专利名称：陈皮中黄酮类化合物在制备抑制血管新生药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体是一种陈皮中黄酮类化合物在制备抑制血管新生 药物中的应用。
背景技术：
血管新生(angiogenesis)，指成人在原始血管丛或已存在血管的基础上以发芽方 式形成新生血管的过程，从伤口治愈、胎盘形成以至胚胎发育等，血管新生在当中扮演着重 要的角色。与此同时，很多疾病的发生都跟血管新生有着莫大关系，如视网膜病变、牛皮癣、 类风湿性关节炎、肥胖症(obesity)、子宫内膜异位症(endometriosis)及肿瘤生成等。近 年来，调节血管新生的研究已成为临床治疗中的热点。血管新生主要涉及基底膜的降解、内 皮细胞迁移、增殖和管形成等过程，其中内皮细胞的增殖是血管新生的最主要指标之一。因 此，临床上希望发现一种能够调节血管新生的药物，以达至疾病预防及治疗的目的。血管新 生和血管炎症有十分密切的关系。近年来有观点强调血管炎症在肺损伤起关键作用，是多 种原因引起的肺部失控性炎症反应的结果，是全身炎症反应在肺部的表现。P东皮(Pericarpium citri reticulatae)为芸香禾斗植物禾爵(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮。药材分为“陈皮”和“广陈皮”，具有燥湿化痰和理 气健脾的功效。近年的药理研究证明，陈皮对消化系统、心血管系统和免疫系统都有不同的 作用。此外，陈皮也有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等功能。陈皮具有挥发油、黄酮类和生物碱等活 性成份，当中的黄酮类化合物主要包括橙皮苷(Hesperidin)、新橙皮苷(Neohesperidin)、 川陈皮素(Nobiletin)、甜橙黄酮(Sinensetin)、桔皮素(Tangeretin)等。
发明内容
本发明的目的在于提供陈皮中黄酮类化合物的应用。本发明的目的是这样实现的陈皮中黄酮类化合物在制备抑制血管新生药物中的应用。所述的陈皮中黄酮类化合物为甜橙黄酮、桔皮素、川陈皮素中的一种或两种以上
混合ο所述的抑制血管新生是抑制血管内皮细胞增殖。所述的药物剂型为医学上认可的任何一种剂型。所述的剂型为粉剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。本发明从实验得知，陈皮中的黄酮类化合物的确能有效地抑制血管新生，所制得 的药物可通过抑制血管内皮细胞的增殖抑制血管新生，进而用于治疗与过度血管新生有关 的疾病，例如视网膜病变、牛皮癣、肿瘤生成、类风湿性关节炎、肥胖症、子宫内膜异位症、肺 部炎症引起的急、慢性支气管炎，哮喘等。
图1是甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素的化学结构图。图2是不同浓度的甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素对抑制由血管内皮生长因子 (VEGF)所诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖图；对照组是受血管内皮生长因子处理； 数据士SEM来自3 4次不同的实验；与对照组比较、< 0. 01，***p < 0. 001。图3是经川陈皮素处理24小时后的HUVEC细胞周期图。对照组是受0. 1 % DMSO 处理；数据士SEM来自3次不同的实验；与对照组比较、< 0. 05，**p < 0. 01。图4是甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素作用于转基因斑马鱼Tg(fli_l:EGFP)后 的节间血管(Intersegmental vessels, ISVs)禾口 背參从轴血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel,DLAV)生长形态图。(A) 0. 1 % DMSO ； (B) 30 μ M 川陈皮素；(C) 30 μ M甜 橙黄酮；(D) 30 μ M桔皮素；(E) 150nM VRI2。箭头1指示的位置为节间血管；箭头2指示的 位置为背纵轴血管。
具体实施例方式本发明所述的陈皮中黄酮类化合物在制备抑制血管新生药物中的应用，可参考常 规的药物配置方法。药物剂型为医学上认可的任何一种剂型，例如为粉剂、注射液、胶囊、片 剂或口服液。在知道了所需药物的给药剂量以后，药物的配置是本技术领域人员所熟知的， 按照常规的配置工艺即可。例如以川陈皮素作为例子，川陈皮素的给药剂量为5mg/kg。以 胶囊为例，先把IOOmg的川陈皮素与400mg的淀粉及IOmg的滑石粉均勻地混合在一起，之 后把混合物填充到胶囊内并封口即可。以下通过实验及说明书附图进一步描述本发明陈皮中黄酮类化合物的新用途。所有 数据用mean士SEM表示，统计学比较采用单因素方差分析并用Tukey’ s test进行组间比较。试验药物甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素(结构式见图1)购于上海同田生物 技术有限公司，溶于DMSO中制成浓度为1 OOmM的储备液，储于-20°C备用。VEGF购于 R&Dsystem(Minneapolis, MN)，溶于含0. 1 %小牛血清的磷酸盐缓冲液中，制成浓度50 μ g/ ml 储备液，储于 _20°C备用。SU5416 和 VEGF Receptor kinase inhibitor 2(VRI2)购于 Calbiochem(USA)，溶于DMSO中制成浓度分别为20mM和150 μ M的储备液，储于_20°C备用。试剂=Kaighn'smodification ofHam，s F12medium(F_12K)，小牛血清(FBS)，磷 酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素(P/S)，propidium iodide/RNase混合液和0. 25% (W/ V)胰蛋白酶/ImM EDTA(Trypsin-EDTA)购于 Invitrogen(USA)。内皮细胞生长素(ECGS)， 肝素，明胶均购于 Sigma (St Louis, M0)。XTT 检测试剂盒从 Roche (Mennheim, Germany)购 得。细胞培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC_12，ATCC，Manassas)采用F-12K培养，其中 含 2mM 的 L-谷氨酸、100U/ml 青霉素、100μ g/ml 链霉素、100μ g/ml 肝素、30μ g/ml ECGS 和10% FBS,于37°C 5% CO2培养箱中进行培养。实验中采用的细胞培养瓶及96孔板在使 用前先覆盖一层0. 的明胶。本发明中用3 8代HUVEC进行实验。斑马鱼的饲养及受精卵的收集Tg(fli_l:EGFP)转基因型的斑马鱼(Danio rerio)由斑马鱼国际资源中心提供(0regOn，P0)。这种转基因斑马鱼是在fli_l基因中插 入了绿色荧光蛋白基因，故而在转基因斑马鱼的血管内皮细胞中表达fii-i基因的同时也
4会表达绿色荧光蛋白。斑马鱼的饲养方法按照Zebrafish Book所描述进行。受精卵在清 晨由雌雄鱼交配后获得，然后将受精卵放于MilliQ水中，并于28. 5°C的培养箱中孵化。每 天更换孵化液及清理掉坏死的卵。实施例1 XTT法检测内皮细胞增殖取培养瓶中长至90%满的HUVEC，经清洗、消化后制成细胞悬液。计数后，按每孔 IxlO4个细胞接种于96孔板。培养24小时待细胞完全贴壁后，移去上层培养液，每孔加入 100 μ 1低血清培养液(0.5% FBS)再培养24小时，以同步细胞状态。实验组设不同浓度的 甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素(3 μ M 100 μ Μ)加药组别，每组8个复孔，按每孔200 μ 1加 入含药的VEGF(20ng/ml)低血清培养液。同时设置两组对照，空白对照组为含20ng/mlVEGF 和0. 1 % DMSO的培养液，阳性对照为5nM SU5416的培养液。经培养48小时后，利用XTT试 剂盒检测细胞活性(Cell viability)。从XTT结果显示，甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素能够剂量依赖的抑制由VEGF所诱 导的HUVEC增殖(如图2所示)。与对照组比较，甜橙黄酮和桔皮素在浓度为30 μ M以及川 陈皮素在浓度为60 μ M的时候，都能显著地(ρ < 0. 001)抑制VEGF所诱导的HUVEC增殖。 三者当中，以甜橙黄酮的抑制增殖效果最为明显，其半数抑制浓度(IC5tl)达24μΜ，桔皮素 和川陈皮素的半数抑制浓度则分别为31 μ M及62 μ Μ。实施例2斑马鱼动物实验斑马鱼胚胎药物诱导实验受精后一天大(Idpf)的斑马鱼胚胎，以摄子把卵 壳去除后，分装在12孔板内，每孔放入20个斑马鱼胚胎，每个孔为一组。之后将甜橙黄 酮、桔皮素和川陈皮素分别加入到不同组的孔内致每孔最终溶液为3ml及浓度为30 μ M， 并放到培养箱中培育24小时，到第二天(2dpf)在荧光共聚焦显微镜系统下观察节间血 管(Intersegmentalvessels, ISVs)禾口背纵轴血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel,DLAV)的形态。其中以 0. 1 % DMSO 作为溶液对照(vehicle control), 150nM VRI2 作为阳性对照(positive control) 0每组实验最少重复三遍。结果甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素在斑马鱼上的抑制血管新生作用受精后一天大的转基因斑马鱼Tg(fli_l :EGFP)胚胎在30 μ M的甜橙黄酮、桔皮素 和川陈皮素处理24小时后，通过荧光共聚焦显微镜系统观察发现，斑马鱼胚胎中的节间血 管形成受到不同程度的抑制(图4箭头1指示位置)。与XTT检测的结果相似，甜橙黄酮显 示出较佳的抑制活性，在30 μ M的浓度下已经可令节间血管的形成严重受阻。再与对照组 的斑马鱼胚胎比较，经甜橙黄酮处理后的斑马鱼胚胎只剩下一半的节间血管(图4C)。在川 陈皮素的药效方面，川陈皮素同样地可有效抑制节间血管的形成，其抑制能力仅次于甜橙 黄酮(图4Β)。在斑马鱼模型中，虽然桔皮素也显示出很强的抑制效果，但其效果较前两者 弱，这与细胞模型的结果有所差别(图4D)。甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素除了对斑马鱼胚胎中的节间血管有抑制外，三者同 时也会影响背纵轴血管(dorsal longitudinal anastomotic vessel,DLAV)的生成(图 4 箭头2指示位置)。实施例3内皮细胞的细胞周期检测将HUVEC培养在25cm2的培养瓶内并待其长满后以低血清培养液(0. 5% FBS)培养 24小时，以同步细胞状态。其后再以含有不同浓度的川陈皮素培养液(10%FBS)培养细胞。经用药处理24小时后，利用胰蛋白酶收集贴壁细胞，再以70%乙醇固定细胞并置于-20°C 中24小时。固定后的细胞经PBS冲洗一次后以propidium iodide (5 μ g/ml) /RNase (10 μ g/ ml)混合液对细胞进行染色30min。最后透过流式细胞仪对染色后的细胞進行分析。空白 对照组为含0. 1% DMSO培养液处理的细胞。经流式细胞仪分析后得知川陈皮素能显著地使HUVEC的细胞周期停顿于G0/G1期 (图3)。而且随着用药浓度的上升，停顿于G0/G1期的细胞数目也随之上升，因此呈剂量依 赖的关系。从结果中也可以看出川陈皮素能有效减少处于G2/M期的细胞数目。结论从斑马鱼动物实验得知，陈皮中的黄酮类化合物甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素的 确有效地抑制血管新生。利用人脐静脉内皮细胞的增殖进行考究其抑制的机理，从细胞增 殖的实验结果中发现，甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素有效抑制由血管内皮生长因子所诱导 的细胞增殖。而经川陈皮素处理后的细胞其细胞周期则停顿于G0/G1期，因此说明细胞增 殖受抑制的原因。由此得知，陈皮中的黄酮类化合物甜橙黄酮、桔皮素和川陈皮素是透过 调控血管内皮细胞的细胞周期继而抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制血管新生。因此，陈 皮中的黄酮类化合物可用于制备治疗与过度血管新生有关的疾病的药物，例如治疗视网膜 病变、牛皮癣、类风湿性关节炎、肥胖症、子宫内膜异位症及癌症等疾病的药物。当应用于制 备治疗癌症肿瘤药物时，通过抑制血管新生，从而阻断肿瘤血流营养供应达到治疗目的，而 不是如现有治疗药物直接抑制肿瘤细胞增殖。另外陈皮素一直仅被认为具有祛痰、松弛气 管等作用，本发明研究发现其对血管新生有抑制作用，因此对肺部血管炎症也有一定的影 响，为制备治疗呼吸疾病药物的研究提供了更开阔的思路。
权利要求
陈皮中黄酮类化合物在制备抑制血管新生药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的陈皮中黄酮类化合物的应用，其特征在于所述的陈皮中黄 酮类化合物为甜橙黄酮、桔皮素、川陈皮素中的一种或两种以上混合。
3.根据权利要求1或2所述的陈皮中黄酮类化合物的应用，其特征在于所述的抑制 血管新生是通过抑制血管内皮细胞增殖实现的。
4.根据权利要求1所述的陈皮中黄酮类化合物的应用，其特征在于所述的药物剂型 为医学上认可的任何一种剂型。
5.根据权利要求4所述的陈皮中黄酮类化合物的应用，其特征在于所述的剂型为粉 剂、注射液、胶囊、片剂或口服液。
6.陈皮中黄酮类化合物在制备治疗视网膜病变药物中的应用。
7.陈皮中黄酮类化合物在制备治疗牛皮癣药物中的应用。
8.陈皮中黄酮类化合物在制备治疗癌症药物中的应用。
9.陈皮中黄酮类化合物在制备治疗肥胖症、子宫内膜异位症、类风湿性关节炎药物中 的应用。
10.陈皮中黄酮类化合物在制备治疗肺部炎症引起的急、慢性支气管炎，哮喘药物中的 应用。
全文摘要
本发明公开了陈皮中黄酮类化合物，如甜橙黄酮、桔皮素或川陈皮素等在制备抑制血管新生药物中的应用，其是通过抑制血管内皮细胞增殖，从而抑制血管新生，继而治疗与过度血管新生有关的疾病(例如视网膜病变、牛皮癣、癌症、肥胖症药物、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症以及肺部炎症性引起的支气管炎、哮喘等)。
文档编号A61P11/00GK101947215SQ20101021949
公开日2011年1月19日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者张在军, 徐国荣, 李铭源, 杨子峰, 林启兴, 林衍祺, 金洪传 申请人:澳门大学