同等型特异性抗her4抗体的制作方法

专利名称：同等型特异性抗her4抗体的制作方法
技术领域：
本发明致力于可用于检测和治疗癌症的抗体和使用那些抗体的方法。
背景技术：
ErbB/HER受体形成一个受体酪氨酸激酶亚家族，包括EGFR(也称作ErbBl或HER1)、HER2 (c_Neu、ErbB2)、HER3 (ErbB3)、和 HER4 (ErbB4)。ErbB 受体被多种 EGF 样生长因子选择性活化，导致细胞应答，诸如细胞增殖、分化、迁移、或存活。ErbB受体由糖基化胞 外域、单次跨膜域、和包括酪氨酸激酶的胞内域组成。配体对受体胞外域的结合触发受体二聚化、随后的激酶域活化、受体自磷酸化、和多种下游信号传导级联(I)。EGFR和HER2是完善确立的癌基因和癌症药物靶。它们涉及多种上皮和神经恶性肿瘤的发病机制，而且它们的过度活性与较差患者结局有关联(2-4)。靶向治疗剂(包括阻断这些受体的功能的单克隆抗体和小分子量激酶抑制剂二者)在临床试验中显示出对患者存活的治疗效果。Cetuximab (ERBITUX ，Imclone, Inc.)是一种嵌合单克隆抗体，其阻断配体结合EGFR，导致受体二聚化、自磷酸化和信号传导途径激活降低(5)。Cetuximab当前批准在临床上用于晚期化学不应性结肠直肠癌和头和颈局部或区域晚期鳞状细胞癌。Trastuzumab (HERCEPTIN , Genentech, Inc.)是一种针对HER2胞外域的人源化单克隆抗体，当前在辅助背景中及对于晚期疾病二者用于治疗过表达ErbB2的乳腺癌(6-9)。HER4受体拮抗剂显示出可用于控制平滑肌细胞的过度迁移和/或增殖及特别是用于治疗狭窄。参见 United States Patent No. 7，332，579。对HER4在癌症中的意义的了解不多。一些观察结果指示HER4受体在多种癌症中下调，或者它的表达与有利预后标志(诸如雌激素受体表达)有关联(10，11)。另一方面，HER4据报告在数种癌症中具有高表达水平，诸如甲状腺(12)、卵巢(13)、和乳腺癌(14)，以及髓母细胞瘤(15)，和室管膜瘤(16)中具有高表达水平。另外，HER4表达水平对临床结局的意义相互矛盾(17)。这些矛盾的数据的似是而非的解释之一是通过可变剪接自单一HER4基因生成四种在结构上和在功能上不同的同等型(isoform) (18，19)。这些同等型具有不同组织分布概况，而且它们在乳腺癌细胞系中促进肿瘤发生的能力不同(26)。因而，期望提供针对HER4受体特定同等型的治疗剂以更精确地治疗HER4介导的病症。发明概述本发明的一个方面提供了分离的特异性结合HER4JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述抗体与由保藏于ATCC编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM_a同等型的结合。在另一个实施方案中，所述抗体结合与由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。在另一个实施方案中，所述分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体包含来自由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479，特异性结合HER4 JM-a同等型的片段。在一个实施方案中，所述片段包含单克隆抗体单抗1479的可变区。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是亲和力成熟的。在一个实施方案中，所述分离的抗HER4抗体包含由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479或其人源化形式。在一些实施方案中，所述分离的抗HER4抗体连接至细胞毒剂。在一些实施方案中，所述分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体具有比对HER4 JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。 本发明的另一个方面提供了抑制表达HER4 JM-a同等型的癌细胞增殖的方法，包括使所述癌细胞与治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体接触。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，所述癌细胞是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤(medulloblastoma)细胞。本发明的另一个方面提供了在其癌症表达HER4 JM-a同等型的患者中治疗癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。本发明的另一个方面提供了在患者中治疗癌症的方法，通过选择其癌性细胞表达HER4 JM-a同等型的患者并对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM_a同等型的抗HER4抗体来进行。在一个实施方案中，抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。本发明的另一个方面提供了在患者中治疗癌症的方法，通过选择其癌性细胞包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域的患者并对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体来进行。在一个实施方案中，所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。在一些实施方案中，要治疗的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。本发明的另一个方面提供了在具有癌症的患者中降低与癌症疗法有关联的心脏毒性风险的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。在一个实施方案中，所述患者的癌症过表达HER4 JM-a同等型。在一个实施方案中，所述患者的癌症包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域。在一些实施方案中，所述患者的癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。本发明的另一个方面提供了在细胞样品中检测脱落HER4胞外域的存在的方法，包括使所述细胞与特异性结合JM-a HER4同等型的抗体接触。本发明的又一个方面提供了在患者中诊断肿瘤的方法，包括在所述肿瘤中检测脱落HER4胞外域的存在。在一个实施方案中，所述检测方法包括使特异性结合HER4 JM_a同等型的抗HER4抗体与自所述肿瘤获得的样品接触。在一个实施方案中，所述方法包括比较所述肿瘤中的脱落HER4胞外域水平与非癌性对照样品中的脱落HER4胞外域水平。附图简述
图I的示意图显示了可变近膜域HER4同等型JM_a(SEQ ID NO 1)和JM_b (SEQ IDNO 2)。图2的表描述了某些HER4单克隆抗体的特征。图3的Western印迹分析描绘了单抗1479和对照抗体sc_283对表达HER4同等型JM-a CYT-2或JM-b CYT-I的C0S-7细胞的结合特异性。图4的Western印迹分析描绘了单抗1479和对照抗体抗EGFR (sc-03)、抗HER2 (sc-284)、抗HER3 (sc-285)对稳定表达不同ErbB受体的NIH 3T3_7d和NR6细胞的结合特异性。图 5 的图显示了单抗 1479 对表达 HER4JM_a CYT-2、HER4JM_b CYT-U EGFR、HER2、或HER3的NIH 3T3_7d和NR6转染子的结合特异性，如提供细胞酶联免疫吸附测 定法(ELISA)(灰色柱)分析的。单抗1479结合与抗EGFR(sc-03)、抗HER2(sc-284)、抗HER3 (sc-285)和抗HER4 (sc-283)的结合比较(所有对照抗体的结合为白色柱)，I 1000(左)或 I : 100(右)稀释。图6的Western印迹分析显示了单抗1479对人肾组织溶胞物中的脱落HER4胞外域和对重组HER4胞外域的结合。图7显示了用重组HER4胞外域和单抗1479进行的体外结合测定法的结果。图8是测量单抗1479对重组HER4胞外域的结合的酶联免疫吸附测定法(ELISA)的非线性亲和力曲线。图9是17对正常乳腺(N)/乳腺肿瘤(T)组织样品的Western印迹分析，使用单抗1479来检测胞外域脱落。IOOkDa HER4胞外域(灰色)和150kDa全长HER4(白色)的表达水平的密度测定量化显示在每条Western道的下面。

图10的图显示了 17对匹配的正常和乳腺肿瘤组织中HER4胞外域和全长受体的均值表达，通过密度测定来量化。*，在与匹配的正常组织对照比较时，肿瘤组织内总HER4中作为胞外域存在的分数较大(灰色框；P < O. 05 ；ffilcoxon信号秩检验(signed-ranktest))。图IlA的Western印迹分析显示了单抗1479对NRG-1刺激的MCF-7乳腺癌细胞的HER4酪氨酸磷酸化的影响。所述膜用抗HER4 (Abcam)和抗肌动蛋白(作为对照)再印迹。图IlB的Western印迹分析显示了单抗1479对表达HER4 JM-a CYT-2的C0S-7转染子的IOOkDa HER4胞外域脱落入培养液的影响。来自相同实验的总细胞溶胞物用抗HER4 (Abcam)和抗肌动蛋白通过Western印迹来分析。图12的Western印迹分析显示了单抗1479对HER4的可切割JM_a同等型的遍在蛋白化的影响。图13的Western印迹分析显示了单抗1479对HER4表达水平的影响。图14的图显示了与对照抗体2C4相比，单抗1479对人乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7的增殖的影响。图15的图显示了与对照抗体3g6相比，单抗1479对人乳腺癌细胞系T-47D和MCF-7的不依赖锚定的生长的影响，如通过软琼脂集落形成测定法指明的。发明详述定义
除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所述领域普通技术人员的常规理解相同的含义，而且与Singleton et al 1994 Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology, 2nd Ed. ， J. Wiley & Sons, New York, NY ；和 Janeway et al2001 Immunobiology the immune system in health and disease 5th Ed. , GarlandPublishing, New York 一致。如本文中使用的，除非特别或上下文另外指明，术语“HER4多肽”或“HER4受体”指任何自HER4基因生成的天然或变异多肽,披露于例如European Patent ApplicationNo. (EP) 599，274 ；Plowman at al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :1746-1750(1993)；和Plowman et al.，Nature，366 :473-475 (1993)。在一个实施方案中，HER4 基因是人 HER4 基因。术语“HER4”和“ErbB4”在本领域可互换使用。该术语涵盖天然存在的形式、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)、天然存在的等位变体，而且可包括天然存在的翻译后修饰，诸如糖基化和GPI修饰。
术语“野生型” 一般指包含天然存在HER4蛋白的氨基酸序列的多肽。“天然序列多肽”包括与衍生自自然界的对应多肽具有相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可通过重组或合成手段生成。术语“天然序列”多肽明确涵盖特定多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变异形式(例如可变剪接形式)、天然存在的等位变体，而且可包括天然存在的翻译后修饰，诸如糖基化等。术语“氨基酸序列变体”指具有在一定程度上不同于主要天然序列多肽的氨基酸序列的天然存在多肽。氨基酸序列变体在氨基酸序列内的某些位置拥有替代、删除、和/或插入。“序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，氨基酸序列变体中同样的残基的百分比。比对的方法和计算机程序是本领域公知的。一种这样的计算机程序是由Genentech公司编写的“Align 2”，其已经于1991年12月10日连同用户文档一起提交给美国版权局(United States Copyright Office,Washington, DC 20559)，且其代码可见于 W02007/001851。“胞外域”或“EOT”指基本上不含跨膜域和胞质域的多肽。可以理解，为本发明多肽鉴定的任何跨膜域是依照本领域常规用于鉴定该种类型疏水结构域的标准鉴定的。跨膜结构域的精确边界可以变化，但最有可能的是本文中最初鉴定的结构域任一末端不超过约5个氨基酸。本文的术语“抗体”以其最广泛的含义使用并且特别覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性(Miller et al 2003 Jour, of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以为鼠、人、人源化、嵌合的抗体或来源于其它物种的抗体。抗体为能够识别和结合特异性抗原的蛋白质(Janeway et al 2001 Immunobiology the immune system in health and disease,5th Ed. , Garland Publishing, New York)。革巴抗原一般具有由多种抗体的CDR识别的大量结合位点，也称作表位。特异性结合不同表位的各抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有一种以上相应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分即含有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点免疫特异性结合所关注靶标的抗原或其部分，这类靶标包括，但不限于癌细胞或产生与自身免疫性疾病相关的自身免疫抗体的细胞。本文披露的免疫球蛋白可以具有免疫球蛋白分子的任意类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以来源于任意的物种，诸如人、鼠或兔。关于不同类的抗体的结构和特性参见Basic &Clinical Immunology,8thedition,Stites and Terr(eds. ),Mcgraw-Hill, Appleton & Lange, Norwalk,CT,1994 atChapter 6。“天然抗体”指通常由两条相同的轻(L)链(有两型，称作卡帕和拉姆达)和两条相同的重(H)链构成的约150，000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫键。每条重链在一端具有一个可变域(Vh)，接着是多个恒定域。每条轻链在一端具有一个可变域(')，而另一端是一个恒定域。轻链的恒定域与重链的第一恒定域排列在一起，而轻链的可变域与重链的可变域排列在一起。认为特定的氨基 酸残基在轻链与重链可变域之间形成界面。“亲本抗体”可以包含天然的或野生型的序列。亲本抗体可以针对感兴趣的靶抗原，例如生物学重要的多肽。还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原；参见US5091178)的抗体。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将抗体纯化至(I)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或银染色，达到表观同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。“抗体片段“包含全长抗体的一部分，该部分通常指所述全长抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；双抗体；线性抗体；微抗体(minibody) (US 5641870, Example 2 ； Zapata et al 1995Protein Eng. 8 (10)1057-1062) ；01afsen et al 2004 Protein Eng. Design & Sel. 17(4) :315-323);由 Fab表达文库生成的片段；抗独特型(抗Id)抗体；CDR(互补决定区)；和以免疫特异性方式结合癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的上述任意各项的表位结合片段；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变形式和糖基化差异。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原性位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于它们可以在不受其它抗体污染的情况中合成。例如，有待依照本发明使用的单克隆抗体可以通过首次由Kohler et al. 1975 Nature 256:495记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(参见例如US4，816，567 ；US5，807，715)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或猕猴，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding, 1986 Monoclonal Antibodies Principles and Practice, pp. 59-103 Academic Press)。抗体也可以使用 Clackson etal. 199INature 352 :624-628 ；Marks et al. 1991 J. Mol. Biol. 222 :581-597 中记载的技术从噬菌体抗体库分离。可以修饰编码抗体的DNA以生成“嵌合或融合抗体多肽”，例如通过用人重链和轻链恒定域(C1^PC1)序列替代同源鼠序列(US 4816567 ;&Morrison et al. 1984 Proc. NatlAcad. Sci. USA, 81 :6851)，或者通过融合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列。非免疫球蛋白多肽序列可替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域以创建嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异 性的抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原结合位点。抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(US 4,816, 567 JPMorrison et al. 1984 Proc.Natl. Acad. Sci. USA81 =6851-6855)。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴类(Old World Monkey)、猿等)的可变域抗原结合序列和人恒定区序列的“灵长类化”抗体。非人(例如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人抗体的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。Fe片段包含通过二硫键保持在一起的所有两条重链的羧基末端部分。抗体的效应器功能是由Fe区中的序列决定的，该区还是受到在某些类型的细胞上找到的Fe受体(FcR)所识别的部分(Jones et al 1986 Nature 321 :522-525 ；Riechmann et al 1988 Nature332 :323-329 ；Presta 1992 Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 ；Verhoeyen et al 1988Science，239 :1534-1536 ;Sims et al 1993 J. Immunol. 151 :2296 ；Chothia et al 1987J. Mol. Biol.，196 901)。其它方法使用自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区(Carter et al 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :4285 ；Presta et al1993 J. Tmmunol. 151 :2623)。“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。可得到能够在免疫后在没有内源免疫球蛋白生成的情况中生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击时生成人抗体。(Jakobovits et al 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :2551 ；Jakobovits et al1993 Nature, 362 :255-258 ；Bruggemann et al 1993 Year in Tmmunο. 7 :33 ；US 5545806 ；US 5569825 ；US 5591669 ；US 5545807;及 WO 1997/17852)。在“半胱氨酸改造的”抗体中，任何形式的野生型、鼠亲本单克隆抗体、人或人源化抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸替换。改造的半胱氨酸氨基酸是游离的半胱氨酸，不是链内或链间二硫化物单元的一部分。修饰或“改造”本发明感兴趣抗体的一个或多个氨基酸残基的DNA，使得导入一个或多个半胱氨酸氨基酸密码子并如此在所表达的抗体上有游离的半胱氨酸可供进一步修饰，诸如偶联细胞毒性药物。“抗原”指抗体能选择性结合的预定多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。细胞的细胞膜可呈现“细胞表面暴露的抗原”。
当对抗原的结合有足够的亲和力和特异性，使得抗体-抗原复合物形成，可用于靶向抗原的表位时，抗体“结合”感兴趣分子靶或抗原。抗原的表位可暴露在细胞的表面上，或可存在于分离的蛋白质上。术语“特异结合”或“特异性结合”特定分子靶或感兴趣抗原或特定分子靶或感兴趣抗原上的表位对其“特异性的”意味着可测量的不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定分子的结合并与对照分子的结合比较来测量，所述对照分子通常是结构相似但没有结合活性的分子。例如，特异性结合可通过与对照分子的竞争来测定，所述对照分子与靶物相似，例如过量的未标记靶物。在这种情况中，若经标记靶物与探针的结合受到过量未标记靶物的竞争性抑制，则指示特异性结合。在一个实施方案中，此类术语指这样的结合，其中分子结合特定多肽或特定多肽上的表位，而基本上不结合任何其它多肽或多肽表位。或者，此类术语可由对靶物的Kd为至少约ιο_4μ、1(Γ5Μ、1(Γ6Μ、ιο 、1(Γ8Μ、1(Γ9Μ、ΙΟ,Μ、10_ηΜ、10_12Μ或更大的分子展现。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间I : I相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。“抗体-抗原复合物”或“抗体-药物偶联物-抗原复合物”因特异性结合而形成。例如，当抗体特异性结合HER4或HER4同等型时，它通常会优先结合一个或多个在天然HER4或其同等型上找到的表位，而且可以是对其它抗原或蛋白质或其它HER4同等型没有显著结合亲和力(例如非特异性结合亲和力或交叉反应性)的抗体。在此类实施方案中，对非HER4或其它HER4同等型的非特异性结合亲和力或交叉反应性结合的程度会小于10%、5%、2%、或1%，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定的。“完整抗体”在本文中指包含\和Vh结构域以及轻链恒定域(CJ和重链恒定域
的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体可具有一项或多项“效应器功能”，指那些可归于抗体Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；和细胞表面受体(诸如B细胞受体和BCR)下调。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β_折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见 Kabat et al. 1991 Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda,MD.)。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。 术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域(区)中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个高变区三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵盖许多高变区的叙述。Kabat互补决定区(OTR)是以序列变异性为基础的且是最常用的(Kabat et al. 1991)。Chothia改指结构环的位置(Chothia and Lesk 1987 J. Mol. Biol. 196 :901-917)。“接触”高变区是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些高变区中每一个的残基。除非另有说明，会采用依照Kabat蛋白质比对序列数据库的Kabat编号方式(Wu and Kabat 1970J. Exp. Med. 132 :211-250 ； Johnson and Wu 2000 Nuc. Acids Res. 28 (I) :214-218)。高变区或“互补决定区”位置通常如下氨基酸24-34 (VIXDR-Ll)，氨基酸49-56 (VL⑶R-L2)，氨基酸 89-97 (VL CDR-L3)，氨基酸 26-35A (VH CDR-H1)，氨基酸 49-65 (VH CDR-H2)，和氨基酸93-102 (VH CDR-H3)。高变区还可包括“延伸的高变区”:氨基酸24-36 (VL CDR-L1)和氨基酸46-56(VL CDR-L2)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等1991，见上文编号的。“改变的高变区”就本文目的而言指其中包含一处或多处(例如I处至约16处)氨基酸替代的高变区。“未修饰的高变区”就本文目的而言指具有与衍生它的非人抗体相同的氨基酸序列的高变区，即其中缺少一处或多处氨基酸替代的高变区。术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等1991，见上文中用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含较少的或另外的氨基酸，对应于可变域FR或⑶R的缩短或插入。例如，重链可变域可以包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号可以通过将抗体序列与“标准” Kabat编号序列对比同源区来确定。“框架区”或“FR”残基指可变域中那些除此处定义的高变区残基以外的残基。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白 '或Vh框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白 ' 或Vh序列选集来自可变区序列亚型。通常，序列亚型是如Kabat etal.1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD 中的亚型。在一个实施方案中，对于Vy亚型是如Kabat等人1991中的亚型κ I。在一个实施方案中，对于Vh,亚型是如Kabat等人中的亚型III。“VH亚型III共有框架”包含从Kabat等人1991的可变重链亚型III中的氨基酸序列获得的共有序列。“'亚型I共有框架”包含从Kabat等人1991的可变轻链κ亚型I中的氨基酸序列获得的共有序列。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的抗体相比有所改进的抗体。亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过Vh和\域改组的亲和力成熟(Marks et al. 1992Bio/Technology 10 :779-783)或 CDR 和 / 或框架残基的随机诱变(Barbas et al. 1994 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813 ；Schier etal.1995 Gene 169 :147-155 ；Yelton et al. 1995 J. Tmmunol. 155 :1994-2004 ； Jackson etal. 1995J. Immunol. 154(7) :3310-9 ；Hawkins et al. 1992 J. Mol. Biol. 226 :889-896)来生成。 “Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。正是在这种构造中，每个可变域的三个高变区相互作用而在Vh-' 二聚体表面上限定了一个抗原结合位点。六个高变区一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CHl)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CHl结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在成对Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的Vh和\结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。Fv多肽在Vh与\结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构(PlUckthun, 1994,《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)),113, Rosenburg 和 Moore 编，Springer-Verlag, New York,第 269H5 页)。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链(Vh-VJ中包含相连的V1^PVp通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(EP 404, 097 ；W0 1993/11161 ；Hollinger et al. 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。术语“抗体-药物偶联物”或“免疫偶联物”包含如下的抗体，其偶联有细胞毒剂，诸如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。“游离半胱氨酸”指已经工程改造入亲本抗体的、具有硫醇官能基的(-SH)、且没有配对或以其它方式成为分子内或分子间二硫桥一部分的半胱氨酸残基。术语“硫醇反应性值”是游离半胱氨酸氨基酸的反应性的定量表征。硫醇反应性值指经过半胱氨酸工程改造的抗体中与硫醇反应性试剂反应的游离半胱氨酸氨基酸的百分比，且换算成最大值I。例如，经过半胱氨酸工程改造的抗体上与硫醇反应性试剂(诸如生物素-马来酰亚胺试剂)以100%产率反应(以形成生物素标记的抗体)的游离半胱氨酸氨基酸具有I. O的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、与硫醇反应性试剂以80%产率反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有O. 8的硫醇反应性值。已工程改造入相同或不同亲本抗体、完全不能与硫醇反应性试剂反应的另一个半胱氨酸氨基酸具有O的硫醇反应性值。特定半胱氨酸的硫醇反应性值的测定可以通过ELISA测定法、质谱、液相层析、放射自显影、或其它定量分析测试来进行。容许捕捉经过半胱氨酸工程改造的抗体及比较和定量半胱氨酸反应性的硫醇反应性试剂包括生物素-PEO-马来酰亚胺((+)_生物素基-3-马来酸亚氨基丙酸氨基-3,6- 二P恶羊烧二胺((+) -biotinyl-3-maleimidopropionamidyl-3,6-dioxaoctainediamine), Oda 等(2001)Nature Biotechnology 19:379-382，Pierce Biotechnology, Inc.)、生物素_BMCC、PE0_吲哚乙酰基生物素、吲哚乙酰基-LC-生物素、和生物素-HPDP (Pierce Biotechnology, Inc.)、及N a -(3-马来酰亚氨基·丙酰基)生物胞素(MPB,Molecular Probes, Eugene, OR)。生物素化、双功能和多功能接头试剂的其它商业来源包括 Molecular Probes (Eugene, OR)和 Sigma (St. Louis, MO)。当与细胞表面抗原形成复合物后，细胞表面膜上存在的抗原-抗体复合物或抗原-抗体-药物偶联物复合物经生化反应自细胞表面消除并掺入细胞自身中时，抗体或抗体-药物偶联物“内化”。数种可能的胞吞后运输途径可在此后从事于复合物(参见综述Schroeder et al 2001" Recent advances in membrane microdomains rafts,caveolae,and intracellular cholesterol trafficking. " Exp Biol. Med(Maywood)Nov ;226 (10)873-90), Spooner et al 2006" Retrograde transport pathways utilized by virusesand protein toxins " Virol J. 2006 ;3 :26)。针对变性的蛋白质制备的抗体可用于Western印迹,但是预期不会结合细胞表面表位或形成抗原-抗体复合物且因此不会内化。术语“Fe受体”或“FcR”意指能结合抗体Fe恒定区的受体。此外，FcR是能结合IgG抗体的FcRO受体)，包括Fe Y RI、Fc Y RII和Fe Y RIII亚类的受体,包括这些受体的各等位变体和各可变剪接形式。FcyRII受体包括Fe Y RIIA( “活化受体”)和Fe Y RIIB ( “抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体Fe Y RIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体Fe Y RIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述参见Daeron 1997Annu. Rev. Immunol. 15 :203-234)。FcR 的综述参见 Ravetch and Kinet 1991 Annu. Rev.Tmmunol · 9 :457-492 ；CapeI et al. 1994 Immunomethods 4 :25-34 ；M.de Haas et al. 1995J. Lab. Clin. Med. 126 :330-341)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体，FcRn,其负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al. 1976J. Tmmunol · 117 587)。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合其关联抗原所结合的抗体(适宜亚类的)起始的(Gazzano-Santoro et al. 1996 J. Immunol. Methods 202:163)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应，其中表达Fe受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达？(^1 111，而单核细胞表达？(^1 1、？(^1 11和？(^1 111。Ravetch and Kinet 1991Annu. Rev. Immunol. 9 :457-92第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如US 5，500，362或5，821，337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al 1998Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 :652-656 中所披露的。“人效应细胞”指表达一种或多种恒定区受体(FcR)并行使效应器功能的白细胞。该细胞至少表达Fe YRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。 效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液或PBMC。“处理”或“治疗”或“缓和”指治疗性处理及预防性或防范性措施二者，其中目标是预防或减缓(减轻)所针对的病理学状况或病症。需要治疗的受试者包括早就患有病症的受试者以及倾向于患上病症的受试者或要预防病症的受试者。如果在依照本发明的方法接受治疗量的抗体或其抗体药物偶联物后，患者在如下一项或多项中显示出可观察和/或可测量的降低或消失，那么受试者或哺乳动物成功“治疗” 了癌症癌细胞数减少或癌细胞消失；肿瘤体积缩小；癌细胞浸润到周围器官中，包括癌传播到软组织和骨中受到抑制(即一定程度的减缓或停止)；肿瘤转移受到抑制；肿瘤生长受到抑制；和/或与特定癌症有关的一种或多种症状得到一定程度的减轻；发病率和死亡率降低；及生命质量提高。就抗体或其抗体-药物偶联物可预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，它可能是抑制细胞的和/或毒害细胞的。用于评估疾病的成功治疗和改善的参数可以容易地通过内科医师所熟悉的常规流程来测量。对于癌症治疗，可通过例如评估疾病进展时间(TTP，time todisease progression)和/或测定响应速率(RR,response rate)来测量功效。转移可通过分期测试(staging test)来测定，及通过骨扫描及钙水平和其它酶的测试以测定是否传播到骨。还可使用CT扫描以查明是否传播到骨盆及该区域中的淋巴结。分别使用胸腔X射线和通过已知方法进行的肝酶水平测量来查明是否转移到肺和肝。用于监测疾病的其它常规方法包括经直肠超声检查(TRUS)和经直肠针吸活组织检查(TRNB)。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞，而且指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前或癌性细胞和组织。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括结肠癌、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺的腺癌和肺的鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肉瘤(hepatoma)、乳腺癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子Hj癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴莖癌、头颈癌、和黑素瘤。“过表达”多肽的癌指与同一组织类型的非癌性细胞相比，在其细胞表面上具有显著更高水平的该多肽的癌。此类过表达可以是由转录或翻译提高引起的，其继而可以是由遗传水平的异常或变化(例如DNA突变或改变)、mRNA剪接变异、或特定遗传转录因子、启动子或增强子活性改变引起的。可在诊断或预后测定法中通过评估细胞表面上存在的受体蛋白质水平的升高(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)来确定过表达。或者/另外，可测量细胞中受体编码核酸的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH;参见WO 1998/45479)、Southern印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。术语“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓或阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制肿瘤转移；一定程度地抑制肿瘤生长；和/或一定程度地减轻一种或多种与癌症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。术语“细胞抑制性的”指限制细胞功能的效果，诸如限制细胞生长或细胞增殖。对于例如癌症疗法，功效可以通过评估距疾病进展的时间(TTP)和/或测定响应率(RR)来测量。术语“标记物”指可共价附着于抗体并发挥如下功能的任何模块(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以改变由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与之结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数影响迁移率例如电泳迁移率或细胞通透性；或(V)提供俘获模块，以调控配体亲和力、抗体/抗原结合、或离子络合。短语“药学可接受盐”在用于本文时指ADC的药学可接受的有机或无机盐。例示性的盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐或酒石酸盐。药学可接受盐可能牵涉包含另一种分子，诸如乙酸盐离子、琥珀酸盐离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是稳定化合物电荷的任何有机或无机模块。另外，药学可接受盐可以在其结构中具有超过一种带电荷原子。在多种带电荷原子作为药学可接受盐的组成部分的情况中可以具有多种抗衡离子。因此，药学可接受盐可具有一种或多种带电荷原子和/或一种或多种抗衡离子。“药学可接受溶剂化物”指一个或多个溶剂分子和ADC的结合。形成药学可接受溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。“载体”在用于本文时包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是PH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合齐U，诸如EDTA ;糖醇,诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；和/或非离子表面活性齐 ，诸如TWEEN 、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS 。组合物和方法、
HER4 同等型通过可变剪接自单一 HER4基因生成四种在结构上和在功能上不同的同等型(18，19)。两种同等型在细胞内的胞质域中有不同(同等型CYT-I和CYT-2)。CYT-I在胞质域内具有16个氨基酸的插入物，而CYT-2没有插入物(18)。CYT-I同等型能介导偶联至磷酸肌醇(phosphoinositide) 3-激酶(PI3-K),但是 CYT-2 同等型不能(20,21)。另两种同等型(JM-a和JM-b)因细胞外的近膜区中23或13个可变氨基酸的插入而不同(图I)。JM-a是在近膜区内有23个氨基酸的同等型(NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHASEQ ID NO :1)，而JM-Ib是在此区中有13个氨基酸的同等型(IGSSIEDCIGLMD SEQ ID NO:2) (17，23)。胞外同等型JM-a能被肿瘤坏死因子_α转化酶(TACE)切割(22)，而JM_b同等型对蛋白酶有抗性(23)。TACE进行的切割触发涉及Y-分泌酶活性的对HER4的第二切割
(24)。结果，胞内域(I⑶)自细胞膜释放并转运至核，在那里它可发挥调节基因转录的功能(25-28)。与HER4同等型在肿瘤发生中的作用不同的假说一致，可切割HER4JM_a CYT-2同等型，但非其不可切割对应物JM-b CYT-2，表现出不依赖配体的活性且促进癌细胞生长
(26)。另外，与HER4在细胞表面处的定位相比，胞内HER4表位在核中的定位与更短的存活有关联(29)，提示HER4切割能调节肿瘤进展。这些相同的可切割同等型先前显示出在一系列临床乳腺癌患者样品中过表达(18，26)。另外，JM-a和JM-b同等型还展现出不同的组织分布样式，其中心组织中没有JM_a同等型(23)。同等型特异性抗体本发明的一个方面提供了特异性结合HER4 JM-a同等型的抗体。在一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含JM-a近膜区的完整全长HER4受体以及可溶性HER4胞外域二者。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合包含NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHASEQ ID N0:1的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体特异性结合氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA(SEQ ID NO 1) 本发明的另一个方面提供了分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体，其中所述抗体是由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单抗1479单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体是自由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单抗1479单克隆抗体衍生的人源化或亲和力成熟抗体。本发明的另一个方面提供了包含来自由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479的片段的抗HER4抗体。所述抗体是对HER4 JM_a同等型特异性的。在一个实施方案中，所述片段特异性结合HER4 JM-a同等型。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段至少包含高变区的一部分。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含重链高变区。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含轻链高变区。在另一个实施方案中，所述片段包含单抗1479的轻链和重链高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VHl、VH2、或VH3高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VHl、VH2、和VH3高变区中的至少两项。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、和VH3高变区中的所有三项。在一个实施方案中，所述片段包含VL1、VL2、或VL3高变区。在一个实施方案中，所述片段包含VL1、VL2、和VL3高变区中的至少两项。在一个实施方案中，所述片段包含VLl、VL2、和VL3高变区中的所有三项。在一个实施方案中，所述片段包含VHl、VH2、或VH3高变区中的至少一项、两项、或三项和VL1、VL2、和VL3高变区中的至少一项、两项、或三项。在一个实施方案中，所述片段包含VH1、VH2、或VH3高变区中的所有三项和VL1、VL2、和VL3高变区中的所有三项。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段至少包含可变区的一部分。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含重链可变区。在一个实施方案中，所述来自单抗1479的片段包含轻链可变区。在另一个实施方案中，所述片段包含单抗1479的轻链和重链可变区。在一些实施方案中，所述片段包含不显著降低抗体对JM-a同等型的结合特异性的突变。本发明的另一个方面提供了与由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系 生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM_a同等型的结合的抗体。本发明的又一个方面提供了结合与由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位的抗体。在一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位包含HER4胞外域。在另一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位至少包含氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA(SEQ ID NO 1)的一部分。在另一个实施方案中，由单克隆抗体单抗1479结合的表位包含氨基酸序列NGPTSHDCIYYPWTGHSTLPQHA (SEQ ID NO :1)。在一些实施方案中，JM-a同等型特异性抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体降低HER4酪氨酸磷酸化。遏制受体酪氨酸磷酸化显示出与靶向其它ErbB受体的胞外域的治疗性抗体的抗肿瘤活性有关联(39，48，49)。抗HER4抗体对HER4磷酸化的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例I和5描述了其一个例子。简言之，用抗HER4抗体处理表达HER4的细胞，然后用NRG-I刺激。溶解细胞，并用一般抗HER4抗体诸如HFR-I (R&D，Minneapolis,MN)免疫沉淀，在SDS-PAGE凝胶中分开，并使用抗磷酸酪氨酸抗体诸如4G10 (UpstateBiotechnology, Lake Placid, NY)通过Western印迹来分析。可扫描印迹，并通过扫描密度测定来分析以提供定量分析。在一些实施方案中，包括对照。在一个实施方案中，对照包含在抗HER4抗体处理缺失下经NRG-I刺激的表达HER4的细胞的样品。像经过处理的细胞一样，通过Western印迹来分析该细胞。在一个实施方案中，抗HER4抗体将HER4酪氨酸磷酸化降低至少 30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,^；99%。在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体降低HER4切割。HER4切割导致IOOkDa胞外域片段释放。此事件也称作胞外域脱落。抗HER4抗体对HER4切割的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例I和5描述了其一个例子。简言之，可通过测定经过抗HER4抗体处理的表达HER4的细胞的细胞培养液中胞外域的存在来检测HER4切割的降低。可通过在测定中包括佛波醇13-肉豆蘧酸酯12-乙酸酯(PMA)来增强切割。在一些实施方案中，包括对照。在一个实施方案中，包括如下的对照，其中测定未经抗HER4抗体处理的表达HER4的细胞的细胞培养液中胞外域的存在。在一个实施方案中，抗HER4抗体将 HER4 切割降低至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%,96%,97%、98%、或 99%。在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体内化。抗体内化可用于将抗体偶联的毒素投递至表达HER4JM-a同等型的癌性细胞。在一些实施方案中，对JM-a同等型特异性的抗HER4抗体促进HER4内化。酪氨酸受体激酶内化与受体下调有关联。在一个实施方案中，抗HER4抗体将细胞表面上HER4的量降低至少 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,^；99%。抗HER4抗体对HER4内化的影响可通过本领域公知方法来测定，本文中实施例I和6描述了其一个例子。在一些实施方案中，特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体具有比对HER4JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。心脏毒性是与多种受体酪氨酸激 酶抑制剂治疗剂有关联的副作用(62，63)。对HER4JM-a同等型特异性的抗体预测在患者中产生比识别JM-b同等型的抗HER4抗体要小的心脏毒性效果，因为JM-a同等型不存在于心组织中(23)。患者中的心脏毒性表现为多种症状，包括心力裳竭、左心室功能素乱(LVD)、心肌缺血、高血压、静脉血栓栓塞、心动过缓、和QT间期(心电周期中Q波开始和T波结束之间的时间的量度)延长。化合物的心脏毒性可例如通过使用体外或体内诊断模型来测量。心脏毒性的体外测定可通过将心细胞暴露于测试化合物并观察细胞外观或细胞凋亡速率的任何变化来进行。细胞外观的有关变化包括线粒体膨胀和降解。细胞凋亡可通过例如末端脱氧核苷酸基转移酶介导的脱氧尿苷5-三磷酸酯缺刻末端标记来监测。另外，细胞的酶或凋亡相关化学品分泌升高指示心脏毒性。此类化学品或酶包括肌钙蛋白/肌原蛋白、利钠肽诸如B型的N端前肽(pro-BNP)、细胞色素C和胱天蛋白酶-9。可用作培养细胞模型的心细胞包括自合适动物模型诸如小鼠或大鼠获得的原代的或培养的成年或新生心室肌细胞(心肌细胞)(62-64)。心脏毒性的体内测定可例如通过将测试化合物注射入合适的动物模型诸如小鼠或大鼠中并观察测试化合物对模型心组织的结构、线粒体心外观和功能、和/或模型心组织凋亡速率的影响来实施(62)。分离的心模型或Langendorf制备物也可用于测定化合物的心脏毒性(63)。心脏毒性还可通过临床观察来测量。例如，通过临床诊断组合患者历史和体格检查及诊断测试诸如心电图(EKG)、胸部X射线摄影术、和多门采集扫描(MUGUA)来测量心力衰竭和LVD。心肌缺血通过体格检查、检测心肌坏死、检测EGK变化、和检测心酶上升升高来测定。高血压通过测量患者的血压来测定。那些血压大于或等于140/90mm Hg的患者一般被认为是具有高血压。静脉血栓栓塞通过压缩超声图像检查法、断层摄影血管造影术、磁共振肺血管造影术、或核医学技术来检测。心动过缓一般定义为低于60次每分的心率，而且通过测定心率组合EKG或霍尔特(Holter)监护仪分析来检测。QT间期延长是心的电活动异常，而且可通过EKG分析来测定。一般地，小于或等于440毫秒的QT间期被认为是正常的，而男性大于450毫秒和女性大于470毫秒的QT间期一般被认为是延长的(64)。抗体片段本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003) Nat. Med. 9 :129-134。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107-117(1992);及 fcennan 等，Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab' -SH片段并化学偶联以形成F(ab' )2片段(Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法,可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab' )2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab' )2片段记载于美国专利No. 5，869，046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185 ;美国专利No. 5，571，894 ;及5，587，458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合 蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No. 5，641，870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。人源化抗体本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones 等(1986)Nature 321 :522-525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323-327 ；Verhoeyen等(1988) Science 239 :1534-1536),即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4，816，567)，其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(参见例如 Sims 等(1993) J. Immunol. 151 :2296 ;Chothia等(1987) J. Mol. Biol. 196 :901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体(参见例如Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :4285 ;Presta 等(1993)J. Immunol. 151 :2623)。一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。人抗体本发明的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如 Kozbor, J. Immunol. ,133 :3001(1984) ;Brodeur 等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York,1987)；及Boerner 等，J. Tmmunol. , 147 :86 (1991).例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体 重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :2551 (1993) Jakobovits 等，Nature 362 :255(1993)；Bruggermann Year in Immunol. 7 :33 (1993)。基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitopeimprinting),如本文所述通过曬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月I日)。与传统的通过CDR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或CDR残基。双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对HER4 JM-a同等型，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合HER4 JM-a同等型的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达HER4 JM-a同等型的细胞。这些抗体拥有HER4 JM_a同等型结合臂和结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素_α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab' )2双特异性抗体)。用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305 :537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物,其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO 93/08829，公布于1993年5月13日及Traunecker等，EMBO J. 10 :3655(1991)。依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。 在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于W094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，Methods in Enzymology 121 :210 (1986)。依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域(^3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No. 4，676，980)，及用于治疗HIV感染(W0 91/00360，WO92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No. 4，676，980。文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science 229 =81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab' )2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下(用以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成)还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab' -TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab' -TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab' -SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 =217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab' )2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶物的溶解活性。
还记载了直接从重组细胞培养物生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J. Immunol. 148 (5)1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 (1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv) 二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J. Immunol. 152 :5368(1994)。涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，J. Immunol. 147 :60(1991)。
多价抗体多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fe区及Fe区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)三个至大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含(或由其组成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，所述多肽链可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VDl是第一可变域，VD2是第二可变域，Fe是Fe区的一条多肽链，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η是O或
I。例如，多肽链可包含=VH-CHl-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CHI-VH-CHI-Fe区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。单域抗体在有些实施方案中，本发明的抗体是单域抗体(single-domain antibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc. , Waltham, MA ;参见例如美国专利No. 6，248，516B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。抗体变体在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”,如 Cunningham 和 Wells (1989) Science 244 1081-1085 中所述。这里，鉴定一个残基或一组祀残基(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、IysjP glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合， 长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(例如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于O-连接的糖基化位点)。若抗体包含Fe区，则可改变附着其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的、双触角的寡糖，其一般通过N-连接附着于Fe区CH2结构域的Asn297(参见例如Wright等(1997)TIBTECH 15 :26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善特性的抗体变体。例如，提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构(直接地或间接地)附着于Fe区的抗体变体。此类变体具有改善的ADCC功能(参见例如美国专利申请号US2003/0157108(Presta, L.) ；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co·，Ltd))。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体变体的出版物的例子包括US 2003/0157108 ；W02000/61739 ;W0 2001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US2004/0110282 ；US 2004/0109865 ；W0 2003/085119 ；WO 2003/084570 ；W02005/035586 ；W0 2005/035778 ；W02005/053742 ；W02002/031140；Okazaki 等，J. Mol. Biol. 336 :1239-1249 (2004) ;Yamane_0hnuki 等，Biotech. Bioeng. 87 614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lecl3CHO 细胞(Ripka 等，Arch. Biochem. Biophys. 249 :533-545 (1986);美国专利申请号 US2003/0157108A1, Presta, L ;及冊 2004/056312A1, Adams 等，尤其是实施例 11)和敲除细胞系，诸如α -1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech. Bioeng. 87 :614(2004) ；Kanda, Y.等，Biotechnol. Bioeng. , 94 (4)680-688(2006);及 W02003/085107)。进一步提供了具有等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fe区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等)；美国专利No. 6，602, 684 (Umana等)；及” 2005/0123546 (Umana等)。还提供了在附着于Fe区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO1997/30087 (Patel 等)；W0 1998/58964(Raju, S.);及 WO 1999/22764(Raju, S.)。在某些实施方案中，抗体变体包含具有一处或多处进一步改善ADCC的氨基酸替代的Fe区，例如Fe区第298、333、和/或334位(EU残基编号方式)处的替代。此类替代 可以与任何上文所述变异组合存在。在某些实施方案中，本发明涵盖了如下抗体变体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能(诸如补体和ADCC)不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中，测量抗体的Fe活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fe受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏Fe Y R结合(从此有可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达 Fe Y RIII,而单核细胞表达 Fe Y RI、Fe Y RII 和 Fe Y RIII。Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9 :457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No. 5，500，362中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例(还可参见 Hellstrom, I.，et al. Proc. Nat，I Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986) ；Hellstrom,I et al. ,Proc. Nat’ I Acad.Sci. USA82 :1499-1502(1985) ；5, 821, 337 ；Bruggemann, M. etal.，J. Exp. Med. 166 :1351-1361 (1987))。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如ACTI 非放射性细胞毒性测定法，其用于流式细胞术(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；和CytoTox 96 非放射性细胞毒性测定法(Promega, Madison, WI))。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al. Proc. Naf IAcad. Sci. (USA)95 :652-656(1998)中所披露的。还可以进行Clq结合测定法来证实抗体不能结合Clq及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J. Immunol. Methods 202 :163(1996) ；Cragg,M. S. et al. , Blood101 :1045-1052(2003) ;&Cragg，M.S.和 M. J. Glennie，Blood 103 :2738-2743 (2004))。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova，
S.B.et al.，Int，I. Immunol. 18(12) : 1759-1769 (2006))。提供了另一类具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表I中“优选替代”栏显示了保守替代。表I中提供了称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步描述的。可以将氨基酸替代掺入感兴趣抗体，并筛选产物，例如筛选期望的活性，诸如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或⑶C、等等。表I
权利要求
1.一种分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
2.权利要求I的抗体，其中所述抗体与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的抗HER4抗体单抗1479竞争对JM_a同等型的结合。
3.权利要求I的抗体，其中所述抗体结合与由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479结合的表位相同的表位。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述抗体是嵌合抗体、人抗体、或人源化抗体。
5.一种分离的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体，其中所述抗体包括来自由保藏于ATCC、编号No. PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479、特异性结合HER4 JM-a同等型的片段。
6.权利要求5的抗体，其中所述片段包含单克隆抗体单抗1479的可变区。
7.权利要求5或6的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
8.权利要求5-7任一项的抗体，其中所述抗体是亲和力成熟的。
9.一种分离的抗HER4抗体，其包含由保藏于ATCC、编号No.PTA-9655的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体单抗1479或其人源化形式。
10.权利要求1-9任一项的抗体，其中所述抗体连接至细胞毒剂。
11.权利要求1-9任一项的抗体，其中所述抗体具有比对HER4JM-a同等型不是特异性的抗HER4抗体要小的心脏毒性。
12.—种抑制表达HER4 JM-a同等型的癌细胞增殖的方法，包括使所述癌细胞与治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体接触。
13.权利要求12的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1_11任一项的分离的抗HER4抗体。
14.权利要求12或13的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
15.一种在其癌症表达HER4 JM-a同等型的患者中治疗癌症的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1_11任一项的分离的抗HER4抗体。
17.权利要求15或16的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
18.权利要求15-17任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
19.一种在患者中治疗癌症的方法，包括下述步骤 a.选择其癌性细胞表达HER4JM-a同等型的患者；并 b.对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4JM-a同等型的抗HER4抗体。
20.权利要求19的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1_11任一项的分离的抗HER4抗体。
21.权利要求19或20的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
22.权利要求19-21任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
23.一种在患者中治疗癌症的方法，包括下述步骤 a.选择其癌性细胞包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域的患者；并 b.对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4JM-a同等型的抗HER4抗体。
24.权利要求23的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1_11任一项的分离的抗HER4抗体。
25.权利要求23或24的方法，其中所述抗HER4抗体降低HER4胞外域脱落。
26.权利要求23-25任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
27.一种在具有癌症的患者中降低与癌症疗法有关联的心脏毒性的风险的方法，包括对该患者施用治疗有效量的特异性结合HER4 JM-a同等型的抗HER4抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述抗HER4抗体是权利要求1_11任一项的分离的抗HER4抗体。
29.权利要求27或28的方法，其中所述癌症过表达HER4JM-a同等型。
30.权利要求27-29任一项的方法，其中所述癌症包含与相同组织类型的非癌性细胞相比升高水平的脱落Her4胞外域。
31.权利要求27-30任一项的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、或髓母细胞瘤。
32.—种在细胞样品中检测脱落HER4胞外域的存在的方法，包括使所述细胞与特异性结合JM-a HER4同等型的抗体接触。
33.一种在患者中诊断肿瘤的方法，包括在所述肿瘤中检测脱落HER4胞外域的存在。
34.权利要求33的方法，其中所述检测包括使特异性结合HER4JM_a同等型的抗HER4抗体与自所述肿瘤获得的样品接触。
35.权利要求34的方法，进一步包括比较所述肿瘤中的脱落HER4胞外域水平与非癌性对照样品中的脱落J1ER4胞外域水平。
全文摘要
公开了可用于检测和治疗表达HER4 JM-a同等型的癌症的组合物和方法。
文档编号A61K39/395GK102725310SQ200980154676
公开日2012年10月10日 申请日期2009年11月24日 优先权日2008年11月25日
发明者克劳斯.埃伦纽斯, 梅杰.霍尔曼, 马克.X.斯利科斯基 申请人:健泰科生物技术公司, 图尔库大学