专利名称：蚯蚓纤溶酶抗肝纤维化的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蚯顿纤溶酶(即蚓激酶)抗肝纤维化的应用，属于生物技术领域。
二背景技术：
1.肝纤维化是一切慢性肝病的共同的病理基础，是发展到肝硬化必经的中 心环节。肝纤维化是肝细胞的细胞外基质(主要为胶原蛋白、其次为结构糖蛋 白、糖胺多糖和弹性蛋白)的分泌大于降解，因而造成细胞外基质过度沉积的 病理过程。
肝纤维化的病因大致可分为感染性(慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎、 血吸虫病等)，化学代谢缺陷(慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病)，先天性 代谢缺陷以及自身免疫性肝炎等。
单就乙型肝炎而言，全世界乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者超过2.8亿；我 国是乙型肝炎高流行区，有1.3亿人口是HBsAg携带者，慢性乙型肝炎患者超过3000 万，其中25-40%的患者可发展为肝硬化或肝癌。每年我国死于乙肝后肝硬化、肝癌 患者达40万人。肝穿刺标本分析表明，轻型慢性肝炎患者发生肝纤维化者占62.6%， 中度、重度慢性肝炎患者100%出现肝纤维化。
近年的基础和临床研究表明，肝纤维化尤其早期肝纤维化是一种可逆的病理过 程，除了有效的病因治疗，如果能直接抑制肝细胞外基质的合成和/或促进其降 解，则已经形成的肝纤维化甚至早期肝硬化也是可以逆转的。因此，抗纤维化治 疗已成为国内外肝病专家关注的热点。
彻底治疗慢性肝炎的原发病不能完全代替抗纤维化治疗，如同有的患者HBeAg 已转阴，但肝纤维化仍在进展。抗纤维化药物的作用分为抑制胶原蛋白的合成、分泌 与沉积以及促进细胞外已经沉积的胶原蛋白的降解。因此抗纤维化治疗主要针对两个 方面进行(1)抑制肝星状细胞活化，抑制肝星状细胞的胶原合成，促进肝星状细 胞凋亡；(2)抑制细胞外基质(extracellularmatrix, ECM)合成、增加细胞外基质降 解；抑制基质金属蛋白酶组织抑制物(tissue inhibitor metalloproteinase-l TIMP-1)的 合成、提高基质金属蛋白酶(matrix metal-loproteinase， MMPs)活性。对于慢性肝纤维化的治疗尚无理想药物，目前主要用干扰素-Y、甘草甜素、秋水 仙碱、中成药安络化纤丸。前者属于抗病毒治疗，前两种药肌肉或静脉注射，6个月 为一疗程；秋水仙碱口服有疗效但毒副作用较大、需连服一年；安络化纤丸日服 12-16g、有一定疗效、有一定副作用。
我们前一阶段用多组分的蚯蚓粗提物-"地龙2号"进行了抗肝纤维化试验Wistar 雄性大鼠每周2次皮下注射C-C14制造肝纤维化动物模型，阳性对照组以秋水仙碱灌 胃，试验组用不同剂量"地龙2号"灌胃、每日l次，试验共8周。试验结束时取大鼠 肝脏、作组织切片、HE染色、显微镜观察。结果显示"地龙2号"灌胃产生显著的 抗肝纤维化效果，优于秋水仙碱的治疗效果，而且未见明显毒付作用。通过免疫组化 和RT-PCR方法，对各组大鼠肝组织中基质金属蛋白酶(MMP-13)与基质金属蛋白 酶组织抑制物(TIMP-1)的蛋白含量以及mRNA的表达进行分析"地龙2号"治疗组 MMP-13的表达明显升高，TIMP-1的表达显著下降，MMP-13 / TIMP-1的mRNA 表达的比值也显著下降。同时，试验组肝星状细胞的活化受到明显的抑制。由此， 我们曾经推测，可能是"地龙2号"中含量较高的两种蛋白酶一蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤 溶酶(即衂激酶)口服产生的效果；同时推测，与细胞外基质的主要成分-胶原蛋白 对应的蚯蚓胶原酶、可能是抗肝纤维化的最主要成分。这当然只是未经验证的推测， 它无法确定哪一种蛋白酶或者两种活性物质怎样的配比才真正有效，更无法确定抗 肝纤维化新药的配方与含量。本发明通过大量的后续系列实验结果，推翻了前一阶段 的推测。
2.人体胶原酶(MMPs)以无活性的酶原形式分泌，纤溶酶是激活人体胶原酶原
的重要因子，同时又是血清蛋白酶级联反应通路与MMPs介导的通路之间的交换蛋
白酶，它能有效激活MMP-1和MMP-3 (Murphy G，Stanton H，Co丽ll S，et al.，
Mechanisms for pro matrix metalloproteinase Activation. APMIS， 1999， 107(l):38-44.)。
己知蚯蚓纤溶酶口服可进入血流并保持纤溶酶活性，已作为口服溶血栓药用于临床。 但是它能否水解纤维化肝脏的细胞外基质(ECM)或/和激活MMPs的酶原、从而加 速肝脏胶原蛋白的降解？尚无这方面的报道。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种毒副作用低、疗效显著的抗肝纤维化新药或保
肝保健食品。在前一阶段"地龙2号"抗肝纤维化试验的基础上，通过进一步分离、 提纯、测定以及动物试验，阐明多组分的地龙提取物-"地龙2号"中，真正有效的 抗肝纤维化成分以及有效的口服剂量。 技术方案
蚯虫引纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。口服有效剂量为 1000-3000尿激酶单位uku/人.日。所述蚯蚓纤溶酶包括提纯的蚯蚓纤溶酶、不含 蚯蚓胶原酶的蚯蚓纤溶酶的提取物、含蚯蚓纤溶酶的多组分的蚯蚓粗提物、蚯蚓冻干 粉、蚯顿低温干燥粉或含蚯蚓纤溶酶的复方制剂。
有益效果多组分的"地龙2号"为原料，分别提取两种含量较高的活性物质一虹蚓 胶原酶、蚯蚓纤溶酶，分别在体外和动物体内进行检测和研究
① 胶原蛋白(I型为主)是肝纤维化-肝硬化肝脏的细胞外基质的最主要成分。 分别提取蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤溶酶，在体外检测它们水解胶原蛋白的活性。
② 基质金属蛋白酶是细胞外基质降解过程中最重要的一组蛋白酶，胶原酶是其 家族的主要成员之一。这组蛋白酶通过降解细胞外基质的主要成份一胶原蛋白，对抑 制肝纤维化的发生、发展起着重要作用。已知蚯蚓胶原酶至少有3个同功酶、分子量 在92KD左右，它们可特异性地降解胶原蛋白，但是口服能否进入血流并在肝脏发挥其 生物活性？最直接、最可靠的验证方法是提取蚯蚓胶原酶、给肝纤维化病变过程中 的大鼠灌胃，比较观察它对肝纤维化进程的影响。
③ 已知赤子爱胜蚓的纤溶酶(蚓激酶)至少有6个同功酶，口服有15%左右可进 入血流并保持生物活性，可直接、间接降解血栓的主要成份-纤维蛋白，已用于血栓病 的临床治疗。但是它们能否直接、间接降解肝细胞外基质的胶原蛋白或/和激活肝脏 胶原蛋白酶(MMPs)的酶原？最直接、最可靠的验证方法依然是提取蚯蚓纤溶酶、 给肝纤维化病变过程中的大鼠灌胃，比较观察它对肝纤维化进程的影响。
将前一阶段的试验材料一 "地龙2号"经S印hadex G75凝胶层析，分离胶 原酶组分和纤溶酶组分，分别在胶原蛋白平板、(牛血)纤维蛋白平板测定各组分的 活性和含量；同时分别测定目前的试验材料一蚯蚓胶原酶、蚯蚓纤溶酶的活性，依据 前后数批抗肝纤维化动物试验的结果，确定抗肝纤维化的有效剂量范围。
我们曾经推测，可能是"地龙2号"中含量较高的两种蛋白酶一蚯虫引胶原酶、蚯 蚓纤溶酶(即蚓激酶)口服产生的效果；理论上推测，与细胞外基质的主要成分-胶原蛋白对应的蚯蚓胶原酶应该是抗肝纤维化的最主要成分。这些当然只是未经验证的 推断，基于推断也无法确定哪一种蛋白酶或者两种活性物质怎样的配比才真正有效， 更无法确定抗肝纤维化新药的配方与含量。本发明通过大量的后续系列实验，取得了 意想不到的效果，推翻了前面的理论推测。试验结果表明(1)在体外，蚯蚓纤溶酶(蚓激酶)可以降解胶原蛋白，而且比蚯蚓胶原酶和胶原酶 标准品(Sigma I型)表现更高的生物活性。用蚯蚓纤溶酶灌胃，可显著减轻肝纤维 化试验大鼠的症状，显著减轻肝纤维化增生程度，而且无明显毒副作用。该酶多年来 被用作溶血栓药(博洛克、普恩福)以及改善微循环的保健食品(龙舒泰精制地龙胶 囊)，实践证明它口服安全、无明显毒副作用，因此它更可能成为一种理想的抗肝纤 维化新药或保肝保健食品。(2) 蚯弼l胶原酶，口服抗大鼠肝纤维化效果不显著，在抗肝纤维化新药或保肝保健食 品生产过程中可将该组分分离出来另作它用。(3) 蚯顿纤溶酶口服抗肝纤维化的有效剂量为1000-3000uku/人.日。 四
图l.地龙2号及其胶原酶组分和纤溶酶组分的蛋白酶活性左图(L)为(牛血)纤维蛋白平板，右图(R)为胶原蛋白(Sigma I型)平板；酶液10u l注入小孔、3fC反应8h.，考马斯亮蓝染色、7%冰乙酸脱色。L-1.地龙2号可水解纤维蛋白；L-2.地龙2号的胶原酶组分不能水解纤维蛋白； L-3.地龙2号的纤溶酶组分可水解纤维蛋白。R-l.地龙2号可水解胶原蛋白；R-2.地龙2号的胶原酶组分可水解胶原蛋白；R-3.地龙2号的纤维蛋白组分具有较高的水解纤维蛋白的活性。 图2.在胶原蛋白平板测定蚯蚓胶原酶和纤溶酶的活性l一3 :胶原酶标准品(Sigma I型)1000u/ml 、 2000u/ml、 4000u/ml;4一6 :蚯蚓纤溶酶的胶原酶活性^1500u/mg;7—12 :地龙2号的胶原酶组分和蚯顿胶原酶， 后者的胶原酶活性在450u/mg左右。 图3.在纤维蛋白平板测定蚯蚓胶原酶和纤溶酶的活性l一3 :尿、激酶标准品50uku/ml、 100uku/ml、 200uku/ml;4 :胶原酶标准品(Sigma I型、2000u/ml)不能溶解(牛血)纤维蛋白；5_6 :蚯蚓胶原酶也不能溶解(牛血)纤维蛋白；7—12 :地龙2号的纤溶酶组分和蚯蚓纤溶酶， 后者的纤溶活性在200uku/mg左右。 图4.抗肝纤维化试验大鼠肝组织切片 HE染色X2001. 正常对照组肝细胞排列整齐，无变性坏死，无纤维结缔组织增生。2. 模型组肝细胞排列紊乱，部分肝细胞呈嗜酸性变，纤维结缔组织增生明显，有假小叶形成，纤维间隔宽，局部尚见炎性细胞浸润。3. 秋水仙碱组肝细胞排列尚整齐，见细胞水肿和脂肪变性，纤维结缔组织增生并形成间隔，但间隔较细。4. 蚯顿纤溶酶组肝细胞排列整齐，见轻度脂肪变性，纤维结缔组织增生不甚明显。6五具体实施方式
1.测定"地龙2号"及其中纤溶酶与胶原酶组分的活性称取"地龙2号"溶于0.01mol/L pH 7.2 Tris-HCl成10%溶液，Sephadex G75 凝胶层析柱用相同Tris-HCl缓冲液平衡，分批上样，相同缓冲液洗脱，分别收集、合 并洗脱i峰、洗脱n峰，分别计量洗脱液体积，作如下测定① 参照蚓激酶生物活性测定方法(郝苏丽，沈佳等，蚓激酶生物活性测定方法的研究，中国药事[J].1996,10(6):403-405)制备纤维蛋白-琼脂糖平板。平板置室温l 小时，打孔、每孔点样1(HU 、 37QC孵育8 h ,小心取出平板，考马斯亮蓝染色，7%冰乙酸脱色,纤维蛋白被降解的部位不被着色。实验证明多组分的"地龙2号"溶液、可以溶解(牛血)纤维蛋白；"地龙2号" 溶液通过凝胶层析，蚯蚓胶原酶(MW92KD左右)所在的洗脱I峰不能溶解纤维蛋白； 蚯蚓纤溶酶(MW25-45KD)所在的洗脱II峰仍溶解纤维蛋白。(图1-L)进而用国际通用的测定尿激酶的纤维蛋白平板法、以尿激酶标准品倍比稀释为参 照，按下面(五-2-④)的方法分别测定两个组分的纤溶酶活性、计算"地龙2号"中纤 溶酶含量。(图3)② 参照蚓激酶生物活性测定法制备胶原蛋白平板。先将胶原蛋白(Sigmal型) 溶于少量0.5mol/LHAC，待水浴溶化的琼脂糖凝固前、两者按比例混合均匀并浇平 板。平板含胶原蛋白0.25%、琼脂糖1%，置室温1小时，打孔、每孔点样10^1 、 37^孵育8小时，小心取出胶原蛋白平板、考马斯亮蓝染色、7%冰乙酸脱 色，胶原蛋白被降解的部位不被着色。实验证明，多组分的"地龙2号"溶液、可以溶解胶原蛋白；"地龙2号"溶液通 过凝胶层析，蚯蚓胶原酶所在的洗脱I峰能溶解胶原蛋白；蚯蚓纤溶酶所在的洗脱II 峰也能溶解胶原蛋白而且溶解圈大于前者，尽管II峰在280nm的OD值比I峰低。(图1. R-3 )进而在胶原蛋白平板、以胶原酶标准品(Sigma I型)倍比稀释为参照，按下面 (五-2-③)的方法分别测定两个组分的胶原酶活性、计算"地龙2号"中胶原酶的含 量。(图2)2. 提取蚯蚓纤溶酶、蚯蚓胶原酶并测定蛋白酶活性①制备蚯蚓纤溶酶"地龙2号，，溶于0.01mol/L pH7.2 Tris-HCl成10%溶 液，通过SephadexG75凝胶层析，分别收集、合并洗脱I峰、II峰。洗脱II峰过 DEAE-CelMose柱0.01mol/LpH7.2 Tris-HCl洗涤，0.3-0.6mol/LNaCl溶液梯度洗脱，合并纤溶酶活性洗脱峰，透析、浓縮、冻干，得蚯蚓纤溶酶。② 制备蚯蚓胶原酶称取I型胶原蛋白(粉末)加入0.01mol/L pH7.2 Tris-HCl 成10%溶液，缓缓搅拌2h,使充分溶胀(不会溶解)，1500g、 4QC、离心15分、弃上 清，加少许Tris-HCl缓冲液搅拌、得胶原蛋白悬浮液。加入上一项(四-2-①)制备 的洗脱I峰，4GC搅拌吸附0.5h ， 1500g、 4QC、离心、弃上清；加Tris-HCl缓冲液 40c搅拌、洗涤沉淀，离心收集沉淀。加入沉淀物体积2倍的lmol/LNaCl、 4QC搅拌 15分钟、解吸附；4QC、 4000g、离心20分、收集上清，透析、浓縮、冻干，得蚯蚓 胶原酶。③ 测定蚯蚓纤溶酶、蚯蚓胶原酶的胶原酶活性用上述(四-l-②)的方法制备 胶原蛋白平板，打孔，以I型胶原酶标准品(Sigma 125u/mg)倍比稀释为参照，每 孔点样l(HU , 37^孵育8小时。考马斯亮蓝染色、7%冰醋酸脱色，测量水解圈直 径，根据标准品效价的对数与水解圈面积(两个垂直直径的乘积)的回归方程，计算 待测样品的胶原酶效价。测定结果显示蚯蚓胶原酶冻干粉的胶原酶效价， 一般在450u/mg左右，远高于 Sigma标准品的125u/mg与200u/mg，比精制前"地龙2号"的胶原酶效价提高5倍 以上。蚯蚓纤溶酶冻干粉的胶原酶效价，普遍高达1500u/mg或以上， 一般为同批制 备的蚯蚓胶溶酶效价的4倍左右。(图2) 测定蚯躬l纤溶酶、胶原酶的纤溶酶活性利用国际通用的测定尿激酶的纤维 蛋白平板法，测定两种蛋白酶的纤溶活性(牛血)纤维蛋白原溶解于0.1mol/L pH7.2 PBS，加入适量溶于PBS的凝血酶，迅速混匀，浇注平板，纤维蛋白的终末浓度0.5%。 待充分凝固后，以尿激酶标准品倍比稀释为参照，在平板表面点样，每样10p 1 ， 37QC 孵育8小时，测量尿激酶标准品与待测样品的溶解窝直径。根据标准品效价的对数与 溶解窝面积(两个垂直直径的乘积)的回归方程，计算待测样品的纤溶酶效价。测定结果显示尿激酶标准品与蚯蚓纤溶酶均在纤维蛋白平板形成溶解窝。蚯蚓 纤溶酶的纤溶活性稳定在200uku/mg左右(尿激酶单位、相当蚓激酶单位20万u/mg)， 比精制前"地龙2号"的纤溶酶效价提高10倍左右。胶原酶标准品(Sigmal型)和 蚯顿胶原酶在纤维蛋白平板均不能形成溶解窝，即两者都不具备降解纤维蛋白的活 性。(图3 )3.抑制大鼠实验性肝纤维化试验 (1)材料与方法①材料i雄性Wistar大鼠体重160士10g、共38只。ii 75% CCU-花生油混合液，40。/。CCl4-花生油混合液。iii秋水仙碱(昆明制药有限公司)、lmg/片、单蒸水配置。iv蚯蚓胶原酶，按上述(五-2-②)方法制备、440u/mg，临用时单蒸水配制。v蚯顿纤溶酶，按上述(五-2-①)方法制备、185uku/mg，临用时单蒸水配置。② 试验动物分组i模型组7只，首次背部皮下注射75。/。CC14-花生油混合液0.5ml/100g、以后注射 40% CC14-花生油0.2ml/100g、 2次/周；每日单蒸水灌胃10ml/Kg、 l次/日、 共8周。ii阴性对照组7只，背部皮下注射花生油，每日单蒸水灌胃，剂量、方法同模型组， 共8周。iii阳性对照组8只，秋水仙碱灌胃0.1mg/kg、 l次/日，其余同模型组。 iv蚯蚓胶原酶组8只，蚯蚓胶原酶灌胃2000u/Kg、 l次/日，其余同模型组。 v蚯躬l纤溶酶组8只，蚯蚓纤溶酶灌胃200uku/Kg、 l次/日，其余同模型组。③ 肝脏组织切片各组试验大鼠于第8周末处死，取相同部位的肝脏组织块、10%中性缓冲福 尔马林液中固定，随机编号，送医院病理科石蜡包埋、切片、HE染色、显微镜观察 并进行肝纤维化程度分级。
肝脏纤维化程度判断-无成纤维细胞增生；+小叶内偶见细纤维间隔、汇管区扩大无隔；++小 叶内易见细纤维间隔、汇管区扩大有隔；+++假小叶形成、间隔致密较宽；++++ 假小叶明显、纤维间隔较宽、大于半个高倍视野。统计资料用秩和检验。 (2)试验结果① 动物体况i阴性对照组大鼠生长发育良好，活泼好动。ii模型组大鼠生长发育迟缓，消瘦，皮毛松弛、毛色黯淡，精神差、活动少。 iii蚯顿纤溶酶组大鼠健康状况相对良好，皮毛柔顺有光泽，灌胃时动物表现较凶 猛。iv阳性组(秋水仙碱组)界于模型组与蚯蚓纤溶酶组之间。 V蚯蚓胶原酶组界于模型组与秋水仙碱组之间。② 大体标本观察模型组肝脏表面光亮度下降，颜色灰暗，边缘不规则，质脆，表面可见粗细不 等的结节。蚯蚓纤溶酶组肝组织红润，呈花斑状，柔软，未见结节。 阳性组(秋水仙碱组)界于模型组与蚯蚓纤溶酶组之间。 蚯蚓胶原酶组界于模型组与秋水仙碱组之间。 ③显微镜检査(表l、图4)1. 正常对照组肝细胞排列整齐，无变性坏死，无纤维结缔组织增生。2. 模型组肝细胞排列紊乱，部分肝细胞呈嗜酸性变，纤维结缔组织增生明显，有假小叶形成，纤维间隔宽，局部尚见炎性细胞浸润。3. 秋水仙碱组肝细胞排列尚整齐，见细胞水肿和脂肪变性， 纤维结缔组织增生并形成间隔，但间隔较细。4. 蚯弼l纤溶酶组肝细胞排列整齐，见轻度脂肪变性，纤维结缔组织增生不甚明显。5. 蚯蚓胶原酶组肝纤维化病变程度介于模型组与秋水仙碱组之间。 表l各组大鼠肝纤维化增生程度的分级肝纤维化增生程度分级组 另u齐U 量例数_+++阴性对照组花生油皮下注射 共8周770000模型组CC14-花生油皮下注射 共8周700232阳性对照aCC14-花生油皮下注射 灌秋水仙碱0.1mg/Kg/d802231蚯蚓胶原酶bCC14-花生油皮下注射 灌胶原酶2000u./Kg/d801232蚯弼l纤溶酶eCC14-花生油皮下注射 灌纤溶酶250uku/Kg/d.813310a.与模型组相比p<0. 05 ; b.与模型组相比p>0. 05 ;c.与模型组相比p〈0.01 ，与阳性对照组相比p〈0.05。 (3)试验小结① 蚯蝴纤溶酶口服可显著减轻实验性肝纤维化动物的症状，有效抑制肝脏纤维结缔组织增生，效果比秋水仙碱组更显著；② 蚯顿纤溶酶口服对试验动物未产生明显毒副作用；③ 在大鼠蚯蚓纤溶酶灌胃剂量200uku/kg左右(相当1920uku/人.日)产生上述较理想的抗肝纤维化效果； 口服蚯弼l胶原酶抗肝纤维化效果不显著。
权利要求
1、蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。
2、 根据权利要求1所述蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保健食品中的应用，其特征在于，口服有效剂量为1000-3000尿激酶单位uku/人.日。
3、 权利要求1或2所述蚯蚓纤溶酶包括提纯的蚯蚓纤溶酶、不含蚯蚓胶原酶的蚯蚓纤溶酶的提取物、含蚯蚓纤溶酶的多组分的蚯蚓粗提物、蚯蚓冻干粉、蚯蚓低温干燥粉或含蚯蚓纤溶酶的复方制剂。
全文摘要
本发明涉及蚯蚓纤溶酶在制备抗肝纤维化药品或保肝保健食品中的应用。属于生物技术领域。蚯蚓纤溶酶口服抗肝纤维化的有效剂量为1000-3000尿激酶单位/人.日。试验证明，蚯蚓胶原酶可降解胶原蛋白但它不能降解(牛血)纤维蛋白；蚯蚓纤溶酶可降解(牛血)纤维蛋白，更可降解胶原蛋白，活性高于蚯蚓胶原酶与胶原酶标准品(Sigma I型)。在大鼠进行的抗肝纤维化实验证明，口服蚯蚓纤溶酶抗肝纤维化效果显著而且无明显毒副作用，但口服蚯蚓胶原酶抗肝纤维化效果不显著。
文档编号A61K38/48GK101628113SQ20091018433
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月18日 优先权日2009年8月18日
发明者张晓蓉, 张治国, 连桂芳 申请人:南京农业大学