专利名称：山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及山羊支原体肺炎疫苗领域，具体说是一种山羊支原体肺炎二联灭活疫
苗及其制备方法。
背景技术：
山羊支原体肺炎是指由支原体引起的发生于山羊的一种接触性呼吸道传染病，其
临诊特征为高热、咳嗽，胸和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，取急性和慢性经过，发病率
在22 30%，有的高达60 80%，死亡率在15 30%。本病常见于世界各养羊国家和地
区，严重影响世界养羊业生产的发展。在我国，本病流行已久，最早文字记载可追溯到1922
年，尤其随着近年来我国养羊业的迅速发展，该病的流行区域增大，迄今已有甘肃、宁夏、新
疆、青海、四川、贵州、广西、河北、辽宁、江苏、内蒙、江苏、湖南、河南等十余省市报道流行，
病情复杂，危害加重，每年给我国的养羊业生产带来了严重的经济损失。 山羊支原体肺炎的防制面临较大困难，主要原因是其病原学因素复杂。除了我国
流行的优势病原丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体外，目前世界上已报道的本病病原
还包括山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种和丝状支原体丝状亚种大菌落型。
这些病原之间无交叉保护，且各国流行的优势病原不尽相同，加上支原体基因组较小，同一
种支原体也易发生变异而导致抗原差异，因此世界各国一般都根据本地具体流行情况针对
性地研制适合于本地区的灭活疫苗进行免疫预防。 流行于我国的山羊支原体肺炎病原丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体之间缺乏交叉保护，而所致疾病临床上很难区分，且常会混合感染，因此应用单一病原制成的疫苗很难适应我国生产实际，而目前我国还没有可以同时预防这两种病原的二联灭活疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同时预防丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体这
两种病原的二联灭活疫苗及其制备方法，用于山羊支原体肺炎的免疫预防。 本发明的目的是通过下述技术方案来实现的。 —种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，含有丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原以及ISA206油佐剂，所述的山羊支原体肺炎二联灭活疫苗按照下述步骤和方法制备 a制苗用培养基及其制备方法制苗用培养基为改良KM2培养基。
a. 1培养基成分最低要素培养基MEM占总量的50%， 1. 7%水解乳蛋白Hank's缓冲液占总量的35 % ， 25 %酵母浸液占总量的2 % ，健康马血清占总量的10 % ， 1 %醋酸铊溶液占总量的1%，2万IU青霉素占1%，0.4%酚红占总量的1%。 a. 2培养基制备方法将1. 7%水解乳蛋白Hank' s缓冲液、25%酵母浸液、1 %醋酸铊溶液和0. 4%酚红经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入用微孔滤膜滤过除菌的最低要素培养基(MEM)、健康马血清和青霉素，用lmol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7. 4 7. 8，无菌分装，2 『C保存备用。
b增殖支原体的程序 b. 1支原体的增殖将丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体分别接种改良KM2培养基，经3 5天培养，当培养物pH值下降至6. 8 7. 0时，按培养基总量的5%进行3 5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6. 8 7. 0时，收获支原体菌液，测定生长滴度并进行超滤浓縮。 b. 2支原体的浓縮用超滤膜系统将支原体菌液进行浓縮，使丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液浓度均达到6. 0 10. OX 108ccu/ml。
c.支原体灭活的程序 c. 1灭活给已浓縮的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液分别加入浓度40%的甲醛溶液，使菌液中甲醛的浓度达到0. 2%，在37t:下各持续灭活10小时，期间每2 4小时摇振1次，灭活终止，进行灭活检验。 c. 2灭活检验将灭活的支原体菌液进行抽样，各接种改良KM2培养基2支，进行IO倍系列稀释至10—s，置37t:培养10日，均无支原体生长者为灭活完全。
d.疫苗配制程序 采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗。 液相成分丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按体积比1 : l等比例混合后，按抗原总量的1%加入1%硫柳汞溶液。液相成分占疫苗总量的45 50% ;
油相成分ISA206油佐剂。油相成分占疫苗总量的50 55% ;
乳化方法先将ISA 206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循环搅拌至充分混合，在36 38MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)
双相油乳剂灭活苗。
e疫苗的检验 e. 1物理性状检验该疫苗为矿物油双相乳剂型，外观应呈乳白色或淡粉红色略
带粘滞性流体。3000rpm离心15分钟应不分层。用出口内径为1. 2mm的lml吸管，吸取
25°C的疫苗lml ，令其垂直自然流出，记录流出0. 4ml所需时间，应在8秒钟以内。 e.2无菌检验按中华人民共和国兽药典(2005年版)附录15页进行，应无细菌生长。 e. 3安全检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊5只查无丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体，各颈部皮下注射疫苗6ml，观察30日，应无减食、精神沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。 e. 4效力检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊10只查无丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体，每5只1组分为免疫I组和II组，各颈部皮下注射疫苗3ml，另以条件基本与免疫羊相同的山羊10只，每5只1组分为对照I组和II组。接种后30日，免疫I组和对照I组山羊各气管接种绵羊肺炎支原体培养物10ml (5X 108ccu/ml)，观察30日，对照羊全部发病，免疫羊至少保护4只，或对照羊4只发病，免疫羊全部保护为合格。免疫II组和对照II组山羊各气管接种丝状支原体山羊亚种培养物10ml (5X 108ccu/ml)，观察30日，对照羊全部发病，免疫羊至少保护4只，或对照羊4只发病，免疫羊全部保护为合格。
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本发明的优点在于(l)使用了高效的支原体培养基，丝状支原体山羊亚种和绵 羊肺炎支原体在改良KM2培养基中的生长滴度均可达到lX108ccU/ml ;(2)首次将这两种 优势病原联合制备二联疫苗，可同时预防两种病原，避免了用单一病原制备疫苗顾此失彼 的缺点，更适合我国生产实际；(3)该疫苗对不同生理状况和年龄的山羊均安全，适用于不 同品种、各种年龄的山羊。无论养只大小，各颈部皮下注射疫苗3ml，对丝状支原体山羊亚种 和绵羊肺炎支原体引起的山羊支原体肺炎的免疫保护率均可达4/5以上。疫苗一次接种的 有效免疫期为10个月，2 『C下保存期为12个月。
具体实施方式
实施例1、
1制备培养基 2005年3月11日 12日，配制改良KM2培养基42000ml 。将1.7%水解乳蛋白 Hank' s缓冲液14700ml、25%酵母浸液840ml、 1 %醋酸铊溶液420ml和0. 4%酚红420ml， 混合后经IO磅20分钟高压灭菌，冷却后加入用0. 22ym微孔滤膜滤过除菌的最低要素培 养基MEM21000ml、健康马血清4200ml、2万IU青霉素420ml，用lmol/L氢氧化钠溶液调整 pH值至pH值为7. 8， 2t:保存备用。
2增殖支原体 2. 1支原体的增殖2005年3月12日将丝状支原体山羊亚种M87-1菌种，接种改 良KM2培养基5ml，经3天培养，培养物pH值下降至7. 0，按培养基总量的5%进行3次连续 扩大培养，培养物pH值下降至7. 0时，收获丝状支原体山羊亚种M87-l菌液18000ml，测定 其生长滴度为6. 7X 107ccu/ml。 2005年3月12日将绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌种，接种改良KM2培养基10ml，经3 天培养，培养物PH值下降至7. 0。按培养基总量的5%进行3次连续扩大培养，培养物pH值 下降至7. 0时，收获绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌液18000ml，测定其生长滴度为lX108ccu/ ml。 2. 2支原体的浓縮用超滤膜系统(PALL Centrasette 5)将丝状支原体山羊亚种 M87-l菌液进行10倍浓縮，使菌液浓度为6. 7X 108ccu/ml ;将绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌 液进行10倍浓縮，使菌液浓度为10. OX 108ccu/ml。
3灭活支原体 3. 1灭活分别向浓縮的丝状支原体山羊亚种M87-l和绵羊肺炎支原体MoGH3-3 菌液加入浓度40%的甲醛溶液使其浓度达到0. 2%，在37t:下各持续灭活10小时，期间每 2小时摇振1次。 3. 2灭活检验灭活时间到，将灭活的丝状支原体山羊亚种M87-1和绵羊肺炎支原 体MoGH3-3菌液各抽样0. 2ml，各接种改良KM2培养基2支，每支0. lml，进行10倍系列稀 释至10—5，置371:培养10日，均无支原体生长。
4疫苗配制 采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗。 液相成分丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按1 : 1比例混合共 3600ml，按抗原总量的1%加入1%硫柳汞溶液36ml，共3636ml，占总量的50%。
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油相成分ISA206油佐剂3636ml，占总量的50%。 乳化方法先将ISA 206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循环搅拌至 充分混合，在36MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油 乳剂灭活苗，批号050502，批量6500ml。
5疫苗检验 5. 1物理性状检验该疫苗为矿物油双相乳剂型，外观呈乳白色。3000rpm离心15 分钟不分层。用出口内径为1.2mm的1ml吸管，吸取25t:的疫苗lml，令其垂直自然流出， 流出0. 4ml所需时间为3秒。 5.2无菌检验按中华人民共和国兽药典(2005年版)附录15页进行，均无细菌 生长。 5.3安全检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊5只(查无丝状支原体 山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体)，各颈部皮下注射疫苗6ml，观察30日，无减食、精神 沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。 5.4效力检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊10只(查无丝状支原 体山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体)，每5只1组分为免疫I组和II组，各颈部皮下 注射疫苗3ml，另以条件基本与免疫羊相同的山羊10只，每5只1组分为对照I组和II 组。接种后30日，免疫I组和对照I组山羊各气管接种绵羊肺炎支原体MoGH3-3培养物 10ml(5Xl()8ccu/ml)，观察30日。结果对照羊全部(5/5)发病，免疫羊4/5保护。免疫II 组和对照II组山羊各气管接种丝状支原体山羊亚种M87-1培养物10ml (5X 108ccu/ml)，观 察30日。结果对照羊4/5发病，免疫羊全部(5/5)保护。
实施例2
1制备培养基 2005年4月1日 2日，配制改良KM2培养基42000ml。将1.7%水解乳蛋白 Hank' s缓冲液14700ml ， 25%酵母浸液840ml ， 1 %醋酸铊溶液420ml ， 0. 4%酚红420ml ，混 合后经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入用0. 22 i！ m微孔滤膜滤过除菌的最低要素培养 基(MEM)21000ml，健康马血清4200ml，2万IU青霉素420ml，用lmol/L氢氧化钠溶液调整 pH值至pH值为7. 4，『C保存备用。
2增殖支原体 2. 1支原体的增殖2005年4月10日将丝状支原体山羊亚种M87-l菌种，接种改 良KM2培养基10ml，经5天培养，培养物pH值下降至6. 8。按培养基总量的5%进行3次连 续扩大培养，培养物pH值下降至6. 8时，收获丝状支原体山羊亚种M87-l菌液20000ml，测 定其生长滴度为lX108ccu/ml。 2005年4月10日将绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌种，接种改良KM2培养基10ml，经5 天培养，培养物PH值下降至6. 8。按培养基总量的5%进行3次连续扩大培养，培养物pH值 下降至6.8时，收获绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌液20000ml，测定其生长滴度为lX108ccu/ ml。 2. 2支原体的浓縮用超滤膜系统(PALL Centrasette 5)将丝状支原体山羊亚种 M87-l菌液进行6倍浓縮，使菌液浓度为6. 0 X 108ccu/ml ;将绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌液 进行6倍浓縮，使菌液浓度为6. 0 X 108ccu/ml 。
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3灭活支原体 3. 1灭活分别向浓縮的丝状支原体山羊亚种M87-l和绵羊肺炎支原体MoGH3-3 菌液加入浓度40%的甲醛溶液，使其浓度达到0. 2% ，在37t:下各持续灭活10小时，期间每 4小时摇振1次。 3. 2灭活检验灭活时间到，将灭活的丝状支原体山羊亚种M87-1和绵羊肺炎支原 体MoGH3-3菌液各抽样0. 2ml，各接种改良KM2培养基2支，每支0. lml，进行10倍系列稀 释至10-5，置37t:培养10日，均无支原体生长。
4疫苗配制 采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗。 液相成分丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按1 : l等比例混合 共4000ml，按抗原总量的1%加入1X硫柳汞溶液40ml，共4040ml，占总量的45%。
油相成分ISA206油佐剂4940ml，占总量的55%。 乳化方法先将206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循环搅拌至充分 混合，在38MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂 灭活苗，批号050603，批量8000ml 。
5疫苗检验 5. 1物理性状检验该疫苗外观呈略带粉红的乳白色乳剂。3000rpm离心15分钟 没有分层。用出口内径为1.2mm的lml吸管，吸取25t:的疫苗lml，令其垂直自然流出，流 出O. 4ml所需时间为4秒。 5.2无菌检验按中华人民共和国兽药典(2005年版)附录15页进行，均无细菌 生长。 5.3安全检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊5只(查无丝状支原体 山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体)，各颈部皮下注射疫苗6ml，观察30日，无减食、精神 沉郁、体温反应、注射局部炎症等不良反应，且全部健活。 5. 4效力检验用购自非疫区的12月龄左右健康易感山羊10只查无丝状支原 体山羊亚种和绵羊肺炎支原体血清抗体，每5只1组分为免疫I组和II组，各颈部皮下 注射疫苗3ml，另以条件基本与免疫羊相同的山羊10只，每5只1组分为对照I组和II 组。接种后30日，免疫I组和对照I组山羊各气管接种绵羊肺炎支原体MoGH3-3培养物 10ml(5Xl()8ccu/ml)，观察30日。结果对照羊4/5发病，免疫羊5/5保护。免疫II组和对 照II组山羊各气管接种丝状支原体山羊亚种M87-1培养物10ml (5Xl()8ccu/ml)，观察30 日。结果对照羊5/5发病，免疫羊4/5保护。
权利要求
一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗，其特征在于含有丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原以及ISA206油佐剂，采用以下方法和步骤制备而成a制苗用培养基及其制备方法制苗用培养基为改良KM2培养基；a.1培养基成分最低要素培养基MEM占总量的50％，1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液占总量的35％，25％酵母浸液占总量的2％，健康马血清占总量的10％，1％醋酸铊溶液占总量的1％，2万IU青霉素占1％，0.4％酚红占总量的1％；a.2培养基制备方法将1.7％水解乳蛋白Hank’s缓冲液、25％酵母浸液、1％醋酸铊溶液和0.4％酚红经10磅20分钟高压灭菌，冷却后加入滤过除菌的最低要素培养基MEM、健康马血清和青霉素，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4～7.8，无菌分装，2～8℃保存备用；b增殖支原体的程序b.1支原体的增殖将丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体分别接种改良KM2培养基，经3～5天培养，当培养物pH值下降至6.8～7.0时，按培养基总量的5％进行3～5次连续扩大培养，当培养物pH值下降至6.8～7.0时，收获支原体菌液，测定生长滴度并进行超滤浓缩；b.2支原体的浓缩用超滤膜系统将支原体菌液进行浓缩，使丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液浓度均达到6.0～10.0×108ccu/ml；c.支原体灭活的程序c.1灭活给已浓缩的丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体菌液分别加入浓度40％的甲醛溶液，使菌液中甲醛的浓度达到0.2％，在37℃下各持续灭活10小时，期间每2～4小时摇振1次，灭活终止，进行灭活检验；c.2灭活检验将灭活的支原体菌液进行抽样，各接种改良KM2培养基2支，进行10倍系列稀释至10-5，置37℃培养10日，均无支原体生长者为灭活完全；d.疫苗配制程序采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗；液相成分丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按体积比1∶1等比例混合后，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液；液相成分占疫苗总量的45～50％；油相成分ISA206油佐剂，油相成分占疫苗总量的50～55％；乳化方法先将206油佐剂进料到均质机内，再将液相成分进料，循环搅拌至充分混合，在36～38MPa压力下通过均质机，乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂灭活苗。
全文摘要
一种山羊支原体肺炎二联灭活疫苗及其制备方法，采用以下方法和步骤制备而成a制苗用培养基及其制备方法制苗用培养基为改良KM2培养基；b增殖支原体的程序；c支原体灭活的程序；d疫苗配制程序采用一步乳化法，制成双相油乳剂疫苗；液相成分占疫苗总量的45～50％，丝状支原体山羊亚种和绵羊肺炎支原体灭活抗原按1∶1混合后，按抗原总量的1％加入1％硫柳汞溶液；油相成分占疫苗总量的50～55％，ISA206油佐剂；乳化成略带粘滞性的水包油包水型(w/o/w)双相油乳剂灭活苗。本发明首次将这两种优势病原联合制备二联疫苗，可同时预防两种病原，避免了用单一病原制备疫苗顾此失彼的缺点，更适合我国生产实际。
文档编号A61P11/00GK101721694SQ20091011757
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月7日 优先权日2009年11月7日
发明者储岳峰, 贺英, 赵萍, 逯忠新, 高鹏程 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所