专利名称：靶向hIL-10重组蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及免疫学领域的机体免疫功能调节及基因 的重组表达技术领域，进一步指人白细胞介素10 (human interlenkin 10, hIL-10)与新生 血管内皮特异结合的RGD多肽在基因水平融合后所表达的重组蛋白及其该重组蛋白应用。
背景技术：
1989年Fiorentino等发现小鼠Th2细胞株产生一种新的细胞因子，能抑制Thl细 胞株细胞因子mRNA的转录，称为细胞因子合成抑制因子(cytokinesynthesis inhibitory factor，CSIF)，同年命名为白细胞介素10 (interlenkin 10，IL_10)。人成熟IL-10分子为 160氨基酸残基，分子量18. 7kDa, pI8. 1。白细胞介素IO(IL-IO)是人体多种细胞产生的重要免疫调节细胞因子，具有广泛 的生物学活性，包括免疫抑制、抗炎及免疫调节特性，主要生物学功能是限制和终止炎症反 应，调节多种免疫细胞的分化和增殖，同时也具有调理免疫刺激的特性，清除感染和非感染 的颗粒。体内外和动物实验表明IL-I在炎症、恶变和自身免疫性疾病方面都发挥了重要功 能，在临床上应用于治疗急、慢性炎症疾病、自身免疫性疾病如炎性肠炎、类风湿性关节炎、 克隆病、多发性硬化症、银屑病等。然而，由于ανβ3、α νβ5整合素在成体正常组织缺乏，而在血管发生过程中选择 性上调升高。RGD多肽(⑶CRGDCFC，9肽)能够特异性结合α ν β 3、α ν β 5整合素，是新生血 管内皮细胞特异性结合的多肽序列。将新生血管内皮特异结合的R⑶导向肽与IL-10融合 表达，既可以降低用药剂量及治疗成本，减轻用药带来的毒副作用；同时更为重要的是在体 内能够使IL-10药物“靶向”到达体内作用部位而有效发挥药理作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向hIL-10重组蛋白(简称ThIL-IO)及其应用，该 重组蛋白既保持了 hIL-10的生物学活性，又增加了 hIL-10在体内的靶向性，不仅赋予了该 蛋白具有与hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性，更为重要的是其在伤 口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕的形成。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种靶向hIL-10重组蛋白，其氨基 酸序列如下所示H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe ProGly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys ThrPhe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu GluAsp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr LeuGlu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn SerLeu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe LeuPro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu GlnGlu Lys Gly lieTyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn TyrIle Glu Ala TyrMet Thr Met Lys lie Arg Gln Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH,其中‘H2N-’代表蛋白质氨基端(N末端)，‘-C00H’代表蛋白质羧基端(C末端)。上述靶向hIL-10重组蛋白在作为治疗增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病药物的应用。本发明与现有技术相比，本发明通过基因工程手段把人白细胞介素 10(humaninterlenkin 10, hIL-10)与新生血管内皮特异结合的RGD多肽在基因水平融 合后表达的重组蛋白，重组后形成了一种新的蛋白(ThIL-IO)，并且赋予了该蛋白具有与 hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性；更为重要的是ThIL-IO在伤口愈 合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，从而预防抑制瘢痕的形成。
图1是IL-10氨基酸序列序列表。图2是靶向hIL-10的重组蛋白氨基酸序列表。
具体实施例方式本发明通过基因工程手段把人白细胞介素10 (human interlenkin 10，hIL_10)与 新生血管内皮特异结合的R⑶多肽在基因水平融合后表达的重组蛋白(ThIL-IO)。所述的 hIL-10，其氨基酸序列如下H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro GlyAsn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr PhePhe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu AspPhe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu GluVal Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu GlyGlu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro CysGlu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu LysGly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn TyrIle Glu Ala Tyr Met ThrMet Lys lie Arg Gln-COOH ；所述新生血管内皮特异结合的RGD导向肽，其氨基酸序列如下H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH, iH2N-'代表蛋白质氨基端(N 末端)，‘-C00H’代表蛋白质羧基端(C末端)；融合后的ThIL-IO的氨基酸序列如下H2N-Met Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro GlyAsn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr PhePhe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu AspPhe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met lie Gln Phe Tyr Leu Glu GluVal Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp lie Lys Ala His Val Asn Ser Leu GlyGlu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro CysGlu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu LysGly lie Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp lie Lys lie Asn TyrIle Glu Ala Tyr Met ThrMet Lyslie Arg Gln Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys Phe Cys-COOH, ‘H2N-，代表蛋白质氨基端(N 末端)，‘-C00H’代表蛋白质羧基端(C末端)。实施例1 :ThIL_10在大肠杆菌中表达、纯化及生物学活性测定(一)ThIL-IO 基因的获得1.总RNA的提取正常人外周血经淋巴细胞分离液分离单个核细胞，PBS洗涤2次，重悬于10% RPMI 1640培养液，加入终浓度为10g/L的ConA，置5% C02培养箱，37°C培养48h，收集细胞。参 照RNA抽提试剂盒的方法，抽提总RNA，-80°C保存备用。2.总RNA的提取及IL-IOcDNA的扩增用Takara公司RNA提取及反转试剂盒，按说明抽提总RNA，进行RT-PCR反应总 RNA 500ng，5X 逆转录Buffer2y l，oligo dT 0. 5 μ l,6mer 0· 5 μ 1，AMV逆转录酶 0· 5 μ 1， DEPC水加至10 μ 1。37°C温育30min，后85°C温育3min使逆转录酶失活，得到细胞cDNA。( 二 )载体的构建、表达及其鉴定1. pMD18-T克隆载体的构建按大肠杆菌惯用密码子设计RGD基因序列、引物及相应的酶切位点，合成如下2条 引物F1、F2。RGD 导向肽氨基酸序列如下:H2N-Cys Asp Cys Lys Gly Asp Cys PheCys-COOH ；RGD 基因序列5，tgt gat tgc cgt ggt gat tgt ttc tgt 3，；Fl :5，catatgagcccaggccagggcacccagtctgagaacag3，；F2 5' gtcgactcaacagaaacaatcaccacggcaatcacagtttcgtatcttcattgtc3'；以Fl、F2 为引物，以 cDNA 为模板，随之按 95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，30 个循 环后72°C进行延伸12min，得到PCR产物，产物回收连入pMD18_T载体，进行酶切鉴定和序 列测定，得到PMD18T-IL10-RGD重组克隆载体。2. pET-ILlO-RGD表达载体的构建测序正确的pMD18T-IL10-RGD重组克隆载体及原核pET_22b⑴表达载体，分别经 Ndel/Sall双酶切，回收目的片段进行连接，连接产物转化BL21 (DE3)，挑取克隆，同样回收 质粒，酶切鉴定，进一步经测序鉴定，构建成pET-ILlO-RGD表达载体的工程菌。3. ThIL-IO重组蛋白在大肠杆菌中的表达上述工程菌pET-IL10-RGD/BL21接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37 °C振荡培 养过夜，次日以2%的接种量接种到同样的培养基中，继续在37°C振荡培养至对数生长中 期、培养液光密度0D_为0. 5 0. 6时，加入IPTG继续培养4 5hr诱导表达，离心收集 菌体。4、ThIL-IO蛋白表达的检测及鉴定将诱导表达的菌体培养物离心，收集菌体，采用12%的SDS-PAGE电泳分析表达产 物，IPTG诱导者与未诱导者相比，在分子量相应处有一条明显的深染新生蛋白带，与预计融 合蛋白的分子量大小相符。将蛋白从凝胶电转移至PVDF膜上，常规Western blot分析，ECL 发光，可见一明显显色带，分子量一致。未诱导菌株，标准蛋白及表达菌中其它条带无阳性 反应。(三)基因工程菌的培养及高密度发酵
1. 一级种子的制备挑选LB(含氨苄青霉素)平板上的单菌落接种于IOml LB(含氨苄青霉素)液体 培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜。2.发酵种子液的培养把一级种子按2%的接种量接种于适量的改良的LB液体培养基(含氨苄青霉素) 中，同样条件下培养菌体的密度至0D_为1. 5-2左右。3、基因工程菌的高密度发酵按5%的接种量把发酵种子液接种于含蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、硫酸铵、硫酸 镁、磷酸盐、甘氨酸和甘油等为主要成分的复合培养基中，搅拌速度为100-800rpm，溶氧控 制在20-40%，温度为37°C条件下，补料流加至OD6tltl约为30时，加入终浓度为lmmol/L的 IPTG，再发酵4hr离心收集菌体。(四)TIL-10融合蛋白的纯化1.融合蛋白的粗提如图1 所示，取诱导表达的菌体30g，用 150mL 20mmol/L pH6. 8 的PB (1. 5ml Imo 1/ LMgCl2,3. 5mgDNase,适量EDTA)细胞破碎仪破碎细胞，4°C搅拌裂解3hr。经聚丙烯酰胺 凝胶电泳检测发现表达的融合蛋白存在于上清和沉淀中，说明诱导表达的重组蛋白是以可 溶性及包涵体形式存在的。4°C 12000rpm离心15min，收集上清，装入透析袋，用pH6. 8的 IOmmol/L的PB透析24_36hr，换液2_3次，离心收集上清液。2.包涵体的溶解及复性裂菌沉淀IL-10包涵体经洗涤、尿素溶解，于4°C在复性缓冲液的逐渐稀释下缓慢 复性。3、融合蛋白的纯化取阳离子交换基质SP-S印harose Fast Flow装柱，柱体积5. 4X 20cm，用IOmmol/ L pH6. 8的PB平衡，上样后用含0. 5mol/L NaCl的lOmmol/L pH6. 0的PB线性梯度洗脱，收 集主峰即得到融合蛋白。即为ThIL-10，氨基酸序列如图2所示。(五)ThIL-IO的生物活性测定MC/9细胞来源于小鼠的肥大细胞，在小鼠IL-4或IL_3以及小鼠IL-10或人IL-10 的协同刺激下生长繁殖，且细胞数量随着IL-10浓度的增加而增长，具体如下给100 μ 1 MC/9细胞(2 X IO4细胞/ml)加入小鼠IL-420U、人IL-10标准品2U或 表达的ThIL-10，37°C,5% C02孵箱培养72hr，台盼蓝染色，血细胞计数板计数MC/9活细胞 数。根据细胞数量计算IL-10的活性单位，与对照组mIL-4、阴性上清液比较差异均无显著 意义(ρ > 0. 05)，而IL-10标准品和表达的ThIL-IO均能刺激MC/9细胞的增殖，细胞数量 与单抗中和组、阴性对照组比较差异均有显著意义(P < 0. 05)。因此，大肠杆菌表达的可溶 性和包涵体复性的IL-10均具有生物学活性。经ELISA定量检测及MC/9细胞的活性分析， 粗制品的可溶性和包涵体复性IL-10的比活性分别为1. 02X 104U/mg和4. IX 102U/mg。实施例2 =ThIL-IO抑制瘢痕增生试验(一 )增生性瘢痕组织烧伤愈合后4个月的前胸增生性瘢痕组织(病理证实)，颜色红、质硬，高出正常皮 肤约4 7謹。应用BALA/c-nu雄性小鼠30只，6 8周龄，体重18 20g。
( 二 )烧伤后增生性瘢痕的动物模型的制备去除增生性瘢痕下脂肪组织，将瘢痕切成6mmX 5mmX 3mm大小组织块，置于预冷 DMEM(含青霉素、链霉素双抗各100U/ml)的培养液中，无菌条件下在裸鼠肩胛皮肤作一小 切口，将瘢痕组织小块移植在皮下，不予缝合。在3h内完成30只动物模型。观察动物模型 有无感染、排斥反应，选择稳定的瘢痕模型作为治疗动物使用。瘢痕模型建立20d，此时增生 性瘢痕血液循环建立，瘢痕稳定。(三)实验动物分组实验分为对照组、hIL-10标准组及ThIL-IO大剂量治疗组、中剂量治疗组、小剂量 治疗组，裸鼠数目每组分别为6只，采用瘢痕内注射的方法，IL-10为10 μ g/ml 次，ThIL-IO 分别为5、10和20 μ g/ml 次，200 μ 1/次，3次/周，总共治疗3周；对照组每次仅给以PBS， 其余相同。停药3d后取材，用游标卡尺直接测量瘢痕最大径a和最小径b换算成瘢痕体积， 公式为V = ab2/2。与对照组相比，IL-10及ThIL-IO个治疗组，均能明显抑制瘢痕的生长 (如表 1. ρ < 0. 05)。表1治疗前后瘢痕体积变化(mm3)
组别移植前治疗3周后对照组90. 0 士 0. 470. 0 士 2. 9hIL-1090. 0 士 0. 348. 2 士 3. 2*ThIL-IO低剂量组90. 0 士 0. 450. 8 士 6. 1*ThIL-IO中剂量组90. 0 士 0. 641. 2 士 7. 3*ThIL-IO高剂量组90. 0 士 0. 738. 6 士 6. 5**p < 0. 05vs 对照组(四)HE、Masson染色形态学观察在光学显微镜下各组瘢痕组织外周均有一层纤维结缔组织包膜包绕。对照组的瘢 痕组织内有大量成纤维细胞样细胞，贴近包膜处有血管存在，胶原纤维粗大，漩涡状排列。 各治疗组瘢痕组织内成纤维样细胞少见，胶原稀疏，排列较整齐，大剂量治疗组尤其显著。(五)透射电镜形态学观察对照组还保持着增生性瘢痕组织形态学特点，成纤维细胞多见，细胞器丰富，粗面 内质网显著扩张，间质可见粗大胶原纤维束，呈漩涡状、结节状排列；有较多的毛细血管，血 管内皮细胞生长旺盛，突出于血管腔，使血管腔呈部分闭塞状。各治疗组表现为较多坏死、 凋亡的成纤维细胞；部分成纤维细胞及血管内皮细胞则表现为空泡变性，部分成纤维细胞 体积较小，粗面内质网不扩张，核浆比增大，呈现为典型纤维细胞的特点；间质胶原束较稀 疏，排列较整齐。
权利要求
一种靶向hIL 10重组蛋白，其氨基酸序列如附图2所示。
2.权利要求1所述的靶向hIL-10重组蛋白在作为治疗增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病药 物的应用。
全文摘要
本发明属基因工程领域，涉及靶向hIL-10的重组蛋白及其应用。本发明重组蛋白是由人白细胞介素10(human interlenkin 10，hIL-10)与新生血管内皮特异结合的RGD多肽在基因水平融合后表达的重组蛋白，重组后形成了一种新的蛋白。该蛋白具有与hIL-10同样的抗病毒、抗肿瘤以及机体免疫功能的活性；更为重要的是ThIL-10在伤口愈合过程中能够与新生血管内皮细胞特异靶向结合，作为治疗增生性瘢痕及瘢痕疙瘩疾病药物的应用中，可预防抑制瘢痕的形成。
文档编号A61K47/48GK101891826SQ201010241529
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月30日 优先权日2010年7月30日
发明者张战风, 白晓智, 石继红, 胡大海 申请人:中国人民解放军第四军医大学