一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法

专利名称：一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，特别是一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶 基因的方法。
背景技术：
溶菌酶广泛存在于生物体的各种器官、组织、血清或唾液，在动植物、噬菌体等生 物体内都有发现。迄今相关的报道如番木瓜溶菌酶、鼠来源溶菌酶、狗来源溶菌酶、鸟类溶 菌酶、T4溶菌酶、P22溶菌酶、蛋清溶菌酶等，有上百种之多等。其中蛋清中的溶菌酶含量 尤为丰富，占蛋清总蛋白的3. 4% 3. 5%，研究文章也最多。蛋清溶菌酶是一种碱性蛋白 质，其分子量为14000，最适pH为6 7，具有耐热、耐酸的特点。如在pH3.0时，96°C加热 溶菌酶15min仍有85%以上的酶活性。但在碱性pH时酶的活性破坏很快，酶的热稳定性 也差。溶菌酶最早于1922年左右由Fleming等人发现并发表了相关研究论文，此后，研究 者们对溶菌酶进行了广泛而深入的研究，特别是对溶菌酶的作用方式、催化动力学、活性中 心结构、免疫学，甚至对溶菌酶的晶体结构等各个方面进行了深入研究，发表了大量的论文 和专利。研究发现，溶菌酶是一种非特异性免疫分子，能够提高机体的免疫功能，同时还具 有抗肿瘤、抗病毒、改善和增强巨噬细胞的吞噬和消化等许多功能。但是溶菌酶更多的还是 作为杀菌功能的应用。溶菌酶的杀菌作用是以裂解细菌细胞壁的N-乙酰胞壁酸(NAM)和 N-乙酸葡萄糖酸(NAG)间的(1-4)糖苷键而使细菌裂解而杀灭细菌。然而溶菌酶的杀菌 功能在作用于一类人畜易感疾病的金葡菌时却难以凑效，对一些易致病的阴性菌(如大肠 杆菌)也难有强的杀灭作用，表现出杀菌谱不广、效率不高的局限。此后，许多研究者开始 对溶菌酶进行定点突变，开展有目的的溶菌酶基因改造研究，希望能够克服或者改善上述 不足。但实际情况是虽有改善但效果不显著。所以，为解决杀菌谱问题，在实际应用中常需 要与其他杀菌物质的配伍，如添加抗生素，或添加聚磷酸、甘氨酸、生物碱等，以此来增加杀 菌效果，这些物质就成了溶菌酶杀菌效果的增效剂使用。人源溶菌酶是溶菌酶的一种来源， 研究发现，人源溶菌酶的基因DNA序列与蛋清溶菌酶十分相似，仅多了一个氨基酸，分子中 同样含有八个半胱氨酸，半胱氨酸两两相互折叠形成四对二硫键，活性位点也相同。除若干 个别氨基酸有变化外，酶的作用方式和功能相同。与蛋清溶菌酶相比，人源溶菌酶作用溶壁 微球菌的活性要高出蛋清溶菌酶3倍，表明其功能不容小视。但从人身上大量获取人源溶 菌酶显然不现实。所以，不少研究者开始利用基因工程技术克隆人源溶菌酶基因，并在不同 表达系统中表达人源溶菌酶[Agric Biol Chem, 1986, 50 (3) :713 723 ;Gene，1987，56 53-59 ；Appl Microbiol Biotechnol，1992，38 109-114 ；J. FEBS Letters,2001,506(1) 27-32 ；动物医学进展，2009，30 (4) :5_7 ；科学通报，48 (20) =2149-2153] 0人溶菌酶除活性 比蛋清溶菌酶高以外，也同样存在杀菌谱不广的问题。克服杀菌谱不广的出路何在？寻找 生物活性肽(biologically active ρ印tides，常称功能肽)是一个重要发现。如抗菌肽 (Antibacterial peptides,ABP)就是一类功能肽。又称抗微生物肽或肽抗生素，它是生物 体免疫防卫系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成成分。这类抗菌肽有着广谱的抗菌功能，能杀死抗生素耐药菌株，能 抑杀真菌、病毒、寄生虫及肿瘤细胞和实体瘤等特点，更为重要的是杀菌机制使得病原菌不 易产生耐药性突变，这类抗菌肽在理化性质上表现出生物化学性质稳定、抗菌机理独特，易 溶于水，对高等动物正常细胞少有毒害等许多特点。因此专家预言抗菌肽有望开发成为新 一代抗细菌、真菌、病毒甚至是抗癌的药物。在美国、日本等发达国家，有用功能多肽制成 的健康食品早已风靡，如含多肽的饮料、含多肽的儿童和老人餐、含多肽保健抗辐射含片等 等。在中国多肽的应用尚未形成气候。在可以预见的将来活性多肽的应用将越来越充满活 力。各种生物体产生的抗菌肽具有强杀菌功能，这类多肽杀菌谱都比较广，对许多革兰氏 阴性和革兰氏阳性菌都有杀灭作用。在自然界中分布十分广泛，已被发现并研究的抗菌多 肽已上百种之多，如天蚕素(cecropins)、蛙皮素(Magainins)、蜂毒素(melittins)、防卫 肽(Defensins)、蝉、蚕抗菌肽以及鸡、奶牛和人的杀菌/通透性增加蛋白(BPI)、人源抗菌 肽LL-37等等。可是抗菌多肽在生物体内的分泌量极少，从生物体直接获取十分困难，用化 学方法合成，成本成了扩大应用的最大问题。现在化学合成抗菌多肽在国内还基本局限在 研究领域，有规模的应用其趋势并没有形成。国内外都有研究者用基因工程方法克隆并表 达了某些抗菌肽[Biochimica et Biophysica Acta 1758(2006) 1351-1358 ；微生物通报， 1997,24(6) 350-353 ；中国卫生检验杂志，2009，19 (6) =1202-1205 ；中国兽医学报，2009， 29⑶1041-1044]。克隆和表达抗菌肽都需要克服几个障碍。一，由于抗菌肽分子量都比 较小，一般都在几十个氨基酸左右，所以表达时表达量并不高；二，适合于表达抗菌肽的表 达系统十分有限，一般只能在真核生物如酵母或奶牛乳腺或昆虫等进行表达，如果用原核 生物作为宿主来表达抗菌肽存在表达产物毒害或杀灭宿主自身的问题，所以一般不能直接 在原核生物中表达，进行高表达或分泌型表达更为困难；三，由于抗菌肽分子量小，也容易 被宿主菌降解，因此常常需要与其他大分子蛋白融合表达，但融合表达一般都会使抗菌肽 失去原有活性功能；四，为了使表达后的蛋白融合具有生物活性功能，就需要对表达产物进 行有效切割，从融合状态释放出抗菌肽才能使其恢复原有功能。目前常用切割方法有使用 肠激酶、凝血酶、Xa因子或BrCN等。BrCN是有毒化学品，切割后有残毒问题，使用凝血酶等 酶类则价格昂贵而制约了融合抗菌多肽的规模化生产和应用。只有解决了上述这四个方面 的问题才能真正进行规模化生产。

发明内容
本发明的目的在于提供一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方 法，所述的这种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法要解决现有技术中的 杀菌肽的表达量小，或者成本过大而不能大规模生产的技术问题。本发明的这种高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，包括一个酶切pE194和 PUC18质粒的步骤，将酶切后的pE194和pUC18质粒采用连接酶连接步骤；包括一个将连 接后的质粒转化的步骤，得到能在大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭表达克隆基因的穿梭质粒转 化子；还包括一个构建启动子信号肽功能片段的步骤，在所述的构建启动子信号肽功能片 段的步骤中，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有启动子，所述的启动子包括核糖体 结合位点、-10区和-35区序列，所述的核糖体结合位点为AGGAGGT，所述的-10区序列为 CAATTTTTGA,所述的-35区序列为^MZIP在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有信号肽序列，采用PCR扩增启动子信号肽功能片段序列的引物序列为Pl5-AGAATTCGGAACTCTTGAATG TTTA，P2 5-ACTTTTTTTCGCTAGCATGTGTTTC,在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有效的终止子，采用PCR扩增终止子的弓丨物序列为Pl:5-CATCACCACCACCACTGAGCGCGCTTTTTA,P2 5-TTGCTAGCGGTACCCATCATCACCACCACC,P3 5-GGTCGACGCTTCAACTTTAGGAATG,在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有6His，在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点；还包括一个将启动子信号肽功能片段插入穿梭质粒转化子的步骤，形成具有启动 子信号肽功能的穿梭质粒；还包括一个在穿梭质粒中插入溶菌酶或者杀菌肽和人源溶菌酶的融合蛋白的步 骤，形成能表达杀菌肽基因和人源溶菌酶的穿梭质粒；还包括一个将插入了溶菌酶或者杀菌肽和人源溶菌酶的融合蛋白的穿梭质粒转 化的步骤；还包括一个发酵培养穿梭质粒的工程菌的步骤；还包括一个穿梭质粒的表达和纯化步骤；还包括一个采用溶葡球菌酶切割穿梭质粒的融合蛋白的步骤，得到具有活性的杀 菌肽和人源溶菌酶。进一步的，采用PstI酶切pE194质粒和pUC18质粒。进一步的，所述的启动子信号肽片段的碱基序列如SEQ ID NO 2所示。进一步的，在制备杀菌肽和人源溶菌酶的融合蛋白的步骤中，在杀菌肽和人源溶 菌酶之间引入溶葡球菌酶切割位点的，在穿梭质粒的Nhe I和Kpn I两酶切位点之间也引 入溶葡球菌酶的切割位点。进一步的，所述的杀菌肽基因为所述的牛乳铁蛋白、或者人源杀菌肽基因、或者天 蚕素A、或者蜂毒素的部分氨基酸片段中任意两种或者两种以上的氨基酸片段的组合，或者 所述的杀菌肽基因为所述的牛乳铁蛋白、或者人源杀菌肽基因、或者天蚕素A、或者蜂毒素 的部分氨基酸片段中任意一个功能片段的重复串联融合。本发明的这种穿梭质粒，包含酶切的pE194质粒片段和酶切的PUC18质粒片段，所 述的酶切的PE194质粒片段和酶切的pUC18质粒片段之间通过T4连接酶连接，所述的穿梭 质粒上插入有一个启动子信号肽功能片段，所述的启动子信号肽功能片段上克隆有启动子 序列、信号肽序列、终止子序列、六个组氨酸片段，所述的启动子包括核糖体结合位点、- ο 区和-35区序列，所述的核糖体结合位点为AGGAGGT，所述的-10区序列为caaitittca，所 述的-35 区序歹Il为AGAArrr，所沭的信号妝序列为 TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGA CCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAG C，所述的终止子序列为 GAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAAATTTTTTCTCAT TCCTAAAGTTG，所述的穿梭质粒上还克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点，所述的溶葡球菌酶 的酶切识别位点的氨基酸序列为GGG，所述的启动子信号肽片段上还克隆有EcoRI、NheI,KpnI、SalI酶切位点。进一步的，所述的启动子信号肽片段的碱基序列如SEQ ID NO 2所示。进一步的，用PstI酶切pE194质粒和pUC18质粒。进一步的，所述的穿梭质粒中克隆有人源溶菌酶基因，所述的人源溶菌酶基因DNA 序列的N-端含有一段以外分泌形式分泌于胞外的Illbp的信号肽序列，在人源溶菌酶基因 C端设置有溶葡球菌酶的切割识别位点，所述的信号肽和人溶葡球菌酶基因的碱基序列如 SEQ ID NO :3所示，所述的信号肽和人源溶菌酶基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。进一步的，所述的穿梭质粒中含有牛乳铁蛋白和人源溶菌酶基因构成的融合蛋 白，在所述的牛乳铁蛋白中，其17位氨基酸改变为Gly，第18、26位氨基酸分别改变为Trp， 所述的牛乳铁蛋白和人源溶菌酶的融合蛋白的碱基序列为SEQ ID NO :5所示，所述的牛乳 铁蛋白和人源溶菌酶融合蛋白的氨基酸序如SEQ ID N0:6所示。进一步的，所述的穿梭质粒中含有人源杀菌肽基因LL-37和人溶菌酶基因构成的 融合蛋白，所述的的人溶菌酶基因序列的C-端融合了一段114bp的DNA序列，所述的融合 蛋白的碱基如DSEQ ID NO :9所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如PSEQ ID N0:10所示。进一步的，所述的穿梭质粒中含有天蚕素A的N端8个氨基酸和蜂毒素N端第3 位氨基酸开始的10个氨基酸、和人溶菌酶基因构成的融合蛋白，所述的天蚕素A、蜂毒素和 人源溶菌酶的融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO :7所示，所述的天蚕素A、蜂毒素和人源溶 菌酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。本发明还提供了一种融合蛋白，由牛乳铁蛋白和人溶菌酶基因构成，在所述的牛 乳铁蛋白中，其17位氨基酸改变为Gly，第18、26位氨基酸分别改变为Trp，所述的融合蛋 白的碱基序列为SEQ ID NO :5所示，所述的融合蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO :6所示。本发明还提供了一种融合蛋白，由天蚕素A的N端8个氨基酸和蜂毒素N端第3 位氨基酸开始的10个氨基酸、和人溶菌酶基因构成，所述的融合蛋白的碱基序列如DSEQ ID NO :7所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。本发明还提供了一种融合蛋白，由人源杀菌肽基因LL-37和人溶菌酶基因构成， 所述的人溶菌酶基因序列的C-端融合了一段114bp的DNA序列，所述的融合蛋白的碱基如 DSEQ ID NO :9所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如PSEQ ID N0:10所示。本发明还提供了上述的穿梭质粒在制备治疗抗菌药物中的应用。本发明构建的穿梭质粒设计考虑以下特点用PstI酶切pE194和pUC18 二质粒， T4连接酶连接，CaCl2法转化感受态大肠杆菌DE3，得到能在大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭表 达克隆基因的穿梭质粒转化子。该穿梭质粒表达基因时所克隆的启动子有比较广的适应 性，能够在大肠杆菌、枯草杆菌和球形芽孢杆菌中启动表达；质粒上克隆有信号肽序列，能 够使表达的目的蛋白分泌于胞外，方便分离纯化；设计了有效的终止子和终止子序列，能够 使蛋白翻译有效终止；信号肽酶切割位点设计有利酶切后克隆基因的正确方向的连接；穿 梭质粒载体上克隆有6His，能够方便通过M柱进行分离纯化；同时在穿梭质粒载体上克隆 有溶葡球菌酶的酶切识别点(GGG)，当进行纯化的目的蛋白有多个功能肽的融合表达时，这 时候通过溶葡球菌酶的酶切，方便地释放出融合肽蛋白，对基因表达如抗菌肽这样一类对 宿主本身就有毒害或杀灭作用的蛋白更有意义。总之，本发明设计的穿梭质粒具有一定的共用性，可以将不同的基因克隆于载体进行表达。本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明在各融合功能肽之 间引入连接小肽，该连接小肽能被溶葡球菌酶专一性切割[Recsei, PNAS，1987，Vol84, PP1127-1131]，通过溶葡球菌酶专一性切割获得有活性的功能肽。在工程菌的培养过程中， 融合的杀菌肽表达对宿主菌自身不再产生毒害，由于融合了人溶菌酶，分子量的增大也不 再被宿主菌降解，表达量随之增加，而且人溶菌酶本身就是一个抑杀细菌的酶。同时考虑到 表达产物的分离纯化，在融合蛋白C端融合了 His6，当发酵结束，利用M柱可以方便地将融 合蛋白进行纯化，再用溶葡球菌酶对融合蛋白进行专一性切割，释放出多肽使其恢复原有 杀菌功能。本发明特征表现在表达的溶菌酶和杀菌多肽及用于切割融合多肽的溶葡球菌酶 都具杀菌功能，本发明目的是需要大量生产高活性杀菌多肽，因而不需要对切割用的溶葡 球菌酶进行分离和纯化而被直接使用。本发明就是以此设计而应用基因工程技术生产人溶 菌酶和杀菌多肽融合蛋白的一种技术方法。


图1是大肠杆菌与枯草杆菌穿梭表达质粒的构建示意图。图2是表达的人溶菌酶与牛乳铁蛋白杀菌的杀菌斑检测图，A以金黄色葡萄球菌 CowanI (ATCC12598)测试杀灭革兰氏阳性菌效果；B以大肠杆菌CMCC(B) 44102测试杀灭革 兰氏阴性菌效果；C以溶壁微球菌(CGMCC 1. 634)测试人溶菌酶溶菌效果。(中心孔环丙 沙星20ul (2mg/ml) /孔；四周从上顺时针方向四个浓度表达酶切后的浓缩液，分别是5、10、 15、20ul/孔。)
具体实施例方式实施例1大肠杆菌和枯草杆菌穿梭质粒的构建如图1所示，大肠杆菌PUC18质粒和金葡菌 PE194 质粒分别用 PstI 酶切，酶切体系 20uL :ddH20 7uL, IOxH 缓冲液 2uL，PstI luL，pUC18 或pE194 10uL，37°C酶切过夜。酶切完成1. 0%琼脂糖胶电泳，回收相应酶切片段并纯化。 再在 20uL 体系(ddH20 5. 5uL, T4 连接缓冲液 2uL, T4 连接酶 0. 5uL, pUC18 和 pE194 各 6uL) 进行16°C条件下T4DNA连接酶连接过夜，CaCl2法转化感受态大肠杆菌DE3，待转化液被固 体培养基吸收后于37°C培养箱倒置培养过夜，Amp+平皿上长出的转化子转接保存，并抽提 质粒鉴定分子量增加的大小，判断连接结果。以[Recsei，PNAS，1987，Vol84，ppl 127-1111]发表的 DNA 序列设计 PCR 扩增引物， Recsei发表的原始DNA序列为(SEQ ID NO 1)CCGGAACTCTTGAATGTTTAGTTTTGAAAATTCCAAAAAAAAACCTACTTTCTTAATATTGATTCATAT TATTTTMCACAATCAGTT AGAATTTXCAAAAATCTTAAAGT CAATTTTTGMGTGTGTTTGTATATTTCATCAAAA TCAATCMTATTATTTTACTTTCTTCATCGTTAMAAATGTAATATTTATAAAAATATGCTATTCTCATAAATGTMT AATAAATT aggaggk ATTAAGG rTCMGAAMCAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGT ACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTTCTGAAAAAAGTAATATGGATGT TTCAAAAAAAGTAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCCCCAGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCTC CAGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCTCCAGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCTCCAGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCTCCGGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGC CCCAGTAGAAAATACAGCTGAAGTAGAGACTTCAAAAGCCCTGGTTCAAAATAGAACAGCTTTAAGAGCTGCAACAC ATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGC GGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGA AGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATA TGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACT GGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAAT GCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTTGGAAAACAA ACAAATATGGCACACTATATAAATCAGAGTCAGCTAGCTTCACACCTAATACAGATATAATAACAAGAACGACTGGT CCATTTAGAAGCATGCCGCAGTCAGGAGTCTTAAAAGCAGGTCAAACAATTCATTATGATGAAGTGATGAAACAAGA CGGTCATGTTTGGGTAGGTTATACAGGTAACAGTGGCCAACGTATTTACTTGCCTGTAAGAACATGGAATAAATCTA CTAATACTTTAGGTGTTCTTTGGGGAACTATAAAGTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAAT AAAAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTG AAGCTT粗倾斜部分依次表示启动子-35区、-10区、核糖体结合位点AGGAGGT、起始密码 子、信号肽切割位点、划线部分为信号肽和终止子；起始密码子TTG到信号肽切割位点为信 号肽部分。所用启动子信号肽片段的引物序列P1 5-AGAATTCGGAACTCTTGAATGTTTA(EcoRI) ，P2 5-ACTTTTTTTCGCTAGCATGTGTTTC (NheI)；终止子引物序列P1 5-CATCACCACCACCACTGA GCGCGCTTTTTA ；P2 5-TTGCTAGCGGTACCCATCATCACCACCACC (Nhe I KpnI) ；P3 :5~GGTCGACGCTT CAACTTTAGGAATG(SalI)。以[工业微生物，1989，19(1) :1_6]保存的克隆株pUC8的DNA为模 板，PCR扩增启动子、信号肽和终止子。启动子、信号肽PCR扩增条件，94°C变性30s，52. 5°C 退火30s，72°C延伸30s。终止序列PCR扩增条件，94°C变性30s, 56. 5°C退火45s，72°C延伸 15s。终止序列上游引物中加有6His标签及Nhe I和Kpn I两酶切位点，二酶切位点是以 便正确插入外源目的基因。克隆片段经Nhe I酶切，1.5%琼脂糖胶电泳回收并纯化，在PCR 仪上16°C与pMD 18-T连接过夜，CaCl2法转化感受态大肠杆菌DE3，待转化液被固体培养基 吸收后于37°C培养箱倒置培养过夜，Amp+平皿上长出的转化子转接保存，并送上海鼎安生 物科技有限公司测序。最终结果完全正确(462bp)。测定结果如下(SEQ IDNO 2)GAATTO GGAACTCTTGAATGTTTAGTTTTGAAAATTCCAAAAAAAAACCTACTTTCTTAATAT TGATTCATATTATTTTAACACAATCAGTTAGAATTTCAAAAATCTTAAAGTCAATTTTTGAGTGTGTTTGTA TATTTCATCAAAATCAATCAATATTATTTTACTTTCTTCATCGTTAAAAAATGTAATATTTATAAAAATATG CTATTCTCATAAATGTAATAATAAATTAGGAGGTATTAAGG TTG AAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGA GACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACA T GCTAGCGGTACCg吞職縣g_C_A_c_C_4ggjv_Q聊 GCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAA AAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGAAGC GTCGAC(斜体下划线为内切酶切割位点，依次为EcoRI、NheI,KpnI, SalI ；虚下划线的分 别为信号肽的起始密码子、终止密码子和OTis标签)。设计有6His标签及Nhe I和Kpn I两酶切位点。二酶切位点以方便正向插入外 源目的基因，Nhe酶切位点又是信号肽酶切位点。6His标签有利于用Ni柱纯化表达的融合 蛋白。
构建的大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭质粒可以作为共用表达载体，在该穿梭质粒上 克隆有溶葡球菌酶基因的启动子、信号肽和终止子序列。该启动子适合于融合基因在原核 生物中的表达，当基因插入到PUC18或pUC8等质粒时，能够表达一定量的酶蛋白[Recsei， PNAS，1987，Vol84, ρρ1127_1111 ；工业微生物，1989，19 (1) :1_6]。克隆的启动子序列 AGGAGGT与mRNA和16S核糖体RNA的连接位点完全互补，启动子的-35区和-10区与枯草 杆菌的ο 37启动子完全同源，因此构建的穿梭质粒适合于在枯草杆菌中进行克隆基因的 表达，也适合于在球形芽孢杆菌中表达。当在大肠杆菌中进行克隆表达时以Amp+作为筛选 标记；在枯草芽孢杆菌和球形芽孢杆菌中表达克隆基因时以Em+作为筛选标记。实施例2具体的穿梭质粒的构建方法如实施例1。依据Agric Biol Chem, 1986, 50 (3) 713 723等发表的人溶菌酶基因序列，化学合成人溶菌酶基因，密码子全部换成适合在原 核生物表达的偏爱密码子，人溶菌酶基因的二端加有NheI和KpnI酶切位点。NheI和KpnI 酶切人溶菌酶基因和穿梭质粒。基因15uL(或穿梭质粒8uL)，中盐2uL，NheI与KpnI各 0. 8uL，用水补到总体积20uL。37°C酶切4h，1 %琼脂糖电泳、回收基因和载体片段并纯化。 连接体系为20uL(ddH205. 5uL，T4连接缓冲液2uL，T4连接酶0. 5uL，人溶菌酶基因8uL，载 体4uL)，PCR仪上16°C条件下T4 DNA连接酶连接过夜，CaCl2法转化感受态大肠杆菌DE3， 待转化液被固体培养基吸收后于37°C培养箱倒置培养过夜，Amp+平皿上长出的转化子转 接保存。抽提质粒鉴定分子量增加的大小，判断连接结果。并转接转化子于37°C摇床扩大 培养过夜。离心去菌体，离心上清液经Millipore超滤膜适当浓缩，调pH7. 5左右，用Img/ mL的溶葡球菌酶20uL，37°C水浴保温2h。取此液测定酶活性。酶活性测定采用浊度法检测 人溶菌酶活性，以此确定溶菌酶基因是否已经得到表达。具体测定按实施例6进行测定。人溶菌酶基因N-端含有一段以外分泌形式分泌于胞外的Illbp的信号肽序列，同 时在于人溶菌酶基因C端引入溶(葡球)菌酶切割识别位点，将上述人溶菌酶基因插入穿 梭质粒进行表达，初步检测具有溶菌酶活性后，还可以经过M柱进一步纯化，获得更纯的 表达产物，然后进行溶葡球菌酶酶切释放出活性功能片段，而且保持了原有人溶菌酶的氨 基酸结构。其信号肽和人溶菌酶基因的碱基序列如SEQ ID N0:3所示。TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCA TCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGCAAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCT GAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCGTGGTATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCT ACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGCCGGCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTAT TGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGGTGCGGTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTTCAGGATAACAT TGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAACGTGTGGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACC GCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCAGTACGTGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGT αατ ηη下划线分别为信号肽序列和溶(葡球)菌酶切割识别位点。其信号肽和人溶菌酶 基因的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。实施例3具体的穿梭质粒的构建方法如实施例1，融合后的穿梭质粒的表达、纯化、溶葡球 菌酶酶切的方法如实施例2。在人溶菌酶基因中融合了牛乳铁蛋白的第17 32位氨基酸 组成的具高效杀菌功能的15个氨基酸肽段GlyTrpLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLys LysLeu Gly0在人溶菌酶基因DNA分子序列的C-端融合了该肽段45 bp序列的牛乳铁蛋白的 活性功能片段，并将17位氨基酸突变成Gly，第18、26位突变成Trp。为使融合蛋白表达后 有效切割活化牛乳铁蛋白活性肽，对其序列进行突变改造并添加溶(葡球)菌酶切割识别 位点序列，全部氨基酸使用原核生物偏爱密码子。人溶菌酶和化学合成的牛乳铁蛋白构建 的融合蛋白的碱基序列如SEQ ID NO :5所示，氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示(GCTAGC，信 号肽酶切割识别位点识别在密码子AlaSer中间，Ala切在信号肽部分)。AGC AAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCGTGG TATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCTACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGCCG GCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTATTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGGTGCG GTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTTCAGGATAACATTGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAACGTGT GGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACCGCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCAGTACG TGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGTTGGAAGTGCCGCCGCTGGCAGTGGCGCTGGAAGAAACTGGGCGGC^rarr粗斜体字为基因克隆位点，下划线溶(葡球)菌酶切割识别位点。实施例4具体的穿梭质粒的构建方法如实施例1，融合后的穿梭质粒的表达、纯化、溶葡球 菌酶酶切的方法如实施例2。在人溶菌酶酶基因中融合了人源杀菌肽LL-37的37个氨基 酸。在人溶菌酶基因序列的C-端融合了一段Illbp的DNA序列CTGCTGAACTTCTTTCGCAAGA GCMGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCAAACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACGCAACCTGCCGCCGCGCA CCCAGAGCCAG。为使融合蛋白表达后有效切割，活化杀菌肽，对序列进行突变并增加切割酶识 别序列，使用原核生物偏爱密码子。化学合成的人源杀菌肽LL-37和人源溶菌酶的融合蛋 白的碱基序列如SEQ ID NO :9所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:10所示。GCTAGCAAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCGT GGTATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCTACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGC CGGCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTATTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGGTG CGGTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTTCAGGATAACATTGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAACGT GTGGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACCGCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCAGTA CGTGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGTCTGCTGAACTTCTTTCGCAAGAGCAAGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCA AACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACGCAACCTGCCGCCGCGCACCCAGAGCCAGGGCGGC GGTACC粗斜体字为克隆基因位点，下划线为溶(葡球)菌酶切割识别位点。实施例5具体的穿梭质粒的构建方法如实施例1，融合后的穿梭质粒的表达、纯化、溶葡球 菌酶酶切的方法如实施例2。在人溶菌酶基因中融合了天蚕素A的N端8个氨基酸和蜂毒 素 N 端第 3 位氨基酸开始的 10 个氨基酸 GlyLysTrpLysLeuPheLysLysValLeuLysValLeuThr ThrGlyMetGly0在人溶菌酶酶基因序列C-端融合了 54bp的DNA序列GGTAAGTGGAAACTGTTT AAGAMGTGCTGMGGTGCTGACCACCGGCATGGGC。为使融合蛋白表达后有效切割活化，对其序列进 行突变，使用原核生物偏爱密码子。添加溶(葡球)菌酶切割识别位点，天蚕素A、蜂毒素和 人源溶菌酶的融合蛋白的碱基序列如SEQ IDNO :7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :8所示。GCTAGC. AAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCG TGGTATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCTACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGCCGGCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTATTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGG TGCGGTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTTCAGGATAACATTGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAA CGTGTGGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACCGCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCA GTACGTGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGTAAGTGGAAACTGTTTAAGAAAGTGCTGAAGGTGCTGACCACCGGC ATGGGCGGC ggtacc粗斜体字为基因克隆位点、下划线为溶(葡球)菌酶切割识别位点。实施例6本发明对于溶菌酶的活性测定采用二种方法。方法一将活化的溶壁微球菌单菌 落接入LB培养液，37°C摇床培养过夜，将固体LB培养基加热熔化，缓慢冷却至50°C左右，吸 0. 2mL培养过夜的溶壁微球菌到此熔化的LB培养基中，轻摇混合均勻，不使产生气泡，并迅 速倒皿，大约20m/皿，放于水平台面上(培养基水平有利于相互比较杀菌斑大小，以减少误 差)，然后在凝固了的培养基上用灭菌的5mm大小不锈钢管打孔，挑出胶块，滴加上述实施 例中不同融合蛋白的溶葡球菌酶酶切液或M柱纯化的酶切液培养过夜。在样品孔附近滴 加已知浓度的标准溶菌酶溶液。第二天观察杀菌斑，与已知浓度溶菌酶比对杀菌斑的大小， 预估表达的酶活相对大小。方法二基本上按Sigma公司所附测定方法进行，配制pH6. 2的 0. lmol/L 磷酸缓冲液，称取 NaH2P042H20 1. 17 克，Na2HPO412H20 0. 786 克，EDTA 0. 0392 克， 溶于煮沸灭菌的去离水中并稀释至IOOmL,较正pH在6. 15 6. 25之间。溶菌酶对特定溶 壁微球菌胞壁有溶解作用，在一定浓度的溶壁微球菌、温度和时间条件下，溶壁微球菌浊度 的下降与酶的浓度和活性呈正相关。利用这一原理进行浊度法测定酶活性。称取溶壁微球 菌干菌粉[中国药品生物制品检定所产品]于容量瓶，加PH6. 2的0. lmol/L磷酸缓冲液，轻 摇溶解，置25°C水浴预保温。准确量取25°C水浴预保温底物悬液3mL，置Icm光径比色皿， 测定OD45tlnm吸光度0. 70左右，作空白调零，读数为kQO同时精确称取溶菌酶标准品20mg， 用pH6. 2的0. lmol/L磷酸缓冲液溶解，定容至250mL，相当于80ug/mL酶标准液。精确吸取 25°C预保温酶标准液0. ImL (即8. Oug溶菌酶)，加到已校零比色皿，迅速混勻，秒表计时， 至180s时记下此时吸收度为A ；精确吸取预保温磷酸缓冲液(pH6. 2)0. ImL,同上操作做空 白样试验，测得零秒时读数为Ac/, 180s时读数为A’。每样品做2次重复以减少误差。用已 预热的分光光度计校正450nm处空白比色皿读数为零。通过加样量的加或减调节浊度法测 定酶活性即读数在一个合适范围内。浊毒法测定溶菌酶的活力单位定义为25°C，pH6. 2，波 长450nm下，酶作用引起吸光度OD45tlnm每下降0. 001为一个酶活力单位。
(A0-A) — (V -A')固体酶的活力单位数(u/mg) =-------------------X 106，W为测定液中供测试样
W
品的重量。
(A0-A)-(A0' -A')液体酶的活力单位数(U/L) =---------------------------------XlO'',
VX倍数(换算成1毫升所需的倍数)V 溶葡球菌酶切割液测定酶活所吸取的UL数。实施例7采用实施例3构建的含有人乳铁蛋白和人溶菌酶融合蛋白的纯化与溶菌 酶和牛乳铁蛋白杀菌效果的检测用实施例3构建的含人乳铁蛋白和人溶菌酶基因的转化子单菌落转接于5mL的LB培养液，培养至0D_ ^ 1. 0，扩大培养于200mL的LB培养液，37°C摇床培养过夜。离心去菌 体，上清经Millipore超滤膜适当浓缩，然后利用表达的融合蛋白C端所含6个His尾结构， 可方便地将表达的可溶性融合蛋白加以纯化。具体方法如下加约3倍柱体积的无菌水冲 洗所购5mL Ni2+柱树脂，再换用3倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯 化钠，PH7.8)平衡树脂(操作中注意不让缓冲液低于柱液面)放置备用。将经Millipore 超滤膜适当浓缩的上样液上Ni2+柱。调整流速控制在< 50mL/h。待样品液离液面约2-3mm 时换用约6个柱体积的结合缓冲液(pH7. 8)洗柱，接着换用约4个柱体积的洗涤缓冲液 (20mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠，pH6. 0)洗柱，用分光光度计跟踪流出液A28tl < 0. 02 时结束洗涤，换用低浓度咪唑洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠，lOmmol/L 咪唑，pH6. 0)4个柱床体积洗脱，用1. 5mL离心管收集流出液，1. 5mL/管，按流出顺序编号。 待流出液还有2-3mm高度时换用浓度为lOOmmol/L和200mmol/L的咪唑洗脱缓冲液依次洗 脱，每个浓度用4个柱体积。洗脱结束再间隔取样IOuL进行SDS-PAGE蛋白电泳，与标准分 子量蛋白比较，分析蛋白分布，合并表达的融合蛋白流出液大约14.7mL。用Millipore超 滤膜适当浓缩至5mL左右，调pH7. 5左右，用lmg/mL的溶葡球菌酶50uL，37 °C水浴保温2h。 取此液测定酶活性。活性测定方法如实施例6所述的采用平皿杀菌斑检测法。具体操作如下分别 将活化的溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌单菌落接入LB培养液，37°C摇床培养过 夜。将固体LB培养基加热熔化，缓慢冷却至50°C左右，分别各吸0. 2mL培养过夜的溶壁微 球菌或金黄色葡萄球菌或大肠杆菌到3个倒有20mL的LB培养基中(分别标注所加菌种 名称)，轻摇混合均勻，不使产生气泡，并放于水平台面上(培养基水平有利于相互比较杀 菌斑大小，以减少误差)，待培养基凝固，然后在培养基上用灭菌的5mm大小不锈钢管间隔 2cm左右打若干孔，挑出胶块，滴加上述溶葡球菌酶酶切液，此实例分别加5uL、10uL、15uL、 20uL四个浓度，同时用灭菌的无菌水补足至20uL。在培养皿中间滴加环丙沙星20uL作为 阳性对照。室温下待所加样品液被培养基基本吸收(约Ih)后放置于37°C培养箱培养过 夜。第二天观察杀菌斑，与已知浓度溶菌酶比对杀菌斑的大小，预估表达的酶活相对大小。 所用测试菌以金黄色葡萄球菌CowanI (ATCC12598)测试杀灭革兰氏阳性菌效果；以大肠杆 菌CMCC(B)44102测试杀灭革兰氏阴性菌效果；以溶壁微球菌(CGMCC 1. 634)测试人溶菌酶 溶菌效果。本实施例测试的具体结果如图2所示。溶菌酶具有溶解溶壁微球菌细胞壁的功能，图2A所示。表明本实施例表达人溶菌 酶成功。但由于是表达的融合蛋白，同时还表达了牛乳铁蛋白。所以可能是二个表达产物 的共同作用的结果。因为牛乳铁蛋白融合在人溶菌酶之后，经过酶切释放出牛乳铁蛋白，才 有可能让这二个功能肽发挥其杀菌功能，本发明需要解决的一个表达高效广谱的杀菌剂的 目的已经达到。本实施例表达融合蛋白，还表达有牛乳铁蛋白，牛乳铁蛋白对金黄色葡萄球菌和 大肠杆菌具有杀灭作用[微生物学通报，2008 35(4) :539-544]。图2B、C所示结果表明牛 乳铁蛋白已成功表达，并被溶葡球菌酶有效切割。因为溶菌酶对金黄色葡萄球菌和大肠杆 菌不具有完全的杀灭作用，图2显示完全杀灭的杀菌圈显然是由牛乳铁蛋白作用的结果。
权利要求
一种高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于所述的方法包括一个酶切pE194和pUC18质粒的步骤，将酶切后的pE194和pUC18质粒采用连接酶连接，又包括一个将连接后的质粒转化的步骤，得到能在大肠杆菌和枯草杆菌中穿梭表达克隆基因的穿梭质粒转化子，还包括一个构建启动子信号肽功能片段的步骤，在所述的构建启动子信号肽功能片段的步骤中，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有启动子，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有信号肽序列，采用PCR扩增该启动子信号肽的引物序列为P15 AGAATTCGGAACTCTTGAATGTTTA，P25 ACTTTTTTTCGCTAGCATGTGTTTC，在所述的启动子信号肽功能片段中克隆有效的终止子，采用PCR扩增终止子的引物序列为P15 CATCACCACCACCACTGAGCGCGCTTTTTA，P25 TTGCTAGCGGTACCCATCATCACCACCACC，P35 GGTCGACGCTTCAACTTTAGGAATG，在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有6His，在所述的启动子信号肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点；还包括一个将启动子信号肽功能片段插入穿梭质粒转化子的步骤，形成具有启动子信号肽功能的穿梭质粒；还包括一个在穿梭质粒中插入人源溶菌酶、或者杀菌肽与人源溶菌酶的融合蛋白的步骤，形成能表达杀菌肽基因、或者人源溶菌酶基因的穿梭质粒；还包括一个将插入了人源溶菌酶、或者杀菌肽与人源溶菌酶的融合蛋白的穿梭质粒转化的步骤；还包括一个发酵培养穿梭质粒的工程菌的步骤；还包括一个穿梭质粒的表达和纯化步骤；还包括一个采用溶葡球菌酶切割穿梭质粒、或者穿梭质粒表达的融合蛋白的步骤，得到具有活性的杀菌肽或人源溶菌酶。
2.如权利要求1所述的高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于采用PstI 酶切pE194质粒和pUC18质粒。
3.如权利要求1所述的高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于所述的启 动子包括核糖体结合位点、-10区和-35区序列，所述的核糖体结合位点为AGGAGGT，所述 的-10区序列为CAATTTTTGA,所述的-35区序列为AGAATTT0
4.如权利要求1所述的高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于所述的启 动子信号肽片段的碱基序列如SEQ ID N0:2所示。
5.如权利要求1所述的高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于在制备杀 菌肽和人源溶菌酶的融合蛋白的步骤中，在杀菌肽和人源溶菌酶之间引入溶葡球菌酶切割 位点，在穿梭质粒的Nhe I和Kpn I两酶切位点之间也可引入溶葡球菌酶的切割位点。
6.如权利要求1所述的高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法，其特征在于所述的杀 菌肽基因是牛乳铁蛋白、或者人源杀菌肽基因、或者天蚕素A、或者蜂毒素的部分氨基酸片 段中任意两种或者两种以上的氨基酸片段的组合，或者所述的杀菌肽基因是牛乳铁蛋白、 或者人源杀菌肽基因、或者天蚕素A、或者蜂毒素的部分氨基酸片段中任意一个功能片段的重复串联融合。
7.一种穿梭质粒，其特征在于包含酶切的PE194质粒片段和酶切的pUC18质粒片 段，所述的酶切的PE194质粒片段和酶切的pUC18质粒片段之间通过T4连接酶连接，所 述的穿梭质粒上插入有一个启动子信号肽功能片段，所述的启动子信号肽功能片段上克 隆有启动子序列、信号肽序列、终止子序列、六个组氨酸片段，所述的启动子包括核糖体结 合位点、-10区和-35区序列，所述的核糖体结合位点为AGGAGGT，所述的-10区序列为 CAATTTTTGA,所述的-35区序列为AGAATTT，所述的信号肽序列为TTGAAGAAAACAAAAAACAATT ATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAA ACACATGCTAGC，所述的终止子序列为 TGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA ATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTG，所述的穿梭质粒上还克隆有溶葡球菌酶的酶切识别位点，所述 的溶葡球菌酶的酶切识别位点的氨基酸序列为GGG，所述的启动子信号肽片段上还克隆有 EcoRI、NheI、KpnI、SalI 酶切位点。
8.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于所述的启动子信号肽片段的碱基序列 如 SEQ IDNO 2 所示。
9.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于采用PstI酶切pE194质粒和pUC18质粒。
10.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于所述的穿梭质粒中克隆有人源溶菌酶 基因，所述的人源溶菌酶基因DNA序列的N-端含有一段以外分泌形式分泌于胞外的111 bp 的信号肽序列，在人源溶菌酶基因C端设置有溶葡球菌酶的切割识别位点，所述的信号肽 和人溶葡球菌酶基因的碱基序列如SEQ ID NO :3所示，所述的信号肽和人源溶菌酶基因编 码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
11.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于所述的穿梭质粒中含有牛乳铁蛋白 和人源溶菌酶基因构成的融合蛋白，在所述的牛乳铁蛋白中，其17位氨基酸改变为Gly，第 18、26位氨基酸分别改变为Trp，所述的牛乳铁蛋白和人源溶菌酶的融合蛋白的碱基序列 为SEQID NO :5所示，所述的牛乳铁蛋白和人源溶菌酶融合蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO 6 所示。
12.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于所述的穿梭质粒中含有人源杀菌肽基 因LL-37和人溶菌酶基因构成的融合蛋白，所述的的人溶菌酶基因序列的C-端融合了一段 114bp的DNA序列，并对个别氨基酸密码子进行替换。所述的融合蛋白的碱基如DSEQ ID NO :9所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如PSEQ ID N0:10所示。
13.如权利要求7所述的穿梭质粒，其特征在于所述的穿梭质粒中含有天蚕素A的N 端8个氨基酸和蜂毒素N端第3位氨基酸开始的10个氨基酸、和人溶菌酶基因构成的融合 蛋白，所述的天蚕素A、蜂毒素和人源溶菌酶的融合蛋白的碱基序列如SEQ ID N0:7所示， 所述的天蚕素A、蜂毒素和人源溶菌酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。
14.一种融合蛋白，其特征在于由牛乳铁蛋白和人溶菌酶基因构成，在所述的牛乳铁 蛋白中，其17位氨基酸改变为Gly，第18、26位氨基酸分别改变为Trp，所述的融合蛋白的 碱基序列为SEQ ID NO :5所示，所述的融合蛋白的氨基酸序如SEQ ID NO :6所示。
15.一种融合蛋白，其特征在于由天蚕素A的N端8个氨基酸和蜂毒素N端第3位氨 基酸开始的10个氨基酸、和人溶菌酶基因构成，所述的融合蛋白的碱基序列如DSEQ ID NO7所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
16.一种融合蛋白，其特征在于由人源杀菌肽基因LL-37和人溶菌酶基因构成，所述 的人溶菌酶基因序列的C-端融合了一段114bp的DNA序列，并对个别氨基酸密码子进行替 换。所述的融合蛋白的碱基如DSEQ ID NO :9所示，所述的融合蛋白的氨基酸序列如PSEQ ID NO 10 所示。
17.权利要求7所述的穿梭质粒在制备治疗抗菌药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程领域，提供了一种穿梭质粒、以及高效表达杀菌肽与溶菌酶基因的方法。本发明构建了适合于在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、球形芽孢杆菌)中表达的大肠杆菌一枯草杆菌穿梭质粒。在原核生物中表达的杀菌肽对宿主不表现毒杀作用。通过本发明的穿梭质粒表达人溶菌酶和牛乳铁蛋白等多种杀菌肽的融合蛋白获得成功。本发明构建的表达质粒中引入了6His，纯化方便，纯化后的融合蛋白经溶葡球菌酶对各融合肽段间酶切位点的识别并正确切割，释放出各功能肽使其恢复活性，又免去分离切割酶而直接使用的一种有效而简便的技术方法。本发明的穿梭质粒还具有一定的共用性，适合的基因都可进行克隆表达。
文档编号A61K38/17GK101899469SQ20101017611
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者张培德, 黄易明 申请人:上海艾魁英生物科技有限公司;张培德