骨生成诱导因子的用途的制作方法

专利名称：骨生成诱导因子的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质应用领域，尤其涉及一种骨生成诱导因子的用途。
背景技术：
胃帛(osteoinductive factor OIF), osteoglycin mimecan, 是一种分泌蛋白，最早是从牛的骨基质中分离出的一 12KDa的蛋白质。其生物学功能尚不明确。在牛的组织内因不同的剪接或PolyA位点的不同而形成多种OIF异形体，但这些不同长度的OIF基因异形体中，其编码的蛋白质结构完全相同，而且该基因在不同物种之间， 结构也是高度保守的，这提示OIF蛋白在生物体内可能具有重要的功能。人的OIF基因编码298个氨基酸的分泌蛋白前肽，与牛的OIF同源性达86%，其第1_19位为信号肽结构， 20-193位为前肽，成熟区在194-298位，由105个氨基酸残基组成，在1M-260位有6个重复的亮氨酸富集区。对OIF最早的研究认为OIF可能与骨的代谢调节有关，但在OIF基因剔除的小鼠模型中发现，剔除后的小鼠能正常发育，不影响其生育；与野生型小鼠相比，其骨骼发育无明显异常，说明OIF在骨代谢调节中可能不起重要的作用。在OIF基因剔除的小鼠中，仅发现角膜和皮肤的胶原纤维的直径增粗，皮肤的抗张力下降。与此同时，国际上一些研究组对 OIF基因的转录调控机制进行了深入的研究，发现在OIF基因上游中，含有3个起始元件，一个E盒(E-box)和Oct-1、NF-nB、金属反应元件(MRE)结合位点，而在该基因的第一个内含子中，含有该基因转录调控的增强子和沉默子序列。进一步研究发现，在OIF基因第一个内含子区含有P53基因的结合位点，而且P53可以增强OIF基因的转录活性。由此可见OIF在人体的生理过程中可能发挥着重要作用。虽然OIF是一种重要的分泌蛋白，但目前对OIF基因的功能尚不清楚。因此，本领域迫切需要了解OIF的生理作用，并提供相应的应用。

发明内容
本发明旨在提供一种OIF的用途。在本发明的第一方面，提供了骨生成诱导因子(osteoinductive factor, 0IF)在制备抑制食欲的药物中的用途。在另一优选例中，所述的骨生成诱导因子为人骨生成诱导因子；所述的人骨生成诱导因子选自野生型人骨生成诱导因子、或重组人骨生成诱导因子；更佳地，所述的人骨生成诱导因子是OIF核心蛋白片段、或OIF成熟蛋白片段。所述人骨生成诱导因子核心蛋白片段如SEQ ID NO :1所示(AKYNKIKSRGIKANAFKK LNNLTFLYLDHNALESVPLNLPESLRVIHLQFNNIASITDDTFCKANDTSYIRDRIEEIRLEGNPIVLGKHPNSFIC LKRLPIGSYF)。所述人骨生成诱导因子成熟蛋白片段如SEQ ID N0:2所示(PNEKSU1LQKDEAITPLP PKKENDEMPTCLLCVCLSGSVYCEEVDIDAVPPLPKESAYLYARFNKIKKLTAKDFADIPNLRRLDFTGNLIEDIEDGTFSKLSLLEELSLAENQLLKLPVLPPKLTLFNAKYNKIKSRGIKANAFKKLNNLTFLYLDHNALESVPLNLPESLR VIHLQFNNIASITDDTFCKANDTSYIRDRIEEIRLEGNPIVLGKHPNSFICLKRLPIGSYF)。在本发明的第二方面，提供了一种组合物，所述的组合物含有有效量的骨生成诱导因子。在另一优选例中，所述的骨生成诱导因子为人骨生成诱导因子；所述的人骨生成诱导因子选自野生型人骨生成诱导因子、或重组人骨生成诱导因子；更佳地，所述的人骨生成诱导因子是OIF核心蛋白片段、或OIF成熟蛋白片段。据此，本发明提供了 OIF的应用。


图1显示了 OIF核心蛋白对C57BL/6J小鼠食欲的影响。图2显示了 OIF核心蛋白对db/db小鼠食欲的影响。图3显示了 OIF核心蛋白对KKAy小鼠食欲的影响。图4显示了 SD大鼠侧脑室注射OIF核心蛋白对食欲的影响。图5显示了 OIF成熟蛋白(HIS-OIF)对C57BL/6J小鼠食欲的影响。
具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，发现0IF，尤其是人OIF的两个不同大小蛋白片段，即OIF成熟蛋白和OIF核心蛋白具有抑制动物食欲的作用。在此基础上，完成了本发明。具体地，发明人构建和表达了两种不同大小的人OIF蛋白，分别命名为人OIF成熟蛋白(如SEQ ID NO :2所示，26. 4KD，66-298位氨基酸，)或同其氨基酸序列基本相同；和人OIF核心蛋白(如SEQ ID NO :1所示，12KD，194-298位氨基酸，)或同其氨基酸序列基本相同。人OIF全长cDNA序列的GenBank登录号为AF100758。术语“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变(缺失、增加、取代)引起的不同，但这种改变基本上不降低其生物学活性，即可以通过结合OIF靶细胞受体而发生生物学功能。任何符合“基本相同”要求的OIF均包括在本发明内，无论它是糖基化的(即来源于天然的或来源于真核生物表达系统的)或是非糖基化的(即来源于原核生物表达系统或化学合成的)。术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质 (predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的0IF。术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的His-OIF或MBP-OIF 的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随His-OIF或MBP-OIF的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。His-OIF的功能代表人OIF成熟蛋白的功能；MBP-OIF的功能代表人OIF核心蛋白的功能。本发明所引用参考资料的技术内容就其整体一并引入本文作为参考。可用于表达或克隆本发明的His-OIF或MBP-OIF的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。适用的原核宿主细胞包括，但不限于G+或G—菌，如大肠杆菌E. coli.，能够通过公共途径得到的E. coli.菌株包括K12 MM294(ATCC31，446)、 X1776(ATCC31,537), W3110 (ATCC27, 325)和 K5772 (ATCC53，635，JM109, DH5 α，B 株系列，Β834, BL21, BLR等。其他可用的原核细胞包括但不限于欧式杆菌(Erwinia)、克雷伯杆菌(Klebsiella)、变形杆菌(Proteus)、沙门杆菌(Salmonella)如鼠伤寒杆菌 (Salmonellatyphimurium)、沙雷菌属(Serratia)如粘质沙雷菌(Serratiamarcescans)、 志贺菌属Shigella)、枯草杆菌.(B. subtilis)、地衣芽胞杆菌(B. Iicheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)如绿胺杆菌(P. aeruginosa)、链球菌(Streptomyces)0 E. coli. W3110因其常被用作重组DNA产品的发酵宿主而被推荐为优选。除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌(filamentousfimgi)或酵母菌 (yeast)等同样适用于表达或者克隆本发明的His-OIF或MBP-0IF。酿酒酵母菌 (Saccharomyces)就是一种常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌 (Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母菌(Kluyveromyceshosts)；巴氏毕赤酵母菌 (PichiaPastoris)；念珠菌(Candida) ；Trichodermareesia ；脉胞菌(Neurosporacrassa)； 施万异样霉菌(schwanniomyces)如 Schwanniomycesoccidentalis ；丝状真菌 (f ilamentousfungi)如 Neurospora,青霉菌(Penicillium), Tolypocladium,曲霉菌 (Aspergillus)如 A. nidulans ;Tilburmetal. ；Yeltonetal.禾口黑曲霄(A. niger)。甲基营养酵母菌(Methylotropicyeasts)同样可用于表达本发明的His-OIF或MBP-0IF，包括但不限于各种能够在甲醇中生长的酵母菌如汉逊酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，毕赤酵母菌(Pichia)，酿酒酵母菌(Saccharomyces)，球拟酵母菌 (Torulopsis)，红酵母菌(Rhodotorula)。用于表达糖基化的本发明的His-OIF或MBP-OIF的宿主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如DrOSOphilaS2和SpodopteraSfl植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞。特别是，经SV40转化的猴肾CVl细胞株(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚胎肾细胞株四3 ； CH0/-DHFR(UrlaubandChasin)；小鼠睾丸滋养细胞(TM4)；人肺细胞(WI38，ATCCCCL75)；人肝细胞OfepG2，HB8065)；小鼠乳腺癌细胞(MMT060562，ATCCCCL51)。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。上述宿主细胞经His-OIF或MBP-OIF表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基(nutrientmedia)中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子(promoter)、 选择性转化体(selectingtransformant)或者扩增His-OIF或MBP-OIF编码基因序列。培养条件如培养基、温度、PH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见Mammalian Cell Biotechnology a PracticalApproach, Μ. Butler, ed. (IRLPress,1991)and Sambrooketal. , supra.。本领域的普通技术人员应熟知真核细胞转染和原核细胞转化的方法，例如CaCl2法、磷酸钙沉淀法、脂质体媒介法或电穿孔法。根据使用的宿主细胞的不同，本领域的普通技术人员可选择相应的标准转化技术，例如CaCl2法(Sambrooketal.，supra.)或电穿孔法通常用于原核细胞；根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)感染主要用于某些植物细胞的转化(Shawetal.，Gene，23 :315 (1983) and W089/05859)；对于没有细胞壁的哺乳动物细胞， 则可以使用磷酸钙沉淀法(GrahamandvanderEb，Virology, 52 :456-457(1978))；有关哺乳
5动物宿主细胞转染的全面描述可参见U. S. Pat. N. . 4，399，216。有关如何转化酵母细胞可 #JAL Van Solingenetal. ， J. Bact. ，130 946 (1977)禾口 Hsiaoetal. ， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 :3829(1979).。其他将DNA引入细胞的方法，如核酸微量注射、电穿孔、完整细菌细胞原生质体融合(bacterialprotoplastfusion with intactcells)、或者聚阳离子法 (polycations)如1，5_ 二甲基_1，5-二氮4^一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚鸟氨酸 (polyornithine)等皆可用于本发明中。有关各种哺乳动物细胞转化技术的描述可参见 Keownetal. , MethodsinEnzymology,185 :527-537(1990)禾口 Mansouretal. , Nature,336 348-352(1988)。编码本发明的OIF的核苷酸序列(即cDNA或基因组DNA)可被插入一可复制载体applicable vector)进行基因克隆(DNA扩增)或者表达。各种载体如质粒、粘粒 (cosmid，装配型质粒)、病毒颗粒或噬菌体等均可通过公共途径获得。运用本领域的公知技术，可将本发明的OIF的编码核苷酸序列按常规步骤插入可复制载体上适宜的限制性核酸内切酶位点。一个可复制载体通常包括但不限于以下部件一条或多条信号序列(signal sequence), 一个复制起点(origin ofreplication),一条或多条标记基因(marker gene), 一个增强子元件(enhancerelement)，一个启动子(promoter)，以及一段转录中止序列 (transcriptiontermination sequence)。本领域的普通技术人员可运用本领域标准的连接技术(ligation techniques)构建含有一个或多个上述部件的合适的可复制载体。本发明的His-OIF或MBP-OIF不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种多肽形成融和多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。通常情况下，这段信号序列是上述可复制载体的一部分，或者它也可以是插入可复制载体的本发明的His-OIF或MBP-OIF编码核苷酸序列的一部分。所述信号序列可以是原核信号序列，例如碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp，或者热稳定肠毒素II前导序列。在酵母分泌系统(yeast secretion)中，该信号序列可以是酵母转化酶前导序列(yeast invertase leader), α因子前导序列(包括酿酒酵母菌和克鲁维酵母菌α因子前导序列，参见 U. S. Pat. No. 5，010，182)，或酸性磷酸酶前导序列，C. albicans葡萄糖淀粉酶前导序列 (EP362, 179)。在哺乳动物表达系统中，哺乳动物信号序列可直接用于分泌目标蛋白质，此类序列包括来源于相同或相近物种哺乳动物分泌蛋白的信号序列以及病毒分泌前导序列。表达载体和克隆载体均含有一段核苷酸序列，该序列使载体能够在一个或多个相应的宿主细胞内复制。与各种细菌、酵母或病毒宿主细胞对应的核苷酸序列为本领域普通技术人员所公知。例如，质粒PBR322的复制起点适用于大多数G—细菌，2.mu.质粒复制起点适用于酵母细胞，而各种病毒复制起点(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)则适用于哺乳动物细胞内的克隆载体。表达载体和克隆载体通常含有一段选择基因，又名“选择标记”。典型的选择基因编码产生的蛋白质(a)对某些抗生素或毒素如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四环素等具有抗性；(b)能弥补营养缺陷型缺乏(auxotrophicdeficiencies) ； (c)补充复合型培养基不能提供的关键营养物质如杆菌宿主细胞需要的D-丙氨酸消旋酶的编码基因。适用于哺乳动物宿主细胞的选择基因应该可以将有能力吸纳本发明的His-OIF 或MBP-OIF编码基因的宿主细胞区分出来，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。适用的以野生型DHFR为选择基因的宿主细胞是无DHFR活性的CHO细胞株，该细胞株的制备及繁殖方法可参见 Urlaubetal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :4216 (1980)。适用于酵母细胞的选择基因是在酵母质粒Yrp7中表达的trpl基因(Minchcombet al. ,Nature, 282 :39(1979)； Kingsmanetal. , Gene, 7 141 (1979) ；Tschemperetal. , Gene,10 157 (1980))。trpl 基因可用于筛选不能在色氨酸中生长的酵母菌突变株如ATCCNo. 44047或PEP4-1 (Jones， Genetics,85 :12(1977))。表达载体和克隆载体通常含有一个可人工操纵地连接到本发明的His-OIF或 MBP-OIF编码核苷酸序列上的启动子，以指导mRNA的合成。与各种宿主细胞对应的启动子为本领域普通技术人员所公知。适用于原核宿主细胞的启动子包括内酰胺酶和乳糖启动子系统(Changetal. ,Nature, 275 :615(1978) ；Goeddeletal.，Nature, 281 :544(1979)), 碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel, Nucleic Acids Res.，8 :4057(1980)； EP36, 776)，杂合启动子如 tac 启动子(deBoeretal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 21-25(1983))。细菌宿主细胞启动子同样包含一段可人工操纵地连接到本发明的His-OIF 或MBP-OIF编码基因序列的Shine-Dalgarno (S. D.)序列。适用于酵母宿主细胞的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzemanet al.，J. Biol. Chem.，255 :2073 (1980))或其他糖酵解酶的启动子(Hessetal.，J. Adv. EnzvmeReg.，7 :149(1968) ；Holland, Biochemistry, 17 :4900 (1978)),如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，葡糖磷酸异构酶，和葡糖激酶。还有一些可诱导的酵母启动子，它们能更好地根据生长情况来调节转录，包括醇脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酶，氮素代谢相关降解酶，金属硫蛋白，甘油醛-3-磷酸， 麦芽糖和半乳糖代谢酶等的启动子。有关适用于酵母表达系统的载体和启动子的进一步描述参见EP73, 657ο启动子可以控制哺乳动物宿主细胞内可复制载体上本发明的His-OIF或MBP-OIF 编码基因序列的转录。所述启动子包括来自于多形瘤病毒，禽痘病毒(UK2，211，504)，腺病毒，牛乳头(状)瘤病毒，禽类肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙肝病毒，或猿猴空泡病毒(SV40)等病毒基因组的启动子，来自于异种哺乳动物的启动子如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，以及来自于热休克蛋白的启动子，前提是这些启动子同宿主细胞表达体系相容。通过在可复制载体中插入增强子可增强本发明的His-OIF或MBP-OIF的编码核苷酸序列在高等真核生物表达体系中的转录。增强子是一种DNA分子的顺式作用元件，通常为10到300个bp，通过作用于启动子而增强DNA分子的转录。目前已知很多增强子序列来自于哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，α-胎蛋白，胰岛素)。而使用较多的是来自于真核病毒细胞的增强子，如位于复制起点下游(Iateside)的SV40增强子 (100-270bp)，巨细胞病毒早期启动子增强子，位于复制起点下游的多形瘤病毒增强子，腺病毒增强子。增强子可被剪切插入位于可复制载体上的本发明的His-OIF或MBP-OIF的编码核苷酸序列的5’端或3’端，优选位于启动子的5’端。真核宿主细胞(酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞、人类细胞， 或者来源于其他多细胞有机体的有核细胞)中的表达载体同样含有中止转录和稳定mRNA
7所需的核苷酸序列。此类序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端，有时也可取自3’端。所述“非翻译区”包含的核苷酸片段可转录产生位于本发明的His-OIF或 MBP-OIF mRNA非翻译区的聚腺苷酰化片段。其他可在重组脊椎动物培养体系中用于合成本发明的His-OIF或MBP-OIF的方法、载体和宿主细胞可参见 Gethingetal.，Nature, 293 :620-625(1981) ；Manteietal.， Nature, 281 :40-46(1979) ；EP117, 060 ；以及 EP117, 058。本发明的OIF的编码核苷酸序列可被应用于基因治疗中。在基因治疗过程中，基因被导入细胞中以期在体内合成具有治疗效果的基因表达产物，比如替代原有的缺陷基因。“基因治疗”包括传统的基因疗法，即通过一次治疗而长期有效；也包括给予基因治疗药物，后者包括一次或者多次地给予有效的DNA或者mRNA。反义RNA和DNA亦可被用作基因治疗药物以阻断体内某些基因的表达。业已证实，尽管反义寡核苷酸短片段被细胞膜吸收有限，导致其胞内浓度降低，它仍然可以在细胞内发挥抑制剂的作用(Zamecniketal.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA83 :4143-4146 [1986]))所述寡核苷酸片段经修饰例如用不带电荷的基团取代其带负电荷的磷酸二酯基团后，可提高其细胞膜吸收度。本发明的His-OIF或MBP-OIF可被用作治疗药物。本领域的普通技术人员可按本领域的常规方法将其制备成各种药学上有效的制剂(formulation)，其中包含有效量的 His-OIF或MBP-OIF和可药用载体。当制成冻干制剂或溶液剂时，本发明的药物组合物中还需要加入其他一些生理上可接受的载体、赋形剂、稳定剂等以便于储存(Remington，sPharmaceutical Sciencesl6thedition, Osol，A. Ed. (1980))。所述“生理上可接受”的载体、赋形剂、稳定剂等其药用剂量和浓度应对给药对象(人、鼠及其他哺乳动物)无毒，包括缓冲剂如磷酸盐、 柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂如抗坏血酸(VitC)；低分子量(少于10个氨基酸残基) 多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，氨基酸如氨基乙酸、谷氨酸盐、天冬酰胺酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖或糊精；鳌合剂如EDTA ；糖醇(sugaralcohols)如甘露醇、山梨醇；成盐抗衡离子(counterions)如钠离子；和/或非离子型表面活性剂如TWEEN. TM.，PLUR0NICS. TM.或 PEG 等。含有本发明的His-OIF或MBP-OIF的制剂在体内给药前必须经过灭菌。该步骤可在冻干和再组成(reconstitution)之前或之后借助灭菌过滤膜(sterile filtration membranes)过滤完成。本发明的药物组合物通常被置于一配备有“灭菌入口”(sterileaccessport) 的容器中，例如，一个有瓶塞的静脉溶液瓶，所述塞子可被皮下注射针穿透。本发明的药物组合物可按本领域的常规途径给药，包括但不限于静脉注射或输注、腹腔注射、脑内注射、肌内注射、眼内注射、动脉注射或输注、局部给药或者通过缓释系统 (sustainedreleasesystems)给药。本发明的药物组合物的剂量和浓度范围可因实际使用情况的不同而变化。本领域的普通技术人员应知如何根据实际需求去选择合适的剂量和给药途径。本发明人所做的动物实验已为His-OIF或MBP-OIF在人体的用量范围提供了一个可信的指导。对于不同种系，例如人和鼠之间药物剂量范围的调整原则，可参见 Mordenti,J. and Chappe 11, W. "The use of interspecies scaling intoxicokinetics，，InToxicokinetics and New Drug Development, Yacobietal. ；PergamonPress, NewYork 1989，pp. 42-96.。当本发明的His-OIF或MBP-OIF体内给药时，其通常剂量范围为每天 0. 01uM/kg/d-0. luM/kg/d 哺乳动物体重，优选范围 0. 025uM/kg/d-0. 05uM/kg/d，根据给药途径的不同而有所不同。可以预见的是，不同的His-OIF或MBP-OIF制剂将对抑制食欲有效；当药物作用靶点(器官或组织)发生变化时，给药方式也需要做相应的调整。含有本发明的His-OIF或MBP-OIF的微胶囊可用于本发明的His-OIF或MBP-0IF 的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2 和 MNrgpl20(Johnsonetal.，Nat. Med.，2 :795-799(1996)； Yasuda, Biomed. Ther27 :1221-1223 (1993) ；W097/03692, W096/40072, W096/07399 ； U. S. Pat. No. 5654010o本发明的His-OIF或MBP-OIF的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis, "Controlled release of bioactiveagentsformlactide/glycolide polymer, " in :M. ChasinandR. Langer(Eds. ), Biodegradable Polymersas Drug Delivery Systems(MarcelDekkerNewYork,1990), pp. 1-41))。本发明的His-OIF或MBP-OIF还可用各种活化的分子量为5，000-100，000的聚乙二醇(PEG)修饰以使之高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见GreenWaldetal.， Bioorg.Med.Chem. Lett. 1994,4,2465 ；Calicetietal. ， ILFarmaco,1993,48,919 ； ZalipskyandLee,《聚乙二醇化学生物技术与生物医学应用》，J. M. Harris编， PlenumPress, N. Y.，1992。优选使用多臂树杈型活性 PEG(CNZL02101672. 0，W09932139, PCT/US95/0755, PCT/US94/13013, USPat :4，640，835，4，496，689，4，301，144，4，670，417， 4，791，192，4，179，337)。本发明的His-OIF或MBP-OIF还可以做成“嵌合分子”(ChimericMolecule)或融合蛋白(Fusion Protein)，从而增强其生物学活性或延长其体内的生物半衰期。比如与人的整个和部分免疫球蛋白基因(Fe)相连进行表达。“嵌合分子”中His-OIF或MBP-OIF的部分可以用整个或部分His-OIF或MBP-OIF cDNA序列。生产表达Fc融合蛋白可见USI^at 5，428，130。本发明的His-OIF或MBP-OIF基因可以放在Fc的N-末端，也可以放在Fc的 C-末端进行表达。共价修饰的His-OIF或MBP-OIF蛋白质也包括在本发明内。化学共价修饰包括改变N-末端或C-末端或其他氨基酸加上一个化学分子。这种修饰也包括改变His-OIF或 MBP-OIF的氨基酸序列。改变His-OIF或MBP-OIF本身的糖基化状态(Glycosalytion)，包括增加糖基化或减少糖基化，或者直接通过化学反应改变糖基化状态。其他制剂技术如纳米制剂、喷雾剂、吸入剂等同样包括在本发明的保护范围之内。 在本发明的一个优选例中，发明人采用Novagen公司pET48a(+)载体融合人OIF成熟蛋白序列，构建和表达出His-OIF原核蛋白(约31KD)。同时发明人采用NEB公司pMAL-ch载体融合人OIF核心蛋白序列，构建和表达出MBP-OIF原核蛋白(约55KD)。通过优化诱导表达和综合应用各种层析技术(亲和、离子交换、分子筛、置换缓冲液、脱内毒素等)，得到了大量高纯度低毒素残留的His-OIF和MBP-OIF原核蛋白。本发明提供的OIF可用于非治疗目的的食欲和能量代谢的调节。如运动员训练、满足表演工作者或普通人的塑型要求等。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于首次发现人骨生成诱导因子中的核心蛋白(MBP-OIF)片段和成熟蛋白(His-OIF)片段具有抑制哺乳动物食欲的作用。下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在 100毫升的溶液中溶质的重量。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1OIF核心蛋白(MBP-OIF)抑制实验动物食欲的研究首先发明人在正常C57小鼠进行了实验。三组C57BL/6J小鼠(8W，n = 8)过夜饥饿后，腹腔分别注射OIF蛋白(MBP-0IF,0. 05 μ M/kg)和对照蛋白(ΜΒΡ,Ο. 05 μ M/kg)以及 PBS。*P < 0. 05表示MBP-OIF组与MBP组、MBP-OIF组与PBS组累计进食量有统计学差异。 而MBP组与PBS组累计进食量几乎完全一致，没有统计学差异(图1)。同时发明人从南京大学模式动物研究所购得db/db雄性小鼠10只(5W)，予适应性喂养一周后随机均分成二组。一组注射MBP-OIF(剂量为0. 05 μ M/kg)，另一组为对照，注射MBP (剂量为0. 05 μ M/kg)。连续三天腹腔注射，每天两次，发现MBP-OIF组进食量明显减少，**P < 0. 001(图 2)。随即发明人又从中科院上海实验动物中心购买清洁级雄性KKAy小鼠10只，自由进食适应一周后进行实验。将10只小鼠随机均分成二组行腹腔注射，一组为MBP-OIF(剂量为％ig/kg)，另一组为对照，注射MBP (剂量为3. 2mg/kg)。观察每小时两组小鼠的进食变化。发现两组间进食量有显著性差异，*P < 0. 05表示MBP-OIF组与MBP组累计进食量有统计学差异。(图3)为了更进一步观察OIF对食欲的调节作用，发明人在SD大鼠侧脑室注射OIF蛋白观察大鼠的食欲变化。大鼠脑室置管后恢复一周，待食欲等指标恢复正常后饥饿Mh，然后从留置管给两组大鼠分别注射MBP-OIF (24 μ g/只，n = 7)和MBP (24 μ g/只，n = 7)，观察进食量。*Ρ < 0. 05表示MBP组累计进食多于MBP-OIF组，且有统计学差异(图4)。实施例2OIF成熟蛋白(His-OIF)抑制实验动物食欲的研究发明人在正常C57BL/6J小鼠进行了实验。两组C57小鼠(8周)过夜饥饿后，腹腔分别注射 OIF 蛋白(HIS-0IF,0. 05yM/kg,n = 5)和 PBS (η = 4)，观察食欲。*P < 0. 05 表示HIS-OIF组累计进食量明显少与PBS组，两组差异有统计学意义(图5)。以上实验结果表明，无论是OIF核心蛋白(如SEQ ID NO 1所示，12KD，194-298位氨基酸)、还是成熟蛋白(如SEQ ID NO :2所示，26. 4KD，66-298位氨基酸)，都能显著地抑制哺乳动物的食欲。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
权利要求
1.骨生成诱导因子(osteoinductivefactor,OIF)在制备抑制食欲的药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的骨生成诱导因子为人骨生成诱导因子。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的人骨生成诱导因子选自野生型人骨生成诱导因子、或重组人骨生成诱导因子。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的人骨生成诱导因子是OIF核心蛋白片段、或OIF成熟蛋白片段。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述人骨生成诱导因子核心蛋白片段如SEQ ID NO 1 所示。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述人骨生成诱导因子成熟蛋白片段如SEQ ID NO 2 所示。
7.一种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的骨生成诱导因子。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的骨生成诱导因子为人骨生成诱导因子。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述的人骨生成诱导因子选自野生型人骨生成诱导因子、或重组人骨生成诱导因子。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的人骨生成诱导因子是OIF核心蛋白片段、或OIF成熟蛋白片段。
全文摘要
本发明公开了骨生成诱导因子的用途。所述的用途是用于抑制哺乳动物的食欲。
文档编号A61P3/04GK102188694SQ20101012159
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月11日 优先权日2010年3月11日
发明者姜鹤, 宋怀东, 操黄明, 李圣贤, 马俊花 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院