专利名称：一种组织工程骨移植物及其构建方法
技术领域：
本发明涉及骨缺损的 一种修复材料，属于生物医学组织工程中用基 因增强骨组织工程技术构建仿生人工骨的技术领域，具体涉及一种仿生' 人工骨的构建及应用。
背景技术：
由于创伤、肿瘤、先天性畸形、感染、病理等因素造成的骨组织 缺损是临床面临的难题之一，植骨术是解决这一问题的主要方法。植骨 术主要分为自体来源植骨术、同种异体或异种植骨术。这两种方法的弊 端或局限性主要有供源不足、供区损伤和取骨后的并发症、移植排斥反 应等。近年来随着组织工程学科的发展，利用组织工程学原理和方法构 建的组织工程骨移植可以改进上述弊端，组织工程为骨缺损的修复带来
美好的前景。骨组织工程研究主要有4方面支架材料、种子细胞、细胞 因子、临床使用。组织工程化骨作为骨修复材料的替代物可以避免生物 源修复材料的缺陷。将生物相容性好的有骨传导能力的并在体内可生物 降解的支架材料与具有强大诱骨活性的细胞因子结合可以使骨缺损修 复材料拥有骨传导和诱导的双重特性，在迅速成骨的同时植入材料逐渐 降解，为骨缺损的修复提供了全新的思路和方法。
骨髓间充质干细胞主要存在于骨髓中，现证实MSCs至少可向9种以 上成熟细胞分化，其中包括成骨细胞及内皮细胞，分化多向性提示它可 能成为细胞治疗和组织工程人工骨构建的理想种子细胞，因此，骨髓 MSCs成为骨组织工程理想的种子细胞。骨形态发生蛋白(BMP)于1965年由Urist首次发现以来，人们发现 BMP家族有20多个成员，BMP具有独特的诱导成骨活性，在修复骨质缺 损和促进骨折愈合等方面可以发挥重要作用。骨形态发生蛋白的安全性 和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，国内外学者对BMP和 rhBMP做的大量研究结果表明，BMP-2被认为具有最高的生物活性，是 最具有前途的骨诱导蛋白，能促使原位和异位成骨，被认为是最具有前 途的骨诱导物质，美国食品和药物管理局2004年正式批准BMP-2用于临 床治疗长骨骨折，但由于天然BMP-2在体内含量极微，半衰期短，提取 困难，使得对BMP-2的进一步研究和应用受到局限。采用BMP-2的基因治 疗手段，可在一定时期内获得持续的成骨效应，随着分子生物学、生物 化学、组织科学、基因科学等多方面知识的飞速发展，针对上面的阐述， 利用BMP2转基因诱导成骨可实现一定时间内的BMP2持续表达，实现了克 服BMP-2直接应用的不足。
纳米生物技术是目前国际生物技术领域的最前沿的研发热点，纳米 技术以其新颖、独特的思路和首批研究成果的问世，同样在医学科学技 术界引起巨大的反响。近年来在骨组织工程中，有关纳米羟基磷灰石 (Nano-HA)材料学的研究在国际上得到迅速发展，完整的科学体系正 在形成。Nano-HA具有与人体骨组织相似的无机成分(钩、磷)能制备出 不同形状、孔隙率和降解率的产品，羟基磷灰石纳米粒子引入到非亲水 性的可生降解聚酯基体材料中去，就有可能得到能^皮降解，力学性能较 好，骨诱导性能优越的新型骨修复材料。英国的Bonfield成功地合成 了模拟骨骼亚结构的纳米物质，该物质可取代目前骨科常用的合金材 料。它的主要成份是经与聚乙烯混合和压缩后的羟基磷灰石网(骨骼的 主要成份)，其物质特征正好符合理想的骨骼替代物的模数匹配，而且 不易骨折，并能与正常骨组织连接紧密，显示出了明显的正畸应用优势。
发明内容
本发明涉及用腺病毒介导下将BMP-2基因导入骨髓间充质干细胞复 合Nano-HA体外构建仿生人工骨，经实验证实细胞复合前后可高效表达 BMP-2并促进其增殖分化；转基因细胞复合Nano-HA支架中扫描电镜见细 胞贴附生长良好，细胞可持续分泌表达BMP-2。用上述方法构建的仿生 人工骨植入桡骨缺损模型可以很好的修复桡骨节段性骨缺损。我们通过 实验证实缺损模型12周时骨折完全愈合，皮质骨连续,'髓腔再通。本研 究结果表明，利用骨髓间充质干细胞作为运载丽P-2的工具，其主要是 通过软骨化骨的方式诱导成骨，是治疗节,殳性骨缺损的理想方法。
骨形态发生蛋白-2属于e-转化生长因子(Transforming growth factor-(3, TGF-(3 )超家族成员之一，在胚胎发生和发育，组织与细胞 的增殖分化等方而起着重要作用1, BMP-2的高效诱导成骨活性已被越来 越多的实验证实，天然BMP-2在体内含量极微，半衰期短，难以在体内 维持持续的促成骨效应。随着分子生物学技术的发展，基因治疗应用于 临床已有了可行性。而基因治疗载体的选择最为重要，当今运用最广泛 的就是腺病毒(adenovirus， Ad)载体，针对上面的阐述，为了克服为采 用BMP基因治疗大段骨缺损奠定基础。本发明利用腺病毒表达载体 (Ad-BMP2)介导的BMP2转基因方法来解决BMP-2释放的问题，经过试验证 实被认为是有效的手段。其应用于转基因组织工程骨治疗骨缺损的应 用，用于解决临床上因骨缺损及骨创伤引起的骨修复问题。
其具体技术方案为
一种组织工程骨移植物，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子 细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构 和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料是采用溶胶-絮凝法制 备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干 细胞。
7所述支架材料纳米羟基磷灰石是孔隙直径为100~ 250jam、孔隙率 为90%以上的多孔活性材料，并且所得孔隙为连通孔隙。
所述的种子细胞是取自于骨髓，经分离、扩增经体外传代为第3代 的骨髓间充质干细胞，细胞密度为lxio6~5xl06个/ml。
所述的种子细胞是转染了腺病毒载体的骨髓间充质干细胞，所述腺 病毒载体为El区和E3区缺失的第三代复制缺陷型重组腺病毒载体。
所述腺病毒载体含有人BMP基因。 ，
所述腺病毒载体的BMP基因是人BMP-2。
所述腺病毒载体MOI (转染比率)为100，转染后细胞能够高效表 达BMP基因并分泌大量细胞因子骨形态发生蛋白-2。
本发明所述的一种组织工程骨，包括由骨髓间充质千细胞、含BMP-2 目的基因的&泉病毒、纳米羟基磷灰石通过一定的工序、方法构建的具有 一定空间结构及生物活性的仿生人工骨。为实现上述目的，本发明提供 一种新型组织工程骨的构建方法。
本发明上述的一种新型组织工程骨的构建方法技术方案如下
1. 采用溶胶-絮凝法制备纳米羟基磷灰石(Nano-HA)。
2. 采用Gateway 技术构建了 一种含人BMP-2重组腺病毒载体及其 构建方法，具体参考专利号200810068539. 5.
3. 采用密度梯度离心法联合贴壁法分离、培养、扩增骨髓间充质 干细胞。
4. 釆用负压抽吸法构建细胞支架载体复合物仿生人工骨。 上述构建方法中，采用密度梯度离心法联合贴壁法分离与培养骨髓 间充质干细胞
(1) 3%戊巴比妥钠lmL/kg耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下，用18 号骨髓穿刺针，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液3 4mL。
(2)上述骨髓液加入等量的L-DMEM离心去掉脂肪层，取沉淀，用4mL培养基重新悬浮，轻轻铺于等量Percoll (1. 073 g/ml)分离液上离 心，以细口吸管吸取云雾状细胞悬液层，将所得细胞接种于含10% FBS 的培养液中，放置37 。C、体积分数5。/。的C02培养箱饱和湿度下培养。 孵育48 h后更换培养液，去除RBC、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它 未贴壁的骨髓干细胞。上述构建方法中，所述的纳米羟基磷灰石通过下列的步骤构建A、 Nano-HA人工骨材料粉末制备(1) 将硝酸4丐与磷酸铵的水溶液进行化学合成，加入一定量的氨水， 调整溶液的pH值为8 ~ 13,添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤.(2) 将沉淀物在80 - 120。C干燥，在600 - 800。C温度下烧结2 ~ 3小 时，得到粉末粒径小于IOO腿、与人体骨组织成份相似的纳米级粉末。B、 Nano-HA人工骨的制备(l)在粉末中加入蒸馏水调和成膏状，于木模内造型，得到的坯体 在80-15(TC干燥，在900 130(TC温度下烧结2-4小时，即得到预成 型坯形状的Nano-HA人工骨，倒置显纟敬镜、扫描电镜显示材料孔隙直 径为100 - 250jLim、孔隙率为90%以上的多孔活性材料。 上述构建方法中，所述的仿生人工骨通过以下步骤构建(1 ) Nano-HA置入6孔板中，含10%胎牛血清的画EM培养液浸泡 24小时吸除培液37°C、 5。/。C02培养箱培养24h。(2)把转染细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空 负压抽吸器中抽吸保持负压保持10分钟后，放入37 °C 、 5%C02培养箱 中贴附4小时后緩慢加入1. 5mlDMEM培养液37°C、 5°/丄02培养箱继续培 养2-3d换液一次。 本发明采用密度梯度离心联合贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞， 大大提高了分离的成功率。本发明的细胞因子BMP-2采用腺病毒表达载体(Ad-BMP2)介导的BMP2 转基因方法来解决BMP-2释放的问题，可以最大限度的发挥BMP-2的作用 时间，本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的 骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损。
图1为本发明实施例组织工程骨移植物结构示意图； 图2为本发明实施例Nano-HA人工骨于倒置显凝:镜下(x 400 ); 图3为本发明实施例复合后Nano-HA人工骨扫描电镜下观察(SEM, x 1000 );图4为本发明实施例A组12周时植入物扫描电镜(SEM, x 1000 ); 图5为本发明实施例A组12周X线；其中1.支架材料、2.种子细胞、3.腺病毒载体。
具体实施方式
以下通过实施例来描述本发明，应该指出的是，所列举的实施例 不应理解对发明的限制。如图所示 一种组织工程骨移植物，包括支架材料l和转染了腺病 毒载体3的种子细胞2，所述种子细胞2粘附于所述支架材料1上，构 成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料 l是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA),其上粘附有转 染病毒的骨髓间充质干细胞。 转基因仿生人工骨在动物骨缺损修中的应用1、 动物实验手术操作1. 选用盐酸氯胺酮注射液20 mg/ kg，由耳》彖,争脉注入麻醉。2. 右侧前臂常规脱毛，消毒，手术铺巾。3. 取前臂桡侧中段作2cm纵形切口，暴露桡骨干，在距桡骨近端2. 5cm处用线锯连同骨膜一起锯断桡骨做成2cm的骨缺损动物模型。4. 生理盐水沖洗伤口后按不同的组别分别植入A组Nano-HA十 rBMSC+Ad-BMP-2、 .B组、Nano-HA+rBMSC、 C组单纯Nano-HA,空白对 照组则不填充任何材料，依层次缝合伤口、 D组空白对照组。5. 局部肢体不作内、外固定，伤口不予包扎。6. 麻醉清醒后放入笼内常规喂养，术后三天每天80万单位青霉素 肌注抗炎。观察指标及方法1. 一般情况及大体标本术后观察兔的饮食、活动、伤口反应，4周、8周、12周取材观察植 入材料的表面情况、成骨和炎症反应等。取出标本后观察骨缺损连接情 况、骨端骨痂生长情况。2. X线检查术后4周、8周、12周进行试验肢体的X线摄片检查。3. 生物力学检测各组在4周、8周、12周各时间点分别随机取4只动物处死后，切 取术侧完整桡骨标本，剔净骨膜及软组织后在858 miniBionix力学测 试才几上行三点抗弯试一险。4. 扫描电镜观察处死动物后取出桡骨全段，从各材料组各个时期标本中随机取出2ii个标本，截取骨缺损部位及与材料交界处两端各0.5cm,用3%戊二醛固 定后用利刀从中间剖开，脱水、临界点干燥、喷金镀膜后在扫描电镜 (SEM )下观察骨与材料界面相容性情况及骨缺损修复情况。 结果1. 一般情况及大体标本术后实验动物饮食、活动正常，无伤口感染，术后l周左右伤口一 期愈合，伤口缝线自行脱落，肢体活动正常，无受限及跛行。2. X线表现实验组A组4周时材料部分降解，材料与骨组织融合，骨痂形成； 8周时材料进一步降解，骨质与材料接触界限模糊；12周时材料降解完 毕，髓腔完全再通，塑形完全，骨缺损修复(图31-34); B组、C组骨 缺损修复效果欠佳；D组骨缺损未得到修复。3. 力学分析各时期试验组标本在三点弯曲试验中，测得的弯曲强度数据统计学 分析显示A、 B、 C组各组组内比4支，4周<8周<12周，差异均有统 计学意义(P <0. 05); 4周、8周、12周各组间比4交，A组〉B组〉C 组差异有统计学意义(P < 0. 01 );表明A組材料的成骨能力优于B组 和C组材料，而同一材料植入骨缺损处后随着时间的增长，其力学强度 也随之增强。4. 扫描电镜观察A组4周时材料出现降解，材料与正常骨质间出现间隙，间隙内 有骨痂产生充填；8周材料进一步降解，但材料与正常骨质"融合"， 其间产生大量新生类骨组织；12周时，材料降解完全，骨缺损区被新生 板层状骨组织充填，骨缺损完全修复。B、 C组可见材料吸收欠佳，新生 骨量少。
权利要求
1.一种组织工程骨移植物，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，其特征在于所述的支架材料是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述支架材料纳米羟基磷灰石是孔隙直径为100 250lam、孔隙率为90% 以上的多孔活性材料，并且所得孔隙为连通孔隙。
3. 根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述的种子细胞是取自于骨髓，经分离、扩增经体外传代为第3代的骨 髓间充质干细胞，细胞密度为1 x 106~ 5 x 106个/ml。
4. 根据权利要求1所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述的种子细胞是转染了腺病毒载体的骨髓间充质干细胞，所述腺病毒 载体为El区和E3区缺失的第三代复制缺陷型重组腺病毒载体。
5. 根据权利要求4所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述腺病毒载体含有人BMP基因。
6. 根据权利要求5所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述腺病毒载体的BMP基因是人BMP-2。
7. 根据权利要求5所述的一种组织工程骨移植物，其特征还在于 所述腺病毒载体MOI转染比率为100,转染后细胞能够高效表达BMP基 因并分泌大量细胞因子骨形态发生蛋白-2。
8. —种组织工程骨移植物构建方法，其特征在于支架材料是采 用溶胶-絮凝法制备，细胞支架载体复合物采用负压抽吸制备，Nano-HA制备包括以下步骤A、 Nano-HA人工骨材料粉末制备(1) 将硝酸钩与磷g吏铵的水溶液进行化学合成，加入一定量的氨水， 调整溶液的pH值为8~13，添加分散剂，调整搅拌器速率和搅拌时间， 使其沉淀完全，然后经洗涤、过滤；(2) 将沉淀物在80 ~ 12(TC干燥，在6GQ ~ 8GG。C温度下烧结2 ~ 3小 时，得到4^分末粒径小于100nm、与人体骨组织^/f分相似的纳米级粉末；B、 Nano-HA人工骨的制备(l)在粉末中加入蒸馏水调和成膏状，于木模内造型，得到的坯体 在80 15(TC干燥，在900 130(TC温度下烧结2~4小时，即得到预成 型坯形状的Nano-HA人工骨，倒置显微镜、扫描电镜显示材料孔隙直 径为100~ 250|am、孔隙率为90°/。以上的多孔活性材泮+; 其细胞支架载体复合物采用负压抽吸制备，其步骤如下(1 ) Nano-HA置入6孔板中，含10%胎牛血清的DMEM培养液浸泡 24小时吸除培液37°C、 5。/。C02培养箱培养24h,(2)把转染细胞均匀加入上述预湿处理的支架中，然后置于真空 负压抽吸器中抽吸保持负压，放入37。C孵箱中保持10分钟后，放入 37°C、 5。/。C02培养箱中贴附2小时后緩慢加入1. 5ml醒EM培养液37°C、 5%(]02培养箱继续培养2-3d换液一次。
9.根据权利要求8所述的一种组织工程骨移植物构建方法，其特征 在于骨髓间充质干细胞是采用密度梯度离心法联合贴壁法获得，包括 以下步骤(1) 3°/。戊巴比妥钠lmL/kg耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下，用18 号骨髓穿刺针，从胫骨结节外侧穿刺，抽取骨髓液3 4mL;(2)上述骨髓液加入等量的L-麵EM离心，取沉淀，用4mL培养基重新悬浮，轻轻铺于等量Percoll (1. 073 g/ml)分离液上离心，以细口 吸管吸取云雾状细胞悬液层，将所得细胞接种于含10% FBS的培养液 中，放置37 。C、体积分数5。/。的C02培养箱饱和湿度下培养；孵育"h 后更换培养液，去除RBC、悬浮生长的骨髓造血干细胞及其它未贴壁的 骨髓干细胞。
全文摘要
一种组织工程骨移植物及其构建方法，包括支架材料和转染了腺病毒载体的种子细胞，所述种子细胞粘附于所述支架材料上，构成了具有一定空间结构和生物活性的细胞载体复合物，所述的支架材料是采用溶胶-絮凝法制备的纳米羟基磷灰石(Nano-HA)，其上粘附有转染病毒的骨髓间充质干细胞。本发明所述的一种组织工程骨，包括由骨髓间充质干细胞、含BMP-2目的基因的腺病毒、纳米羟基磷灰石通过一定的工序、方法构建的具有一定空间结构及生物活性的仿生人工骨。本发明所述构建的仿生人工组织工程骨可以用于修复大段骨缺损的骨移植物，在动物实验中已经证明了能很好的修复大段骨缺损。
文档编号A61L27/54GK101564555SQ20091010762
公开日2009年10月28日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者何春耒, 刘建全, 刘黎军, 可 周, 彭亮权, 徐小平, 朱伟民, 李文翠, 欧阳侃, 熊建义, 王大平, 波 胡, 伟 陆 申请人:深圳市第二人民医院