专利名称：一种含钆纳米粒子的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种含钆纳米粒子的制备方法。
背景技术：
根据2004-2010年《中国癌症预防与控制规划纲要》，肺癌、肝癌、胃癌等8种癌症 死亡约占中国癌症总死亡人数的80%以上。我国是肝癌的高发地区，原发性肝癌发病率占 全球的45% ，死亡率在恶性肿瘤中居第二位，5年存活率仅有5% 。肝癌的总病程大约2年半 时间，其中2年时间都是在没有症状的早期阶段，一旦出现症状多数患者就只有半年的存 活时间。如果能在早期及时发现微小病灶，及时手术切除，5年生存率可达60%-70%。在 对肝脏的影像诊断中，核磁共振成像技术(MRI，magnetic resonance imaging)与CT、ECT、 B超等其他技术相比具有更好的准确性。MRI是利用生物体不同组织在外磁场影响下产生 不同共振信号来成像的，信号强弱取决于组织内水的含量和水分子中的质子弛豫时间。MRI 可有效检测组织坏死、局部缺血和各种恶性病变(如肿瘤)，并能进行早期病变诊断和循环 系统代谢的监测，还能对器官移植等进行监测[l]。为确保临床诊断的准确性，30%以上的 MRI检查使用了对比剂来提高图像的对比度，因此对比剂成为MRI技术的重要组成部分，研 究十分活跃。 20世纪80年代中期，基于肝脏的诸多功能和特殊组成成份，研究人员开始寻找能 在肝组织内滞留时间更长、以肝脏组织细胞为特殊靶器官、同时又不被肝脏生物摄取的肝 脏特异性对比剂。国内武汉大学、兰州大学、南方医科大学、华东师范大学、华中科技大学等 单位在这方面做了很多不错的工作，主要集中在Gd水溶性聚合物的合成和超顺磁性氧化 铁(SPIO， superparamagnetic iron oxide)被动耙向纳米粒子表面包覆层的制备。
目前临床应用最广泛的MRI对比剂是含Gd顺磁性对比剂(Gd-DTPA)。但在2006 年1月，研究发现含钆磁共振成像对比剂与一种罕见的致命性疾病一肾源性纤维化皮肤 病肾源性系统纤维化(NFD， nephrogenic fib-rosing dermopathy)/(NSF， n印hr-ogenic systemicfibrosis)有关，NSF患者组织中存在严重的钆沉积。多种目前被广泛使用的Gd 对比剂都可以诱发这种疾病。Gd-DTPA早期主要用于中枢神经系统的磁共振成像，为了改善 Gd-DTPA对肝脏的造影效果，研究人员借助于多糖、多肽、生物大分子、脂质体特性对其功能 化来实现靶向作用。G. Wkabalka等在脂质体双分子层包入金属螯合物脂溶性衍生物，打破 了 Gd-DTPA仅用于中枢神经系统的局限。卓仁禧教授课题组在含钆肝靶向对比剂的研究方 面做了大量出色的工作。有研究表明采用离子交联或乳化的方法制备的Gd纳米粒子，通过 改变粒子表面电荷和粒度可以实现较好的肝被动靶向作用。 壳聚糖无毒价廉，具有良好的生物相容性和可降解性。有研究表明，用壳聚糖及其 衍生物包覆SPI0粒子或与Gd3+配位制备MRI对比剂，可显著降低其毒副作用，但对肝脏的 造影效果改善不大。甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)存在于甘草的根、茎部，无毒、廉 价。1991年，Negishi证实了大鼠肝细胞膜上含有大量的甘草次酸结合位点和少量的甘草 酸结合位点，随后国内外一些学者纷纷报道了以甘草次酸修饰的脂质体或血清蛋白可在肝脏富集。 随着人们对肝脏早期病变诊断要求的提高和对现在使用的MRI对比剂毒副作用
的深入了解，MRI对比剂在动物体内的分布规律和肝特异性识别研究显得尤为重要和迫切。 从改变肝脏对比剂的靶向作用机制和降低剂量出发，采用受体介导设计，将具有
很高肝靶向性的小分子物质如甘草次酸、胆酸和叶酸等引入可降解并具有良好生物相容性
的高分子载体上(如壳聚糖、聚氨基酸等)，通过聚电介质的静电相互作用，制备含有Gd磁
性纳米粒子，目前尚无文献报道。 本发明的目的是为了解决以上技术问题。
发明内容
本发明提供一种含Gd纳米粒子的制备方法。 采用的技术路线是利用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制备含有肝靶向基团的
聚合物，并与钆盐水溶液发生离子交联反应来制备含钆纳米粒子。 所述聚合物为壳聚糖、聚赖氨酸中的任意一种； 所述壳聚糖的分子量为2000 4乂105，脱乙酰度为30% 100% ; 所述聚赖氨酸的分子量为3000 6X 104 ; 所述肝靶向化合物为甘草次酸、胆酸、叶酸中的任意一种或其混合物；
所述钆盐为为氯化钆、硫酸钆、磷酸钆中的任意一种；
含钆纳米粒子的制备方法，包括下述步骤
1肝靶向基团修饰的聚合物的制备
1. 1羧基修饰的肝靶向化合物的合成 将肝靶向化合物溶于N， N-二甲基亚砜中，冷却，加入二异丙基碳二亚胺，搅拌后 加入N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下搅拌反应，将反应混合物倾入无水乙醇中，收集到白色 固体，用无水乙醇洗涤，再用无水乙醚洗涤，真空干燥，得活性酯； 将活性酯的N， N-二甲基亚砜溶液滴加到二元胺的溶液中，在40-8(TC下反应 14-24h，将胆酸或甘草次酸的衍生物倾入水中，叶酸的衍生物倾入四氢呋喃中，在3t:下放 置。将沉淀过滤，用少量乙醇、乙醚洗涤，干燥，然后将所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶 解，用乙醚沉淀，真空干燥，得到胺基修饰的肝靶向化合物； 将胺基修饰的肝靶向化合物溶解在丙酮中，在搅拌下滴入二元酸酐，反应3h后， 加入乙醚沉淀，将所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，再用乙醚沉淀，真空干燥，得到羧 基修饰的肝靶向化合物； 所述羧基修饰的肝靶向化合物的合成步骤中的物料配比为 肝靶向化合物二异丙基碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺为i : i.o
1. 5 : 1. 0 1. 5， mol/mo1 ; 活性酯二元胺为1 : 30 100， mol/mo1 ; 二元胺是二乙烯三胺、丁二胺的任意一种，二乙烯三胺用N， N-二甲基甲酰胺做溶 剂，丁二胺用N， N-二甲基亚砜做溶剂； 二元酸酐胺基修饰的肝耙向化合物为10 100 : l， mol/mo1 ;
二元酸酐是丙二酸酐、丁二酸酐、顺丁烯二酸酐中的任意一种。
1. 2肝靶向基团修饰的聚合物的合成 在2 10%的壳聚糖或聚赖氨酸的水溶液中，加入羧基化的肝靶向化合物和1-乙 基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐的N，N-二甲基甲酰胺的溶液，在60 10(TC 反应4 6小时，冷却后，浓縮反应液，将浓縮液倾入乙醇中沉淀，过滤，将沉淀干燥，得到含 有肝靶向基团的聚合物。 所述含肝靶向基团修饰聚合物的合成步骤中的物料配比为 壳聚糖或聚赖氨酸羧基化的肝靶向化合物i-乙基_3-(3- 二甲氨基异丙基) 碳二亚胺的盐酸盐为1 : 0.05 0.4 : 0.05 0.4，mol/mol。
2含钆纳米粒子的制备 将含有肝靶向基团修饰的聚合物的水溶液滴加到含钆盐的pH值为7. 4的磷酸缓
冲液中，超声振荡，得到分散均匀的含钆纳米粒子。 所述含钆纳米粒子的制备步骤中的物料配比为 含有肝靶向基团修饰的聚合物的水溶液的浓度为0. 05% _8%，肝靶向基团的聚 合物:钆盐为100 : 0. 5 10， m/m。 本发明的效果用于MRI核磁共振造影，可以显著提高弛豫效能，改善造影效果。
具体实施例方式
为了进一步了解本发明的内容、特点，详细说明如下
实施例l含有甘草次酸基团的壳聚糖的制备
1. 1羧基修饰的甘草次酸衍生物的合成 将4.70g甘草次酸溶于30ml N， N-二甲基亚砜中，冷却，加入二异丙基碳二亚胺 1. 26g，搅拌后加入N-羟基琥珀酰亚胺1. 15g，在室温下搅拌反应，将反应混合物倾入100ml 无水乙醇中，收集白色固体，用20ml无水乙醇洗涤，再用10ml无水乙醚洗涤，真空干燥，得 甘草次酸的活性酯； 将甘草次酸活性酯的N， N- 二甲基亚砜溶液滴加到含有28g 丁二胺的200ml N， N-二甲基亚砜溶液中，在7(TC下反应15h，将将反应液倾入1000ml水中，在3t:放置。将沉 淀过滤，用20ml乙醇、100ml乙醚洗涤，干燥，将所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶解，用 乙醚沉淀，真空干燥，得到胺基修饰的甘草次酸衍生物； 将胺基修饰的甘草次酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在搅拌下滴入含20. 04g 丁二 酸酐的150ml丙酮溶液，反应3h后，加入250ml乙醚沉淀，将所得沉淀在40ml N，N-二甲基 甲酰胺中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修饰的甘草次酸衍生物5. 82g。
1. 2含有甘草次酸基团的壳聚糖的合成 在100ml 8%的壳聚糖的水溶液中，加入3. 74g羧基修饰的甘草次酸衍生物和
1.25g l-乙基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐的20mlN，N-二甲基甲酰胺的溶
液，在8(TC反应5小时，冷却后，浓縮反应液，将浓縮液倾入乙醇中沉淀，过滤，将沉淀干燥，
得到含有甘草次酸基团的壳聚糖10. 45g。 实施例2含有胆酸基团的壳聚糖的制备 2. 1羧基修饰的胆酸衍生物的合成 将4.08g胆酸溶于30ml N，N-二甲基亚砜中，冷却，加入二异丙基碳二亚胺1. 51g，搅拌后加入N-羟基琥珀酰亚胺1. 38g，在室温下搅拌反应，将反应混合物倾入140ml无水乙 醇中，收集白色固体，用30ml无水乙醇洗涤，再用20ml无水乙醚洗涤，真空干燥，得胆酸的 活性酯； 将胆酸活性酯的N， N- 二甲基亚砜溶液滴加到含有30g 丁二胺的200ml N， N_ 二甲 基亚砜溶液中，，在7(TC下反应15h，将将反应液倾入lOOOml水中，在3t:放置。将沉淀过 滤，用25ml乙醇、100ml乙醚洗涤，干燥，将所得沉淀在N， N_ 二甲基甲酰胺中溶解，用乙醚 沉淀，真空干燥，得到胺基修饰的胆酸衍生物； 将胺基修饰的胆酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在搅拌下滴入含22g 丁二酸酐的 150ml丙酮溶液，反应3h后，加入250ml乙醚沉淀，将所得沉淀在40ml N，N- 二甲基甲酰胺 中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修饰的胆酸衍生物5. 45g。
2. 2含有胆酸基团的聚合物的合成在200ml 4X的壳聚糖的水溶液中，加入含有3.45g羧基修饰的胆酸衍生物和
0.92g l-乙基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐的20ml N，N-二甲基甲酰胺的
溶液，在8(TC反应5小时，冷却后，浓縮反应液，将浓縮液倾入乙醇中沉淀，过滤，将沉淀干
燥，得到含有胆酸基团的壳聚糖10. 02g。 实施例3含有叶酸基团的聚赖氨酸的制备 3. 1羧基修饰的叶酸衍生物的合成 将4.41g叶酸溶于30ml N，N-二甲基亚砜中，冷却，加入二异丙基碳二亚胺1. 62g， 搅拌后加入N-羟基琥珀酰亚胺1. 42g，在室温下搅拌反应，将反应混合物倾入140ml无水乙 醇中，收集白色固体，用30ml无水乙醇洗涤，再用20ml无水乙醚洗涤，真空干燥，得叶酸的 活性酯； 将叶酸活性酯的N， N- 二甲基亚砜溶液滴加到含有34g 丁二胺的200ml N， N- 二甲 基亚砜溶液中，，在7(TC下反应15h，将将反应液倾入1000ml水中，在3t:放置。将沉淀过 滤，用25ml乙醇、100ml乙醚洗涤，干燥，将所得沉淀在N， N-二甲基甲酰胺中溶解，用乙醚 沉淀，真空干燥，得到胺基修饰的叶酸衍生物； 将胺基修饰的叶酸衍生物溶解在30ml丙酮中，在搅拌下滴入含22g 丁二酸酐的 150ml丙酮溶液，反应3h后，加入250ml乙醚沉淀，将所得沉淀在40ml N，N- 二甲基甲酰胺 中溶解，再用80ml乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修饰的叶酸衍生物5. 75g。
3. 2含有叶酸基团的聚赖氨酸的合成 在300ml 2. 29%的聚赖氨酸的水溶液中，加入含有2. 78g羧基修饰的叶酸衍生物 和1.06gl-乙基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐的20ml N， N-二甲基甲酰胺 的溶液，在8(TC反应5小时，冷却后，浓縮反应液，将浓縮液倾入乙醇中沉淀，过滤，将沉淀 干燥，得到含有叶酸基团的壳聚糖9. 74g。
实施例4含钆纳米粒子的制备 将100ml含有3. Og胆酸基团修饰的壳聚糖的水溶液缓慢滴加到40ml含0. 15g氯 化钆的pH值为7.4的磷酸缓冲液中，超声振荡，得到分散均匀的含钆纳米粒子。动态光散 射测定其粒径为84nm，分散指数为0. 18，透射电镜观测粒子为规则的圆球形。
实施例5含钆纳米粒子的制备 将100ml含有2. 5g叶酸基团修饰的聚赖氨酸的水溶液缓慢滴加到40ml含0. 18g氯化钆的pH值为7. 4的磷酸缓冲液中，超声振荡，得到分散均匀的含钆纳米粒子。动态光 散射测定其粒径为64nm，分散指数为0. 22，透射电镜观测粒子为规则的圆球形。
实施例6含钆纳米粒子的制备 将100ml含有2. 7g甘草次酸基团修饰的壳聚糖的水溶液缓慢滴加到40ml含 0. 14g氯化钆的pH值为7. 4的磷酸缓冲液中，超声振荡，得到分散均匀的含钆纳米粒子。动 态光散射测定其粒径为75nm，分散指数为0. 15，透射电镜观测粒子为规则的圆球形。
实施例7含钆纳米粒子弛豫效能的测定 分别称取含钆纳米粒子及Gd-DTPA，于25ml的容量瓶中用二次蒸馏水配成一定 浓度(mmol/L)的溶液(pH= 7)，在Bruker BI0SPEC 47/30型磁共振成像仪(4. 7T)上 分别测定纯水的弛豫时间Tl(d)和样品溶液中弛豫时间Tjobsd)，方法为反转恢复法 (InversionRecovery， IR)，并计算弛豫效能&。具体测试结果如下Gd-DTPA， 1. 25mmo1/ L， VGd = 4. 97L ,1—1 s—1 ;含甘草次酸的壳聚糖纳米粒子，1. 25mmol/L， ms R/Gd = 8. 53L .mmo1—1 *s—1 ;含胆酸的壳聚糖纳米粒子，1. 25mmol/L，ms R/Gd = 11. 78L .mmo1—1 *s—1 ; 含叶酸的壳聚糖纳米粒子，1. 25,1/L， ms VGd = 9. 21L mmol—1 s—、含钆纳米粒子的 弛豫效能显著高于Gd-DTPA。
权利要求
一种含钆纳米粒子的制备方法，其特征在于使用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制备含有肝靶向基团的聚合物，并与钆盐水溶液发生离子交联反应来制备含钆纳米粒子；所述肝靶向化合物为甘草次酸、胆酸、叶酸中的任意一种或其混合物；所述含氨基的聚合物为壳聚糖、聚赖氨酸中的任意一种；所述壳聚糖的分子量为2000～4×105，脱乙酰度为30％～100％；所述聚赖氨酸的分子量为3000～6×104；所述钆盐为为氯化钆、硫酸钆、磷酸钆中的任意一种。
2. 按照权利要求1所述的含钆纳米粒子的制备方法，其特征在于含有肝靶向基团的聚 合物的合成，包括下述制备步骤2. 1羧基修饰的肝靶向化合物的合成将肝靶向化合物溶于N， N-二甲基亚砜中，冷却，加入二异丙基碳二亚胺，搅拌后加入 N-羟基琥珀酰亚胺，在室温下搅拌反应，将反应混合物倾入无水乙醇中，收集到白色固体， 用无水乙醇洗涤，再用无水乙醚洗涤，真空干燥，得活性酯；将活性酯的N， N- 二甲基亚砜溶液滴加到二元胺的溶液中，在40-8(TC下反应14-24h， 将胆酸或甘草次酸的衍生物倾入水中，叶酸的衍生物倾入四氢呋喃中，在3t:下放置。将沉 淀过滤，用少量乙醇、乙醚洗涤，干燥，然后将所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，用乙 醚沉淀，真空干燥，得到胺基修饰的肝靶向化合物；将胺基修饰的肝靶向化合物溶解在丙酮中，在搅拌下滴入二元酸酐，反应3h后，加入 乙醚沉淀，将所得沉淀在N， N- 二甲基甲酰胺中溶解，再用乙醚沉淀，真空干燥，得到羧基修 饰的肝靶向化合物；2. 2从羧基修饰的肝靶向化合物合成肝靶向基团修饰的聚合物在2% 10%的壳聚糖或聚赖氨酸的水溶液中，加入羧基化的肝靶向化合物和1-乙 基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐的N，N-二甲基甲酰胺的溶液，在60 10(TC 反应4 6小时，冷却后，浓縮反应液，将浓縮液倾入乙醇中沉淀，过滤，将沉淀干燥，得到含 有肝靶向基团的聚合物。
3. 按照权利要求2所述的含有肝靶向基团的聚合物的合成，其特征在于物料配比为 在2. l所述的羧基修饰的肝靶向化合物的合成中，肝靶向化合物二异丙基碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺为1 : 1. 0 1. 5 : l. 0 l. 5， mol/mo1 ; 活性酯二元胺为1 : 30 100， mol/mol ;二元胺是二乙烯三胺、丁二胺的任意一种，二乙烯三胺用N， N-二甲基甲酰胺做溶剂， 丁二胺用N， N- 二甲基亚砜做溶剂；二元酸酐胺基修饰的肝靶向化合物为10 100 : 1， mol/mol ; 二元酸酐是丙二酸酐、丁二酸酐、顺丁烯二酸酐中的任意一种；在2. 2所述的从羧基修饰的肝靶向化合物合成肝靶向基团修饰的聚合物中，壳聚糖或 聚赖氨酸羧基化的肝靶向化合物i-乙基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺的盐酸盐 为l : 0. 05 0. 4 : 0. 05 0. 4， mol/mol 。
4 照权利要求1所述的含钆纳米粒子的制备方法，其特征在于含有肝靶向基团的聚 合物与钆盐水溶液发生离子交联反应来制备含钆纳米粒子，包括下述制备步骤将含有肝靶向基团修饰的聚合物的水溶液滴加到含钆盐的PH值为7. 4的磷酸缓冲液中，超声振荡，得到分散均匀的含钆纳米粒子。
5.按照权利要求4所述的含钆纳米粒子的制备方法，其特征在于物料配比为 含有肝靶向基团修饰的聚合物的水溶液的浓度为0.05% 8% ;肝靶向基团的聚合物钆盐为ioo : o. 5 io， g/g。
全文摘要
一种含钆纳米粒子的制备方法，发明属于生物医学领域。使用肝靶向化合物和含氨基的聚合物制备含有肝靶向基团的聚合物，并与钆盐水溶液发生离子交联反应来制备含钆纳米粒子。这种含钆纳米粒子用于MRI核磁共振造影，可以显著提高弛豫效能，改善造影效果。
文档编号A61K49/12GK101757642SQ20101011659
公开日2010年6月30日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者张旖倩, 查瑞涛, 王立军 申请人:天津科技大学