专利名称：覆盆子提取物和从中分离得到的覆盆子素及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，是从掌叶覆盆子(Rubus chingii Hu)中提取的覆盆子提取物及从中分离得到的覆盆子素以及它们在制备治疗和预防慢性肾炎、肾阳虚或骨质疏松药物中的应用。
背景技术：
覆盆子(Fructus rubi)为蔷薇科悬钩子属植物掌叶覆盆子(Rubus chingii Hu)的干燥近成熟果实。甘、酸，温。归肾、膀胱经。益肾，固精，缩尿。用于肾虚遗尿，小便频数，阳痿早泄，遗精滑精等症。覆盆子在我国资源丰富，主要分布于浙江、江苏、安徽、江西、福建、广西等地，在《中国药典》已收载。近年来，国内外对覆盆子已有一定研究，向德军报道，覆盆子提取物具有一定温肾助阳作用(广东药学院学报2002.18(3)217-218)，但未提及其活性成分。到目前为止，也未见覆盆子提取物具有防治慢性肾炎、肾阳虚或骨质疏松的报道。
发明内容
本发明提供一种具有防治慢性肾炎、骨质疏松活性的覆盆子提取物及从覆盆子提取物中分离得到的新化合物-覆盆子素。覆盆子素的化学结构式为
本发明研究表明，覆盆子素为覆盆子提取物的活性成分，具有防治慢性肾炎、骨质疏松和肾阳虚的活性。
本发明覆盆子提取物及覆盆子素的制备方法如下 1.制备覆盆子提取物 将掌叶覆盆子干燥果实用0-95％乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取，优选用50-80％乙醇水溶液提取，最佳为70％乙醇水溶液，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得覆盆子提取物； 2.制备覆盆子素粗制品 将上述覆盆子提取物用水稀释后依次用石油醚、二氯甲烷萃取，弃萃取液，然后用水饱和正丁醇萃取，将正丁醇萃取液减压浓缩，得覆盆子素粗制品； 3.分离提取覆盆子素 将上述覆盆子素粗制品用水混悬，上大孔树脂D101，依次分别用水、30％、60％和95％乙醇水溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩成浸膏状并用甲醇溶解，用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司)拌样，上硅胶H层析柱，以氯仿-甲醇(30∶1-1∶1)溶剂系统洗脱，收集氯仿-甲醇5∶1的洗脱液，并浓缩，用甲醇清洗后得黄色粉末，也即覆盆子素。
经动物实验，本发明覆盆子提取物及覆盆子素具有防治慢性肾炎、肾阳虚和骨质疏松的活性，因此可用于制备防治慢性肾炎、肾阳虚和骨质疏松的药物。
本发明提取物和覆盆子素化合物制备方法简单，成本低廉，本发明为防治慢性肾炎、肾阳虚和骨质疏松提供了一种新的药物来源。
具体实施例方式 现结合实施例对本发明作详细描述。
所用的掌叶覆盆子是2007年9月采集于浙江杭州的掌叶覆盆子。
实施例1.制备覆盆子提取物 掌叶覆盆子干燥果实50kg，用水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得覆盆子提取物12.6kg。
实施例2.制备覆盆子提取物 掌叶覆盆子干燥果实50kg，用95％溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得覆盆子提取物2.4kg。
实施例3.制备覆盆子提取物 掌叶覆盆子干燥果实50kg，用70％乙醇水溶液按常规渗漉提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得覆盆子提取物6.5kg。
实施例4.用覆盆子提取物制备覆盆子素 1.制备覆盆子素粗制品 将实施例3制备的覆盆子提取物用水稀释至体积为50L，先用50L石油醚分别萃取3次，弃萃取液，再用50L二氯甲烷萃取3次，弃萃取液，然后用水饱和正丁醇萃取3次，每次50L，合并正丁醇萃取液，减压浓缩，得覆盆子素粗制品。
2.分离提取覆盆子素 将上述覆盆子素粗制品用水混悬，上大孔树脂D101，依次用水、30％、60％和95％乙醇水溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱液，减压浓缩成浸膏状并用甲醇溶解，用硅胶H(60型，青岛海洋化工集团公司)拌样，上硅胶H层析柱，以氯仿-甲醇(30∶1-1∶1)溶剂系统洗脱，收集氯仿-甲醇5∶1的洗脱液，并浓缩，用甲醇清洗后得黄色粉末，也即覆盆子素。
结构鉴定 黄色粉末，m.p.267-269℃，ESI-MSm/z 247[M-H]-，确定化合物分子量为248，HR-MS显示分子式为C12H8O6。UV(EtOH)λmax(ε)＝364(10143)，299(28317)，200(17918)。IR(KBr)vO-H＝3404cm-1，vC＝O＝1684cm-1，vC＝C＝1599cm-1，vCH2＝1392cm-1，vC-O＝1305cm-1。
1H-NMR(400MHz，δ，pyridine-d5)中，1HNMR信号δ＝2.5(2H，m)，δ＝3.5(2H，m)，显示有-CH2-CH2-，δ＝8.0(1H，s)，显示为双键上的H。13C-NMR中的信号δ＝195.5和δ＝160.5，显示有一个α，β-不饱和酮和α，β-不饱和酯的存在。从13C-NMR谱和DEPT谱中可知该化合物中含有9个季C、1个-CH、2个-CH2，13C-NMR中110-150有6个峰，DEPT谱中显示6个峰均为季C，表示有6取代苯环存在。
综合以上信息可以推断该化合物为苯环，一边连一个六元内酯环，一边连五元酮环，另两个C被OH取代。
依据HMQC谱可以对该化合物的碳氢作进一步的归属。
在HMQC谱中，δ＝23.8的仲C对应δ＝3.5(2H，m)的H，δ＝33.0的仲C对应δ＝2.5(2H，m)的H，δ＝108.0的季C对应δ＝8.0(1H，s)的H。HMBC中，δ＝8.0的H与δ＝160.5，140.1，144.2，149.3，113.2的C相关，说明双键分别与酯键和苯环相连，δ＝2.5的H与δ＝141.1，195.5，23.8的C相关，说明此CH2与酮羰基相连，δ＝3.5的H与δ＝141.1，145.0，195.5，23.8的C相关，说明两个CH2相连，并且后者连于苯环上。各型号归属如表1所示。
综合以上分析，确定该化合物的完整结构，命名为覆盆子素，其结构式为
表1.覆盆子素的1H、13C-NMR数据(400MHz，δ，pyridine-d5) 药理、药效实验 本发明覆盆子提取物与覆盆子素的药理或药效学实验方法基本相同，现详述如下 一、覆盆子提取物与覆盆子素对大鼠被动型Heymann肾炎的防治作用 被动型Heymarm肾炎是研究人类膜性肾病的经典模型，以大量蛋白尿为显著特征[中华肾脏病杂志.1999.15(3)158]。因此，本发明用Heymann肾炎模型研究覆盆子提取物及覆盆子素对肾炎的防治作用。
1、试验材料 1.1、实验仪器 BCA蛋白检测试剂盒(Pierce公司，美国)，ReverTra DashTM试剂盒(Toyobo公司，日本)。
1.2、供试样品 覆盆子提取物(实施例3制备) 覆盆子素(实施例4制备，纯度均不小于93.2％，下同)； 地塞米松(河北冀衡药业有限公司) 临用时将覆盆子提取物、覆盆子素和地塞米松分别用0.5％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混配制成相应浓度。
2、试验动物 品系Wistar大鼠 性别雄性 体重175～200克 来源中科院上海动物中心(下同) 动物合格证沪动合证字005号 饲养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。
3、试验方法 3.1制备抗FX1A血清 1)制备FX1A抗原 正常雄性Wistar大鼠，乙醚麻醉后消毒皮肤，剪开胸腹腔，以无菌的冷生理盐水灌洗肾脏，然后分离肾皮质称重，将皮质充分研磨成匀浆后加适量生理盐水，依次用80目、100目和220目筛网过滤，收集最后的滤液，将滤液以1600r/min20min离心，取上清，重复离心一次，取上清，再以10000r/min 30min离心后弃上清，将沉淀物用双蒸水洗涤3次，所得沉淀物为FXA1A抗原。
2)制备抗FX1A血清 将上述制备的FXA1A抗原和等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，间隔2周经皮下免疫大耳白兔，共免疫6次后取血清。用免疫双向扩散和间接免疫荧光法测定效价，分别达到1∶32和1∶2000为合格。颈动脉取血，分离血清，其为抗FX1A血清，-20℃备用，使用前灭活。
3.2、被动型Heymann肾炎模型的建立和动物分组 取雄性Wistar大鼠75只，它们的24h尿蛋白均小于10mg。随机平均分为5组阳性对照组、覆盆子提取物组、覆盆子素组、模型对照组(简称模型组，下同)和空白对照组(简称空白组，下同)。空白组一次性尾静脉注射生理盐水5ml/kg；其余各组大鼠一次性尾静脉注射抗FX1A血清5ml/kg进行造模，在造模当天起每天经口灌胃给药(给药剂量分别以每公斤体重计算)，共4周，给药剂量分别为阳性对照组(地塞米松，0.1mg/kg/d)；覆盆子提取物组(30g/kg/d)；覆盆子素组(10mg/kg/d)；模型组和空白组每天每只大鼠经口灌注0.5％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液5mg/kg/d。
3.3、观察指标 尿蛋白定量采用BCA(bicinchoninincacid)法，5个组均在造模开始第2和第4周周末分别放入代谢笼中，收集24h尿液。计量资料以均数±标准差(x±SD)表示，各组分别与模型组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析。结果见表2。
表2.大鼠尿蛋白量统计表
与模型组比较**P＜0.01 由表2可见，覆盆子提取物和覆盆子素尿蛋白量明显低于模型组(P＜0.05)，接近于阳性对照组，说明本发明覆盆子提取物和覆盆子素对被动型Heymann肾炎具有显著疗效。
二、覆盆子提取物、覆盆子素对氢化可的松诱导的小鼠肾阳虚的防治作用 本发明选用了氢化可的松诱导的小鼠肾阳虚模型，此模型是经典的、常用的肾阳虚模型。
1、试验材料 1.1、造模药品 名称氢化可的松 来源天津市生物化学制药厂 含量50mg/瓶 性状注射用粉针 配制用生理盐水配成3.57mg/ml。
1.2、供试样品 覆盆子提取物、覆盆子素同上；甲睾酮片(上海信谊康捷药业有限公司)；金匮肾气丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂)。
配制溶液临用时将覆盆子提取物、覆盆子素溶于1％西黄蓍胶制成相应浓度的混悬液； 甲睾酮用1％西黄蓍胶制成30mg/ml的混悬液； 金匮肾气丸用1％西黄蓍胶制成150mg/kg的混悬液。
2、试验动物 品系ICR小鼠 年龄6周龄 级别清洁级 性别雄性 体重25g±2g 来源上海斯莱克实验动物责任有限公司 动物合格证号SCXK(沪)2007-0005 饲养清洁级动物房，自由进食与进水，温度25±2℃，湿度40-60％，人工照明模拟昼夜变化。
3、试验方法 雄性ICR小鼠64只，在实验条件下适应3天。随机分组，每组8只。除空白组每天每只小鼠腹腔注射0.2ml生理盐水连续注射10天外，其余各组每天每只小鼠腹腔注射0.2ml氢化可的松溶液造模，同时分别灌胃上述配制的药液，给药剂量为覆盆子提取物低剂量组10g/kg；覆盆子提取物高剂量组30g/kg；覆盆子素低剂量组5mg/kg；覆盆子素高剂量组10mg/kg；甲睾酮组0.65g/kg；金匮肾气丸组6g/kg；模型组和空白组分别灌胃0.5ml 1％西黄蓍胶，并连续注射氢化可的松溶液10天。给药第13天，各组小鼠称重，眼眶取血，然后处死小鼠。摘取小鼠的睾丸、肾脏，称重。小鼠血液放置2小时后，离心，取血清，放置在-20℃冰箱中，待测。
各组小鼠肾脏和睾丸重量无差异，血清样品使用睾酮化学发光试剂盒，按照使用说明操作，测定血清睾酮浓度。计算每组小鼠体重和睾酮浓度的平均值和标准差(n＝8)，实验数据用x±SD表示，各组分别与模型组比较，采用双侧两样本t检验进行统计分析，结果见表3。
表3小鼠的体重及睾酮浓度水平统计表
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01 由表3可见，模型组小鼠体重明显低于空白组，血液睾酮水平较空白组有非常显著的差异(P＜0.01)。本发明覆盆子提取物和覆盆子素组，体重接近空白组和甲睾酮及金匮肾气丸组；血液睾酮水平与甲睾酮及金匮肾气丸组接近，特别是覆盆子提取物和覆盆子素高剂量组，血液睾酮水平基本与空白组和甲睾酮及金匮肾气丸组持平，与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)。结果表明，本发明覆盆子提取物和覆盆子素对小鼠肾阳虚具有明显的防治作用。
三、覆盆子提取物和覆盆子素对维甲酸致小鼠骨质疏松的治疗作用 为了研究覆盆子提取物和覆盆子素的抗骨质疏松的作用，本实验采用维甲酸致骨质疏松的动物模型，因为全反式维甲酸是一种免疫抑制剂，其具有抑制骨合成等作用，所以常用来建立动物骨质疏松模型。
1、试验材料 1.1、实验仪器 AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)。
1.2、供试样品 覆盆子提取物和覆盆子素同上；全反式维甲酸(河南中天实业有限公司)；阿仑膦酸钠(华北制药公司)。
配制临用时将覆盆子提取物、覆盆子素、全反式维甲酸和阿仑膦酸钠分别溶于0.5％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液中待用。
羟脯氨酸(HOP)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
2、试验动物 品系昆明种小鼠 性别雄性 体重33±4克 来源中科院上海动物中心 动物合格证沪动合证字005号 饲养恒温净化通风动物房，自由进食与饮水，25±2℃。
3、试验方法 昆明种小鼠40只，随机分成4组，每组10只分别为空白组，模型组，覆盆子提取物组(30g/kg)，覆盆子素组(10mg/kg)。除空白组外，其余各组均用全反式维甲酸(105mg/kg)造模，每天上午灌胃给药维甲酸，下午灌胃给予小鼠相应剂量的药物，模型组和空白组分别灌胃0.5％的羧甲基纤维素钠(CMCNa)混悬液，共14天。实验过程中每周周末称体重一次，第15天处死动物，并取右股骨供测定用。
小鼠股骨剖取后，剔除附着的软组织，经80℃烘干至恒重，并进行如下测定 (1)骨干重测量用电子天平称量，得骨干重； (2)骨长度基骨横径测量用游标卡尺对股骨长度及横径进行测量； 实验结果以均数±标准差(x±SD)表示，计量资料用t检验进行组间比较。
结果见表4。
表4小鼠的体重及骨指数统计表
与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01 由表4可见，模型组小鼠右股骨干重及右股骨横短径均显著小于空白组，而覆盆子提取物或覆盆子素组均显著高于模型组(P＜0.05，P＜0.01)。说明覆盆子提取物或覆盆子素对骨质疏松症具有防治作用。
权利要求
1.一种覆盆子提取物，制备方法为
将掌叶覆盆子干燥果实用0-95％乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取，提取液减压浓缩至无醇味的浸膏，得覆盆子提取物。
2.按权利要求1所述的覆盆子提取物，其特征在于将掌叶覆盆子干燥果实用50-80％乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取。
3.按权利要求2所述的覆盆子提取物，其特征在于将掌叶覆盆子干燥果实用70％乙醇水溶液按常规渗漉提取或浸泡提取。
4.按权利要求1或2或3所述的覆盆子提取物，其特征在于其含有覆盆子素。
5.一种覆盆子素化合物，化学结构式为
6.权利要求1或2或3所述覆盆子提取物在制备防治慢性肾炎或骨质疏松药物中的应用。
7.权利要求4所述覆盆子素在制备防治慢性肾炎、肾阳虚或骨质疏松药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是从掌叶覆盆子(Rubus chingii Hu)中提取的覆盆子提取物及从中分离得到的覆盆子素以及它们在制备治疗和预防慢性肾炎、肾阳虚和骨质疏松药物中的应用。覆盆子素化学结构式如下，本发明覆盆子提取物及覆盆子素具有防治慢性肾炎、肾阳虚和骨质疏松的活性，因而可以用于制备治疗和预防慢性肾炎、肾阳虚或骨质疏松的药物。
文档编号A61K36/185GK101732440SQ20091020113
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月15日 优先权日2009年12月15日
发明者郭美丽, 游孟涛, 王燕 申请人:中国人民解放军第二军医大学