专利名称：一种乙型肝炎病毒x蛋白单克隆抗体及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，具体地说，是一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)特异性 的单克隆抗体，以及该单克隆抗体在制备HBx免疫检测试剂和肝病治疗药物中的用途。
背景技术：
我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发地区，超过10%的人携带乙肝病毒。HBV感染 是引发肝纤维化、肝硬化和肝癌等肝病的主要因素。在我国，目前约80%的肝细胞癌(HCC) 患者合并乙型肝炎病毒(HBV)感染，HBV感染者发生HCC的危险性是无感染者的200余倍。
最新的研究显示，HBV X蛋白(HBx)具有广泛的基因转录调控作用，与慢性HBV感 染者发展成为HCC密切相关[1’2]。X基因位于HBV基因组的1374-1836位置，编码155个氨 基酸的多肽，即HBV X蛋白(HBx) [3’4]。X基因常随HBV基因组一同整合于肝细胞的染色体 中，利用宿主细胞转录和翻译体系合成HBx。HBx具有广泛的基因转录调控作用，不仅能够 激活病毒基因调控序列，而且能够与宿主细胞多种蛋白相互作用，从而影响宿主细胞周期、 影响细胞增殖分化与凋亡、使肝细胞发生恶性转化。HBx可与转录因子XPA-1、DDBU RPB5 和TFIIB结合，以提高基因转录水平、抑制DNA的修复、促进病毒自身复制；HBx还具有反式 激活作用，可上调多种细胞因子及其受体，如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子 (IGF)及其受体的表达；激活C-myt、N-ras等癌基因，与抑癌基因p53结合，抑制P53的核 转移及正常的转录调节功能。此外，HBx还可上调H印G-2的细胞端粒酶活性，改变抑癌基 因p55负调控功能，抑制细胞凋亡，四细胞发生恶性转化，与HCC的发生密切相关[5’6]。近 几年，国外研究显示，在40% HBV感染者和60-70% HCC患者的血清中可检测到HBx或HBx 抗体[7’8]。国内已有用HBxd单抗用于肝癌放射免疫显像诊断和治疗的研究[9’1(1]。血清HBx 水平可能成为急慢性乙型肝炎、肝硬化，尤其是肝癌实验室诊断的良好指标。
血清免疫学测定方法是检测HBx水平的最有效方法。HBx单克隆抗体的筛选和制 备是免疫检测HBx的必要条件。目前，HBx单克隆抗体的制备方法多采用基因工程表达并 分离HBx全长蛋白作为免疫动物和筛选单克隆抗体的抗原，存在HBx自身免疫原性较弱，获 得单克隆抗体效率低的问题。
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本发明目的之一是提供HBx蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体对HBx N-端或 C-端有特异性反应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和其他的HBV表达蛋白无反应。
本发明目的之二是提供HBx N-端和C-端抗原表位多肽通过与载体蛋白——匙孔 血蓝蛋白(KLH)的交联激发免疫反应，筛选、制备HBx单克隆抗体的方法，所述的HBx N-端 抗原表位多肽和C-端抗原表位多肽是人工化学合成的分别为多肽序列1 (SEQ 1)和多肽 序列2 (SEQ 2)所示的HBx蛋白N-端11_20位氨基酸序列PARDVLCLRP和HBx蛋白C-端 127-150 位氨基酸序列 I RLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF 多肽。
本发明目的之三是提供HBx单克隆抗体在制备HBx蛋白或HBx抗体免疫检测试 剂的应用方法，所述的HBx蛋白和HBx抗体免疫检测试剂盒是以HBx单克隆抗体为主要材 料，与酶、同位素、生物素、荧光物质和高分子微球等标记物质结合制备的各种酶联免疫吸 附(ELISA)、增强化学发光、放射免疫检测(RIA)、免疫比浊、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光 (IF)和免疫印迹(WB)等各种免疫检测试剂。
本发明目的之四是提供HBx单克隆抗体在制备放射免疫显像诊断试剂和免疫导 向治疗药物的应用方法，所述的放射免疫显像诊断试剂是用131I、161Tb、153Sm或186Re等放射 性同位素标记的HBx单克隆抗体，此标记抗体注射到体内后，会选择性聚结在肝脏HBx阳性 组织，用电子发射断层扫描仪(ECT)或正电子发射断层扫描仪(PECT)显像，用于HBV感染、 肝硬化和肝癌等疾病的诊断方法；所述的免疫导向治疗药物是用131I、161Tb、153Sm、186Re等放 射性同位素或细胞毒素标记的HBx单克隆抗体，此标记抗体注射到体内后，会因单抗选择 性聚结在HBx阳性肝癌病灶组织局部而产生的导向性抗肿瘤治疗作用。
实现上述目的的具体方案是
本发明涉及的免疫原——HBx N-端和C-端抗原表位多肽的合成是在对HBx蛋白 氨基酸序列的抗原表位进行分析的基础上，采用人工化学合成方法合成如多肽序列1 (SEQ1)和多肽序列2 (SEQ 2)所示的两条HBx N-端和C-端抗原表位多肽。
为提高复合多肽的免疫原性，本领域通用的方法是分别用HBx N-端和C-端抗原 表位多肽与载体蛋白交联，以便更好地激发免疫反应，获得单克隆抗体。载体蛋白包括匙孔 血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或其他一些免疫原性较高的大分子蛋白。本发明优选 匙孔血蓝蛋白(KLH)作为HBx抗原表位多肽的载体蛋白。
动物免疫方法采用HBx表位多肽和KLH的交联蛋白加完全福氏佐剂充分混勻，皮 下注射法免疫接种BAL B/C小鼠，每只小鼠背部皮下分多点注射共IOOyg抗原。2周后，用 交联蛋白加不完全福氏佐剂加强免疫1次，3周后再加强免疫1次。在确认小鼠已激发产生 抗HBx抗体后，分离小鼠脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤融合，HAT选择培养基筛选能分泌HBx 单克隆抗体的杂交瘤细胞。上述方法是示例性的，同样可以用复合多肽和KLH交联蛋白免 疫接种到大鼠、兔、羊和鸡等其他动物激发产生分泌抗体的浆细胞(免疫细胞)，与同系动 物骨髓瘤细胞融合，筛选获得分泌HBx单克隆抗体的其他种属杂交瘤细胞。
小鼠浆细胞与骨髓瘤细胞的融合按常规方法操作。具体来说，无菌取脾脏，400目 筛网过滤制备成细胞悬液，按5 1的比例与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合进行细胞融合，融 合促进剂为50 %聚乙二醇4000 (PEG4000)，细胞培养基为含HAT的10 %胎牛血清RPMI1640选 择培养基。除上述常规细胞融合方法外，可以选择电穿孔(点击)融合方法，也可以选择仙 台病毒(HVJ)作为融合促进剂，或添加二甲亚砜(DMSO)等增效剂，也能达到获得杂交瘤细 胞的目的。
杂交瘤细胞克隆化培养采用有限稀释法获得单克隆杂交瘤细胞。用来源于BALB/ C小鼠的巨噬细胞作为饲养细胞先接种于96孔板，然后每种杂交瘤细胞按每孔10、5、1个细 胞接种于铺有饲养细胞的96孔板中，置5% C02培养箱37°C培养。4_5天半量换液，2周左 右可用ELISA法测定HBx单抗。
杂交瘤细胞和HBx单克隆抗体的筛选采用ELISA法来测定和筛选。用分别包被有 HBx N-端和C-端抗原表位多肽的微孔板测定HBx抗体，以单纯饲养细胞培养上清作阴性 对照；以包被有匙孔血蓝蛋白(KLH)的微孔板鉴别抗KLH抗体，以剔除抗KLH单克隆抗体。 只有抗HBx阳性、抗KLH阴性杂交瘤细胞用作进一步筛选培养。
HBx单克隆抗体的制备与纯化可采用二条途径。一是从杂交瘤细胞体外培养上清 中收集；二是将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，从小鼠腹水中收集。前一种方法适用于获取 少量高纯度抗体，后一种方法适合大量获取抗体。获取的抗体溶液可以用盐析、凝胶过滤、 亲和层析等方法进行纯化。本发明优选硫酸铵——辛酸盐析沉淀法进行纯化。
本发明所涉及的HBx单克隆抗体与其他单克隆抗体的用途一样，可用于制备各种 HBx蛋白和HBx抗体的免疫检测试剂，包括酶联免疫吸附(ELISA)、增强化学发光(ECL)、放 射免疫检测(RIA)、免疫比浊(IT)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)等 各种免疫检测试剂。ELISA检测试剂及基于ELISA的增强化学发光检测试剂是目前临床上 最常用的免疫检测试剂，其通用的制备方法是选用两株分别与HBx N-端和C-端抗原表位 反应的单克隆抗体，一株作为捕获抗体，一株作为检测抗体。其中检测抗体用辣根过氧化物 酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)标记。检测HBx蛋白时用捕获抗体包被微孔板，酶标抗体为检 测抗体；检测HBx抗体时用抗人I gG抗体包被微孔板，加入HBx抗原和酶标抗体。ELISA检测 试剂用四甲基联苯胺(TMB)、或邻苯二胺(OPD)或其他化学显色底物显色，用酶标仪测定结果；增强化学发光检测试剂用化学发光底物鲁米诺(Iuminol)显示结果，用化学发光检测 仪测定结果。本发明涉及的HBx单克隆抗体还可以用任何已知的方法与同位素、生物素、荧 光物质和高分子微球等标记物质结合，制备成放射免疫检测(RIA)、免疫组织化学(IHC)、 免疫荧光(IF)和免疫比浊(IT)检测试剂。
本发明所涉及的HBx单克隆抗体也可应用于制备放射免疫显像诊断试剂和免疫 导向治疗药物。通用的方法是，用131I、161Tb、153Sm或186Re等放射性同位素标记单克隆抗体 制备放射免疫显像诊断试剂，标记抗体注射到体内后，会选择性聚结在肝脏HBx阳性组织， 用电子发射断层扫描仪(ECT)或正电子发射断层扫描仪(PECT)显像，用于HBV感染、肝硬 化和肝癌等疾病的诊断；用1311、161Tb、153Sm、186Re等放射性同位素或细胞毒素标记单克隆抗 体制备免疫导向治疗药物，标记抗体注射到体内后，会因单抗选择性聚结在HBx阳性肝癌 病灶组织局部而产生导向性抗肿瘤治疗作用。还有一种新的方法是应用基因扩增和基因重 组技术对HBx单克隆抗体可变区eDNA基因进行扩增和重组，获得人源性HBx单克隆抗体、 单链抗体等基因工程抗体药物，可直接注射到体内用于原发性肝癌治疗。
本发明的突出特点是通过化学合成方法分别HBx N-端和C-端抗原表位多肽，并 与载体蛋白——匙孔血蓝蛋白(KLH)交联途径来免疫动物，筛选获得HBx单克隆抗体。所获 得的单克隆抗体分别是HBx N-端表位特异性反应抗体和C-端抗原表位特异性反应抗体， 有利于通过双抗体夹心方法制备各种用于HBx蛋白或HBx抗体检测的ELISA和化学发光免 疫检测试剂。
附图1. Western免疫印迹分析HBx N-端表位单克隆抗体N2F2的特异性。Lanel 阴性对照肝细胞H印G2裂解液；lane2 :HBV基因转染肝细胞H印G2. 2. 15裂解液；lane3 =HBx N-端抗原表位多肽；lane4 单纯匙孔血蓝蛋白(KLH) ；lane5 =HBx C-端表位合成多肽。如 图所示，HBx N-端表位单克隆抗体对HBx N-端抗原表位多肽和肝细胞H印G2. 2. 15表达HBx 蛋白有较高的特异性反应(显示单一条带)，而不与单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)，HBx表达阴 性肝细胞H印G2和HBx C-端表位合成多肽发生反应。
附图2. Western免疫印迹分析HBx C-端表位单克隆抗体C3B2的特异性。Lanel 阴性对照肝细胞H印G2裂解液；lane2 :HBV基因转染肝细胞H印G2. 2. 15裂解液；lane3 =HBx C-端抗原表位多肽；lane4 单纯匙孔血蓝蛋白(KLH) ；lane5 =HBx N-端抗原表位合成多 肽。如图所示，HBx C-端表位单克隆抗体对HBx C-端抗原表位多肽和肝细胞H印G2. 2. 15 表达HBx蛋白有较高的特异性反应(显示单一条带)，而不与单纯匙孔血蓝蛋白(KLH)，HBx 表达阴性肝细胞H印G2和HBx N-端抗原表位合成多肽发生反应。
具体实施方式
实例一、HBx单克隆抗体的筛选
1. HBx N-端和C-端抗原表位多肽的合成采用Antigenic Peptides抗原 表位分析在线软件，对HBx蛋白氨基酸序列的抗原表位进行分析。结果显示，HBx蛋 白N-端11-20位氨基酸序列PARDVLCLRP和HBx蛋白C-端127-150位氨基酸序列 IRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF是抗原表位指数较高的区段。采用人工或化学合成方法分别合成如多肽序列1 (SEQ 1)和多肽序列2 (SEQ 2)所示的HBx N-端和C-端抗原表位多肽。
2. HBx N-端或C-端抗原表位多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联用水溶 解马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(KLH)maKLH(美国Themo Scientific公司产品)，使其 浓度为1011^/1111，取20(^1 11^1(1^与40(^1 10mg/ml的抗原表位多肽磷酸缓冲液(PBS)混 合，迅速混勻，室温放置2小时使二者交联形成共价复合物。将交联产物移至孔径为IKD的 微量透析管内，对PBS透析2-3次以去除金属螯合剂EDTA，最后用PBS调节交联物至IOmg/ ml年度。
3.免疫动物首次接种取100 μ 1交联物与100 μ 1完全福氏佐剂充分混合，免疫 接种BALB/C小鼠4-5只，每只小鼠背部皮下分2点接种20 μ 1共100 μ g抗原，接种前同时 取尾静脉血作为阴性对照；14天后取100 μ 1交联物与100 μ 1不完全福氏佐剂充分混合， 小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血ELISA法测定HBx抗体滴度；21天后取100 μ 1交联物 与100 μ 1不完全福氏佐剂充分混合，小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血ELISA法测定HBx 抗体滴度；如果21天抗体滴度还不够高，于28天再次取100 μ 1交联物与100 μ 1不完全福 氏佐剂充分混合，小鼠皮下免疫接种，同时取尾静脉血EIA法测定HBx抗体滴度。
4.鼠脾细胞与杂交瘤细胞的融合与培养末次免疫后第3天，无菌取脾脏，在400 目的筛网碾磨过筛，RPMI1640基础培养基冲洗制备成细胞悬液，IOOOrpm低速离心弃上清， 加入含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，调节细胞密度为107ml，取Iml细胞按5 1 的比例与2 X IO6小鼠SP2/0骨髓瘤细胞混合，低速离心弃上清，用手指弹勻沉淀细胞，在 37°C水浴中逐滴加入预热的50%聚乙二醇4000 (PEG4000)，边加边混勻，2分钟后加入IOml 无血清RPMI1640基础培养基，低速离心弃上清，沉淀细胞用HAT选择培养基重悬，接种于M 孔板，置5% (X)2培养箱37°C培养。每3-4天换半量HAT选择培养基，15天后改用HT培养 基，21天后改用10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基。克隆形成后，接种只培养瓶中扩大 培养。用ELISA检测到HBx抗体后，冻存部分克隆细胞。克隆化培养采用有限稀释法获得 单克隆杂交瘤细胞。用来源于BALB/C小鼠的巨噬细胞为饲养细胞接种于96孔板，每孔接 种IO4饲养细胞。悬浮杂交瘤细胞，每组杂交瘤细胞按每孔10、5、1个细胞接种于铺有饲养 细胞的96孔板中，置5% CO2培养箱37°C培养。4-5天半量换液，2周左右可用ELISA法测 定HBx抗体。
5.杂交瘤细胞和HBx单克隆抗体的筛选采用ELISA法测定每孔杂交瘤细胞培 养上清HBx抗体。分别HBx N-端和C-端抗原表位多肽包被微孔板，牛血清蛋白(BSA) 封闭，加入待测培养上清孵育1小时，以无杂交瘤细胞培养上清作阴性对照。用含0. Twen-20的PBS洗涤液洗涤3次，加入辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG孵育30分钟， PBS洗涤液洗涤5次，加入100 μ 1四甲基联苯胺(TMB)显色液避光显色10分钟，加2Ν硫 酸终止显色，在酶标仪上于450nm处测定吸光度值(OD值)。以包被有匙孔血蓝蛋白(KLH) 的微孔板筛选抗KLH阳性抗体，以剔除抗KLH单克隆抗体。只有抗N-端表位或C-端表位 阳性、抗KLH阴性杂交瘤细胞才用作进一步筛选。
实例二、HBx单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
l.HBx单克隆抗体的制备与纯化对于大量制备单克隆抗体，选择将杂交瘤细胞 接种到小鼠腹腔中，收集小鼠腹水获得抗体。抗体的纯化可以用盐析、凝胶过滤、亲和层析 等方法进行纯化。我们优选硫酸铵——辛酸盐析沉淀法进行纯化。(1)腹水的制备先腹腔注射0. 5ml Pristane (降植烷)或液体石腊于BaLb/c鼠，1 2周后腹腔注射1 X IO6个杂 交瘤细胞，接种细胞7 10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水 尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，收集腹水。( 单抗的纯化收集的腹水用滤纸 过滤去除沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液(pH4. 0)稀释后，用NaOH调， PH值至4. 5。逐滴加入辛酸(终浓度25ul/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min， 离心30分钟，收集上清液。上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10 XPBS (0. lmol/L,pH7. 4按 10 1比例混合，调PH至7. 4，置冰浴冷至4°C )。每毫升上述混合液加0. 2778固体硫酸 铵，4°C搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心10-20分钟，将沉淀溶于少量PBS，对PBS缓冲 液4°C透析过夜，次日收集抗体溶液冻存，以备抗体效价及蛋白含量测定。
2. HBx单克隆抗体效价的测定采用ELISA方法，用包被有HBx N-端或C-端抗原 表位多肽的包被微孔板测定杂交瘤细胞培养上清、腹水和纯化后抗体的效价。将各种含抗 体的液体以10倍稀释的方式不断稀释，每个反应设3个复孔，无细胞培养基、腹水和相应的 抗体稀释液作阴性对照。以3个复孔OD45tlnm值大于阴性对照的最低稀释度为抗体效价。本 发明共获得5株培养上清抗体效价大于10_4的杂交瘤细胞。其中HBx N-端表位特异性抗 体3株，分别为N1E3、N2F2、N2G4 ；HBx C-端表位特异性抗体2株，分别为C3B2和C5E8。各 株抗体效价见表1。
3. HBx单克隆抗体亚类的鉴定用购自美国Sigma公司的IS0-1ELISA试剂盒对上 述N1E3、N2F2、N2G4、C3B2和C5E8杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体进行亚类分析。此试 剂盒可分析 IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA 和 IgM 等抗体亚类。N1E3、N2F2、N2G4、C3B2 和 C5E8单克隆抗体的亚类分别为IgG2a、IgG2b, IgGl、IgGh和IgGl。
表1.各株单克隆抗体的效价
权利要求
1.一种单克隆抗体，其特征是此单克隆抗体与乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)有特异性反 应，可用于制备HBx免疫检测试剂和导向性治疗药物。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是对HBxN-端表位或C-端表位有特异性反 应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和HBV其他的表达蛋白无反应。
3.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，方法包括HBxN-端和C-端抗原表位多 肽的化学合成，表位多肽与匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联，免疫接种小鼠，分离脾细胞与骨髓 瘤细胞融合，有限稀释法筛选、克隆对HBx N-端和C-端抗原表位有反应，对KLH无反应的 能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水分离、纯化，获得单克 隆抗体。
4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备HBx免疫检测试剂的用途，其特征是用酶、同位 素、生物素、荧光物质和高分子微球等物质标记可制备用于诊断乙肝病毒(HBV)感染、肝硬 化和肝细胞癌(HCC)等疾病的各种HBx蛋白或HBx抗体免疫检测试剂，包括酶联免疫吸附 (ELISA)、增强化学发光(ECL)、放射免疫检测(RIA)、免疫比浊(IT)、免疫组织化学(IHC)、 免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)检测试剂。
5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备导向性治疗药物的用途，其特征是(1)用放射 性同位素或细胞毒素标记或交联此单克隆抗体可制备用于治疗乙肝病毒(HBV)感染和肝 细胞癌(HCC)疾病的导向性治疗药物；(2)用基因重组技术对此单克隆抗体进行重组和改 造可获得的单链、单区、嵌合等基因工程抗体药物。
全文摘要
一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)单克隆抗体，其特征是对HBx N-端表位或C-端表位有特异性反应，对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和HBV其他的表达蛋白无反应。该单抗的制备方法是通过HBx N-端和C-端抗原表位多肽分别与KLH的交联途径免疫接种小鼠、与骨髓瘤细胞融合而筛选获得的，可用于各种HBx蛋白或HBx抗体的免疫检测试剂和导向性治疗药物，应用于乙肝病毒(HBV)感染和肝细胞癌(HCC)等疾病诊断和治疗。
文档编号A61P31/20GK102030824SQ20091020409
公开日2011年4月27日 申请日期2009年9月30日 优先权日2009年9月30日
发明者王虹 申请人:王虹