治疗与 病毒治疗联合起来使其更具有高效的杀伤肿瘤细胞大的作用，在此基础上来进一步开发出新的抗癌药物。
本发明三耙向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/Fll载体的构建方法在具有靶向性的 pCN103和pCN205的基础上加以构建，并利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子 来调控缺失了 CR2区与Rb蛋白结合所必需的24bp的E1A基因。它包括以下步骤
1、 通过PCR的方法，将11型腺病毒的Fiber基因装载于穿梭质粒 p11zf-ad5-ad11p。
2、 通过同源重组的方法将11型病毒Fiber基因替换pCN103骨架质粒中的 5型病毒Fiber基因。
3、 用酶切连接的方法构建E3区缺失6. 7K和gpl9K基因的载体质粒pCN204;
4、 将所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL-24、 TRAIL、 S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-SOCSl克隆进pC腦4的多克隆位点，构建成质粒 pCN204-IL-24、
5、 将所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如pCZ204-IL-24通过酶切和 片段回收后，电转化在BJ5183同源重组，获得pCN205-IL-24-llp;并使用同样 的方法可以得到所有pCN205-外源基因重组质粒如pCZ205-RAIL-llp、 pCZ205-S0CS3-llp、 pCZ205—pp—S0CS3-llp、 pCZ205—SOCSl-llp和pCZ205—cpp-SOCSl-llp。
6、 分别将步骤5所描述的质粒进行酶切消化，在293细胞中包装，获得表 达各类杀伤和抑制各类癌症的外源基因的腺病毒如AdCN205-ll-IL-24、 AdCN205-11-TRAIL 、 AdCN205-11-S0CS3 、 AdCN205-11-cpp-S0CS3 ， AdCN205-11-S0CS1和AdCN205-11-cpp-S0CS1。
三耙向嵌合型溶瘤腺病毒基因治疗载体pCN205-llp构建的三靶向嵌合型溶 瘤腺病毒如AdCN205-11-IL-24、 AdCN205-11-TRAIL 、 AdCN205-11-S0CS3 、 AdCN205-11-cpp-S0CS3， AdCN205-11 -S0CS1和AdCN205-11-cpp-S0CS1用于制 备治疗肿瘤的药物的用途。
本发明提供了一种利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子来调控表达缺失 了 CR2区与Rb蛋白结合所必需的24bp的E1A基因所插入的所有具有杀伤、抑 制癌症的外源基因如S0CS1、 cpp-S0CS1、 SOCS3、 cpp-S0CS3、 TRAIL和IL-24 的三靶向嵌合型溶瘤腺病毒基因治疗载体pCN205-11的构建方法和应用。
该发明提供载体例如pCN205-IL-24-llp 、 pCN205-TRAIL-llp 、 pCN205-S0CS3-llp 、pCN205-cpp-S0CS3-llp 、pCN205-S0CS1-llp 和 pCN205-cpp-S0CS1-llp的构建方法.
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，应理解以下实施例仅用于说
明本发明而不用于限定本发明的范围。(以抑癌基因IL-24为例，图示出三靶向嵌合型溶瘤腺病毒pCN205-lip载体的构建方法及其用于制备治疗肿瘤的药物的 构建流程和治疗效果。)
实施例1:可携带外源基因的肿瘤靶向的嵌合型溶瘤腺病毒载体 pCN205-IL-24-llp的构建和病毒AdCN205-11-IL-24的获得
一、 构建穿梭质粒pllzf-ad5-adllp:
1. Sac I， EcoR I双酶切3602质粒，回收1706bp条带，命名为LI; Sac I， EcoR I双酶切pGEM-11ZF(+)质粒，命名为J1。
2. 连接L1， Jl得到4925bp质粒，命名为J2。
3. PCR 3602质粒(32788 — 33105)，命名为L2。引物为Primer L2 up: 5> aactcccc cttaaggcatgcact<3 (力口入酶切位点SphI ); Primer down: 5> agggcccagaatcgtttgtgt〈30
4. Apa I， Sph I双酶切J2质粒，得到J3; Apa I， Sph I双酶切L2片段得到 L2-l。
5. 连接J3和L2-1，得到质粒J4 (5233bp)。
6. Hind III， Afl II双酶切3602，回收1826bp片段L3; Hind III， Afl II 双酶切J4后得到J5，并与L3连接得到J6。
7. 共同PCR 3602质粒与野毒wtAdll基因组。引物为Primer L4 Ad5 up: 5〉tagaattctttaattatgaaattt〈3; Primer L/4 Ad5/ll: 5〉aatgggtttcaagagagtccccctggagttctt;actttaaaatgtttaaccccaX3; Primer L4 Adll down: 5>gttatgtttcaacgtgtttat<3。
得到一个2015bp片段。命 名为L4
8. EcoR I， Apa I双酶切L4， J6， 二者回收片段后连接为J7。 (8985bp)
9. Mlu I， Not I双酶切3602质粒，回收5188bp片段命名为L5。
10. Sac I， Not I双酶切pGEM-llZF(+)回收片段与L5连接，Srf I鉴定正确的 质粒命名为pGEM-llzf-L5。
11. Sac I， Not I双酶切pGEM-llzf-L5， J7二者回收片段连接后命名为J8，即 pllzf-ad5-adllp。(构建图谱如图1所示)
二、 构建骨架质粒pCN103-llp:
1. pCN103用Srf I单切，回收30000bp左右片段；J8质粒用Sph I， BamH I 双切，回收9082bp条带。
2. 回收条带于大肠杆菌Ecoli. BJ5183感受态中重组，PCR与酶切法鉴定正确重 组子。
3. 将正确重组子转于大肠杆菌ToplO感受态中，挑取单克隆菌，PCR法与酶切法鉴定正确重组子，命名为pCN103-llp。(构建图谱如图2所示)
三、 构建质粒pCN205-IL24-llp:
1. pCN103-llp质粒用用Srf I单切，回收30000bp左右片段；pCN204-IL24质 粒用Mlu I， Nde I双切，回收6514bp条带。
2. 回收条带于大肠杆菌Ecoli. BJ5183感受态中重组。
3. 将正确重组子转于大肠杆菌ToplO感受态中，挑取单克隆菌，PCR法与酶切 法鉴定正确重组子，命名为pCN205- IL24-llp。(构建图谱如图2所示)
四、 包装病毒AdCN205-11-IL-24:
1. 用限制性内切酶PacI线性化病毒质粒。37。C水浴2小时，产物跑1%琼脂糖 凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction)回收30000bp左 右条带。
2. HEK293细胞中包装病毒。
按照细胞转染按试剂盒(Effectene)说明书进行操作，将回收后片段转染 至HEK293细胞中。具体步骤如下
转染前12小时于6孔板中铺1X106HEK293细胞。12小时后将共约1 u g的 线型化质粒补加EC buffer至150 u 1，再加入8 ti 1 Enhancer buffer,振荡1秒 钟，室温静置5分钟。在上述混合物中加入25ul Effectene，颠倒混匀五次， 室温温育10分钟。2mlPBS洗流孔板中的HEK293细胞一次，然后加入lml新鲜 培养基，同时加lml新鲜培养基于上述混合物中，上下颠倒两次后加到细胞培 养皿中，于37。C， 5%0)2培养6-18小时后吸去培养基，PBS洗一次，加入2 ml 含2。/。FBS的新鲜培养基。9-14天出现病毒空斑，收病毒进行大量扩增。
实施例2:病毒对CD46+肿瘤细胞和正常血液细胞感染效率实验
根据预试验测定的细胞生长速率，将对数生长期的髓系白血病细胞株K562、 Kasumi-1， T系白血病细胞株6T-CEM和外周血淋巴细胞(正常细胞)PBMC以 5X105个/孔植入6孔培养板，37°C 5%C02温箱中培养6h。将上述细胞分为2 组，分别用非复制型腺病毒Ad5-EGFP、Adll-EGFP和复制型腺病毒AdCN205-EGFP、 AdCN205-ll-EGFP感染，37°C 5%C02温箱中培养24h后，收集上述细胞，用含 2%FBS的PBS洗2次，重悬于500 u 1 2%FBS的PBS，流式细胞仪检测EGFP阳性 率。以上实验分别用1、 10、 100M0I三个浓度梯度的病毒感染，无病毒感染的 细胞作对照(Control)。
结果如图3所示，嵌合型溶瘤腺病毒AdCN205-ll-EGFP显著提高了对CD46+ 血液肿瘤细胞的感染复制效率，对正常血液细胞并没有表现出侵嗜，说明具有 肿瘤特异性。实施例3:病毒AdCN205-ll-IL-24在体外对正常细胞和肿瘤细胞的杀伤能 力检测
将对数生长期的髓系白血病细胞株K562、 Kasumi-l，宫颈癌细胞株Hela， 肺癌细胞株H460和结肠癌细胞株Sw620以1X 104/孔的量接种入96孔板；将对 数生长期的T系白血病细胞株6T-CEM和外周血淋巴细胞(正常细胞)PBMC以 2X104/孔的量接种入96孔板，培养24h后每孔加入10M0I病毒，以不加病毒 的细胞作为对照，以不加病毒和细胞的样品做调零孔，各做6个复孔。于37'C 5呢C02培养箱中继续培养。在病毒感染细胞24、 48、 72、 96、 120h后，每孔加 入MTT溶液(5mg/ml) 20yl， 37。C继续培养4h后，追加三联液(10%SDS， 5% 异丙醇，0.01MHC1) 100lil。培养箱中过夜后用酶标仪检测595nm下每孔的吸 收值(A595)。以时间为横轴，实验孔减去调零孔与对照孔减去调零孔的光吸收 比值为纵轴绘制细胞生长曲线。
结果如图5所示①与对照组相比，病毒AdCN205-11-IL-24对髓系白血病 细胞有更强的杀伤作用；②AdCN205-11-IL-24同样具有显著的抗实体瘤特性， 并且体现一定的优越性；③AdCN205-ll-IL-24对正常细胞毒性很小。
实施例4:病毒AdCN205-11-IL-24在血液肿瘤细胞中复制能力分析
6孔板每孔接种5X105月中瘤细胞(K562， Kasumi-1， 6T-CEM) 24h后分别 用 10MOI 的 AdCN205-EGFP 、 AdCN205-IL-24 、 AdCN205-11-EGFP 和 AdCN205-11-IL-24病毒感染细胞。4h后，吸净培养基，用PBS洗2次，再添加 2ml新鲜培养基。病毒感染48h后收集病毒感染液，在-2(TC与37'C反复冻融3 次以释放病毒，12000rpm离心5min，吸取上清抽提病毒DNA通过Real-Time PCR 法检测病毒滴度(结果如图6所示)。
实施例5:病毒AdCN205-11-IL-24在血液肿瘤细胞中表达外源基因能力分
析
6孔板每孔接种5X105肿瘤细胞(K562, Kasumi-1， 6T-CEM) 24h后分别用 10M0I的AdCN205-IL-24和AdCN205-ll-IL-24病毒感染细胞。4h后，吸净培养基， 用PBS洗2次，再添加2ml新鲜培养基。病毒感染72h后收集病毒感染液，2000rpm 离心3min，收集沉淀细胞，加入100ul 1Xloading buffer以裂解细胞，将细 胞裂解物在10(TC水浴10niin以得到总蛋白。每孔加入等量总蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳。电泳结束后按半干法将电泳产物转印到NC膜上。5%脱脂奶粉室 温封闭2h，滴加一抗(1 : 1000稀释)37。C孵育2h， TPBS洗膜5 minX3次，滴加 荧光标记的二抗(1 : 2000稀释)37。C孵育lh， PBS洗膜5 minX3次。Odyssey Infrared Imaging System扫描检测(结果如图7所示)。
权利要求
1.一种三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法，其特征在于，该方法是以双靶向溶瘤腺病毒载体pCN103和pCN205做为基础，通过将5型腺病毒Ad5的骨架与人11型腺病毒Ad11的纤维蛋白fiber进行嵌合并利用端粒酶逆转录酶hTERT启动子来调控缺失了CR2区与Rb蛋白结合所必需的24bp的E1A基因。
2. —种权利要求1所述三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法， 其特征在于，该方法具体包括以下步骤(1) 通过PCR的方法，将人11型腺病毒的Fiber基因装载于穿梭质粒 pllzf-ad5-adllp。(2) 通过同源重组的方法将人11型病毒Fiber基因替换pCN103骨架质粒中的 5型病毒Fiber基因。(3) 用酶切连接的方法构建E3区缺失6. 7K和gpl9K基因的载体质粒pCN204;(4) 将所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL-24、 TRAIU S0CS3、 cpp-S0CS3、 S0CS1和cpp-SOCSl克隆进pCN204的多克隆位点，构建成质粒 pCN204-IL-24。(5) 将质粒pCZ204-IL-24通过酶切和片段回收后，电转化在BJ5183同源重组， 获得三耙向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体，命名为pCN205-llp载体。
3. —种权利要求2所述三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法 的用途，其特征在于，用该方法获得载体pCN205-llp构建的三靶向嵌合型溶瘤 腺病毒如AdCN205-11-IL-24 、 AdCN205-11-TRAIL 、 AdCN205-11-S0CS3 、 AdCN205-11-c卯-S0CS3， AdCN205-11 -S0CS1和AdCN205-11-cpp-S0CS1用于制 备治疗肿瘤的药物的用途。
全文摘要
本发明公开了一种三靶向嵌合型溶瘤腺病毒Ad5/F11载体的构建方法及其应用，该载体是以双靶向溶瘤腺病毒载体pCN103和pCN205做为基础，通过将5型腺病毒Ad5的骨架与人11型腺病毒Ad11的纤维蛋白fiber进行嵌合并利用端粒酶逆转录酶hTERT启动子来调控缺失了CR2区与Rb蛋白结合所必需的24bp的E1A基因，同时还利用该载体系统来调控表达所有具有杀伤和抑制各类癌症的外源基因如IL-24、TRAIL、SOCS3、cpp-SOCS3、SOCS1、cpp-SOCS1，且通过在体内外实验均显现出很好的抗癌效果。应用本发明构建的所有三靶向嵌合型溶瘤腺病毒如AdCN205-11-IL-24、AdCN205-11-TRAIL、AdCN205-11-SOCS3、AdCN205-11-cpp-SOCS3、AdCN205-11-SOCS1和AdCN205-11-cpp-SOCS1都可用于治疗各类肿瘤，并可以开发出有效的治疗肿瘤的病毒-基因抗癌新药。
文档编号A61K48/00GK101565718SQ20091009960
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者立 刘, 磊 张, 智 杨, 程 钱 申请人:浙江理工大学