专利名称：一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种银杏提取物中总银杏酸的测定方法。
背景技术：
银杏(Ginkgo Biloba)是现存种子植物中最古老的一种，也是可上溯到2亿多年
前二世纪时的银杏家族的唯一的幸存者。在中国，银杏制剂用于治疗已有5000多年了，也
就是说，从中草药的最早起源就开始用于治疗了。自六十年代以来，银杏叶的植物提取物在
很多国家用于治疗脑血管及周围血管疾病，如德国、法国、日本和韩国。 银杏叶的主要成分是黄酮类化合物，它包括至少14种不同的化合物，例如黄酮
醇、黄酮、黄烷酮和双黄酮等等，在这些化合物中，黄酮苷和黄酮醇苷包括山奈素、槲皮素
和异鼠李素与葡萄糖或鼠李糖结合物，是市场上用于治疗目的的银杏提取物(Tebonin、
Tanakan、 Roekan或EGb761)中最显著的部分，实验表明黄酮苷和黄酮醇苷为有力的抗氧
剂，可清除氧自由基从而避免由于年龄老化而引起的细胞和组织损伤，它们会严重影响大
脑功能，包括记忆力和注意力。另外黄酮苷和黄酮醇苷也可以改善周围血管循环。 另外，除银杏黄酮外，银杏叶中另一活性成分是帖内酯，包括银杏内酯A、B、C、J、M
和白果内酯，银杏内酯为含内酯结构的帖类。最近发现由于它们拮抗血小板活化因子(PAF)
的特性，银杏内酯A、 B、 C、 M特别是白果内酯能有效地治疗血小板活化因子诱发疾病如哮
喘、支气管炎、老年性痴呆、过敏、心功能失调、风湿病等等以及其它循环系统疾病。 除上述化合物外，银杏叶至少含有12种烷基酚酸化合物，包括银杏酸，它是6-烷
基水杨酸，烷基为正13碳到正19碳有0-3个双键的烷基基团。银杏酸是银杏提取物毒性
作用的因素，这些毒性作用包括胃肠道副作用、头痛、皮肤剌激和水肿。六十年代以来，已有
多例接触过银杏叶和果实后出现过敏反应的报告，因此对银杏酚酸的准确测定对银杏类制
剂，尤其是注射剂的安全性显得十分的重要。《中国药典》2005版中对总银杏酸含量测定，在供试品溶液的制备中，直接取银杏 提取物粉末约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入石油醚(60 90°C )50ml，称定重 量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60 90°C)补足减失的重量，摇匀，滤 过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲醇2ml，密塞，摇匀，即得。色谱 分析条件色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-1%冰醋酸(90 : 10);流 速lmL/min，检测波长为310nm。本法取样量大，测定结果受到样品性状的影响比较大，，如 果样品吸潮，发粘测定的结果会明显偏低，回流时间长。《药学学报》2003年第38巻第11期的论文"高效液相色谱法测定银杏叶提取物及
其制剂中银杏酸的含量"，报道了银杏叶提取物及其制剂经石油醚提取，提取液浓縮后用石
油醚定容，HPLC直接测定.色谱分析条件色谱柱为Inertsil 0DS_2，流动相为甲醇-3%
冰醋酸溶液(92 : 8)，流速1. OmL/min，柱温40°C ，紫外检测波长310nm。《分析化学研究简报》2004年第32巻第5期的论文"银杏酸的分光光度法测定"，报
道了银杏酸粗提物经硅胶柱色谱一次预净化处理后，分光光度法在242nm或310nm波长测银杏酸，与在310nm波长处用HPLC法测量的结果相当。色谱分析条件色谱柱为Inertsil 0DS-2，流动相为甲醇_3%冰醋酸溶液(92 : 8)，流速1. OmL/min，柱温40°C ，紫外检测波长 310nm。其间需要制成几个浓度的标准溶液，测定吸光度做标准曲线；样品经硅胶柱色谱一 次预净化处理；银杏酸单体的制备及吸光系数的测定，操作比较复杂。 由于现有文献对银杏提取物总银杏酸的提取测定缺乏系统的研究，而且分析样品 制备的提取方法也存在样品取样量大、提取回流时间长、测定结果偏低的缺点，所以有必要 寻求更有效测定银杏提取物中总银杏酸的方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种取样量小，分散均匀，比较准
确的银杏提取物中总银杏酸的测定方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案 —种测定银杏提取物中总银杏酸的方法，包括以下步骤 a、取白果新酸对照品，加甲醇制成定量用对照品溶液；另取总银杏酸对照品，加甲 醇制成定位用对照品溶液； b、银杏提取物加醇溶液，超声，醇溶液用烷烃类溶剂萃取，收集烷烃类溶剂，减压 回收溶剂至干，加甲醇定容，即得供试品溶液； c、依据高效液相色谱法测定，十八烷基键合硅胶填料的柱子，甲醇1%冰醋酸溶
液=90 : 10为流动相，检测波长为310nm，流速lml/min. 取对照品溶液和供试品溶液分别进样，得到色谱图； d、计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应的色谱峰的总峰面积， 以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量，即得。 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b所述醇溶液优选为甲醇溶 液。本发明在样品制备过程中，采用了醇对银杏提取物进行溶解，优选是甲醇溶液，对样品 进行溶解，这样可以避免固体样品进行测定过程中由于酚酸成分包裹在固体中，容易导致 的不均匀，使到测定结果偏低。 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b所述甲醇溶液的体积浓度优 选为20 80 % 。可以避免烷烃溶剂进行萃取时候导致的乳化现象，分层迅速，层界面清晰； 也避免了 2相的混溶，节省了操作时间及方便了萃取的操作。最佳体积浓度为70%。
在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b中银杏提取物与醇溶液体积
比例为i : 6 i : 25，优选为i : 18。 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b中超声时间为优选20 60min。 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b中所述烷烃类溶剂优选为石 油醚。 在上述测定银杏提取物中总银杏酸的方法中，步骤b中超声后甲醇溶液用1 : 1 体积量的烷烃类溶剂的萃取4 6次，有助于充分将总银杏酸萃取出来，提高了分析的准确 度。优选萃取的次数为5次。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
1、在样品制备过程中，采用了超声提取的方法，利用超声波的空化效应、机械效应 及热效应等增强溶剂对药粉的穿透力，增加了提取物溶解和散的速度，有助于银杏提取物 中总银杏酸的溶出和分散均匀，对于物理性状不好，粘稠，结块的，难溶成分多的样品也可 提高了分析的准确度。 2、本发明的检测方法的取样量为5g，减少了取样量，实验操作更方便。 3、本发明的检测方法的样品避免直接用甲醇或石油醚溶解，而是采用石油醚萃
取，祛除了部分杂质，保护了 HPLC分析用柱子。 下面通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案
具体实施例方式
样品为银杏提取物，总银杏酸含量为705卯m。 对比例1 :实施《中国药典》2005年版本银杏提取物中总银杏酸的测定方案在供 试品溶液的制备中，直接取银杏提取物粉末约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 石油醚(60 90°C )50ml，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用石油醚(60 90°C )补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，减压回收溶剂至干，精密加入甲 醇2ml，密塞，摇匀，即得。色谱分析条件色谱柱为十八烷基键合硅胶为填充剂，流动相为 甲醇-1%冰醋酸(90 : 10);流速lmL/min，检测波长为310nm。
表1、按《中国药典》2005版测定总银杏酸结果
序 号滤液测定总银杏酸 (ppm)残渣再回流测 定总银杏酸 (ppm)滤液测定 总银杏酸RSD(%)
161370
254180
34527112.0
459720
560441 结果表明按上述方法，平行取5份样品处理后，滤液测得总银杏酸结果分别是 613卯m、541ppm、452卯m、597ppm、604卯m，且残渣再经过回流处理，均含有总银杏酸，且滤液 测定总银杏酸结果的RSDX为12.0%。表明用此法样品取样量大，回流处理时间长，样品总 银杏酸分散不均匀，导致测量结果的RSDX达到12.0%，结果的准确度不高。
实施例2 :实施本发明银杏提取物中总银杏酸的测定方案 取银杏提取物粉末约5g，精密称定，加40%甲醇溶液50ml，即银杏提取物与溶剂
5比例为l : 10，超声处理20min后，甲醇溶液用1 : l量的石油醚萃取3次，收集石油醚液， 减压回收溶剂至干，精密加甲醇溶解，定容至5ml，即得供试品溶液。十八烷基键合硅胶柱， 甲醇1%冰醋酸溶液=90 : 10为流动相，检测波长为310nm，流速lml/min。取对照品溶 液和供试品溶液分别进样，得到色谱图。以外标法计算得总银杏酸含量。平行取3份样品， 处理，测得总银杏酸581卯m， RSDX为1. 7%。 实施例3 :同实施例2所示，不同的是加60%甲醇溶液，超声处理20min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取4次。平行取3份样品，处理，测得总银杏酸620卯m， RSDX为 1. 4%。表明随着超声溶剂浓度升高到60%和萃取次数提到到4次，测量总银杏酸含量有增 加的。 实施例4 :同实施例2所示，不同的是70%甲醇溶液，超声处理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取4次，平行取3份样品，处理，测得总银杏酸677卯m， RSDX为 1. 4%。随着超声时间的增加，总银杏酸的含量也有增加。 实施例5 :同实施例2所示，不同的是70%甲醇溶液，超声处理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份样品，处理，测得总银杏酸697卯m， RSDX为 0. 98%。随着萃取次数的增加，总银杏酸的含量也有增加。 实施例6 :同实施例2所示，不同的是80%甲醇溶液，超声处理30min，甲醇溶 液用1 : 1量的石油醚萃取6次，平行取3份样品，处理，测得总银杏酸693卯m， RSDX为 1.0%。超声溶剂浓度增加到80%，萃取次数增加到6次，总银杏酸反而有微量下降。
实施例7 :同实施例2所示，不同的是加70%甲醇溶液70ml，即银杏提取物与溶 剂比例为l : 14，超声处理30min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份样 品，处理，测得总银杏酸700卯m， RSD^为0眉。 实施例8 :同实施例2所示，不同的是加70X甲醇溶液90ml，即银杏提取物与溶 剂比例为l : 18，超声处理30min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份样 品，处理，测得总银杏酸705卯m， RSDX为0. 3%。 实施例9 :同实施例2所示，不同的是加70X甲醇溶液125ml，即银杏提取物与溶 剂比例为l : 25，超声处理60min，甲醇溶液用1 : 1量的石油醚萃取5次，平行取3份样 品，处理，测得总银杏酸689卯m， RSDX为0. 7%。超声所加溶剂125ml太大，一般分析用分 液漏斗最大用250ml。超声60min，溶液温度有明显升高，容易导致结块，影响总银杏酸的分 布。
权利要求
一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法，包括以下步骤a、取白果新酸对照品，加甲醇制成定量用对照品溶液；另取总银杏酸对照品，加甲醇制成定位用对照品溶液；b、银杏提取物加醇溶液，超声，醇溶液用烷烃类溶剂萃取，收集烷烃类溶剂，减压回收溶剂至干，加甲醇定容，即得供试品溶液；c、依据高效液相色谱法测定，十八烷基键合硅胶填料的柱子，甲醇∶1％冰醋酸溶液＝90∶10为流动相，检测波长为310nm，流速1ml/min.取对照品溶液和供试品溶液分别进样，得到色谱图；d、计算供试品溶液中与总银杏酸对照品相应的色谱峰的总峰面积，以白果新酸对照品外标法计算总银杏酸含量。
2. 根据权利要求1所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b所述 醇溶液为甲醇溶液。
3. 根据权利要求2所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b所述 醇溶液的体积浓度为20 80%。
4. 根据权利要求3所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b所述 甲醇溶液的体积浓度为70%。
5. 根据权利要求l所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b中，银 杏提取物与醇溶液体积比例为1 : 6 1 : 25。
6. 根据权利要求5所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b中，银 杏提取物与醇溶液体积比例为1 : 18。
7. 根据权利要求1所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b中，超 声时间为20 60min。
8. 根据权利要求l所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b中，所 述烷烃类溶剂为石油醚。
9. 根据权利要求1或8所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于步骤b 中，超声后甲醇溶液用l:l体积量的烷烃类溶剂的萃取4 6次。
10. 根据权利要求9所述的测定银杏提取物中总银杏酸的方法，其特征在于所述萃取 的次数为5次。
全文摘要
本发明公开了一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法，包括以下步骤将银杏提取物用醇超声溶解分散，用石油醚萃取，收集石油醚，回收溶剂至干，加甲醇定容，即得。本发明采用超声提取方法，利用超声波的空化效应、机械效应及热效应等增强溶剂对药粉的穿透力，增加了提取物溶解和散的速度，有助于银杏提取物中总银杏酸的溶出和分散均匀，对于物理性状不好，粘稠，结块的，难溶成分多的样品也可提高了分析的准确度。本发明的取样量少，操作方便，样品避免直接用甲醇或石油醚溶解，而是采用石油醚萃取，祛除了部分杂质，保护了HPLC分析用柱子。
文档编号A61K36/16GK101757050SQ201010117078
公开日2010年6月30日 申请日期2010年2月23日 优先权日2010年2月23日
发明者全一思, 刘翠红, 李金华, 蔡鸿飞, 钟鸣, 黄展平 申请人:广州汉方现代中药研究开发有限公司