专利名称：用于生长因子信号转导的靶标和治疗方法
技术领域：
本发明涉及转谷氨酰胺酶相关疾病的治疗和/或预防。更具体地，本发明涉及靶向转谷氨酰胺酶和胰岛素样生长因子和/或胰岛素样生长因子受体家族的成员之间的相互作用以开发治疗药物以及利用该药物的治疗方法。
背景技术：
胰岛素样生长因子(IGF)轴是一个复杂的网络，包括两个配体IGF-I和IGF-II、众多细胞膜受体以及依次结合于其它活性配体的六个高亲和力的可溶性蛋白3的各种亚型。 这个网络对于正常生长和发育是必不可少的，特别是免疫系统、淋巴系统3和肌肉骨骼系统 4_6的正确发育和发挥功能以及在愈伤7中。在另一方面，在其它病理状态中，IGF信号通路调节的阻断牵涉到癌症8、动脉粥样硬化9和受损伤口愈合“1。基于这些原因，IGF网络是大量研究的主题，特别是与疾病如心脏疾病9、慢性伤口 7’1(1、肌萎缩性脊髓侧索硬化症6、肌肉萎缩症“和癌症8的治疗潜力有关的研究。此外， IGF-I、玻连蛋白(VN)和IGF结合蛋白(IGFBI3s)的复合物被用作有效的上皮再生的刺激物，它们通过共同活化IGF-I受体(IGFlR)和结合玻连蛋白的α ν整合素12发挥作用。发明概述在第一个方面，本发明提供筛选、设计、改造或以其它方式制备转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物的方法，所述方法包括确定候选药物是否能够调节以下物质之间的相互作用的步骤⑴转谷氨酰胺酶(TG)和胰岛素样生长因子(IGF)；和/或(ii) TG和IGF受体家族的成员。在第二个方面，本发明提供根据第一个方面的方法设计、改造、筛选或以其它方式制备的转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物。在第三个方面，本发明提供用于治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的药物组合物，其包括所述第二个方面的治疗药物以及药用稀释剂、载体或赋形剂。在第四个方面，本发明提供用于治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的药物组合物，其包括选自下组的治疗药物⑴分离的TG，或其片段；(ii)分离的TG底物，或其片段；(iii)与分离的多肽或其片段一起结合于胞外基质或与胞外基质相互作用的分离的IGF氨基酸序列或其类似物；及(iv)TG和IGF之间相互作用的调节物；以及药用稀释剂、载体或赋形剂。优选地，分离的TG底物选自酰基供体底物和酰基受体底物。在优选实施方案中，酰基供体底物包括谷氨酰胺残基。在另一个优选实施方案中，酰基受体底物包括赖氨酸残基。在第五个方面，本发明提供治疗动物体内转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的方法，其包括给所述动物施以下列物质的步骤根据所述第二个方面，对转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物；和/或根据所述第三或第四个方面的药物组合物，由此治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状。在第六个方面，本发明提供治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的方法， 所述方法包括调节下列物质之间相互作用的步骤(i) TG 禾口 IGF ；禾口 / 或(ii) TG和IGF受体家族的成员，从而治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状。在所述第六个方面的优选实施方案中，本发明提供调节细胞迁移和/或增殖的方法，此时调节物调节TG与IGF和/或TG与IGF受体家族的成员之间的相互作用，从而调节细胞迁移和/或增殖。更优选地，所述调节细胞迁移和/或增殖的方法是促进细胞迁移和/或增殖的方法。甚至更优选地，所述促进细胞迁移和/或增殖的方法涉及到促进或诱导上皮细胞迁移和/或增殖，以促进伤口愈合，治疗溃疡、烧伤等和/或哺乳动物优选为人类的皮肤再生。在其它优选实施方案中，所述调节细胞迁移和/或增殖的方法是防止细胞迁移和 /或增殖的方法。更优选地，所述防止细胞迁移和/或增殖的方法涉及到防止或抑制癌细胞转移， 过度增殖病症如疤痕、牛皮癣和动脉粥样硬化。在其它的优选实施方案中，所述调节细胞迁移和/或增殖的方法涉及到调节抗化疗肿瘤中的细胞迁移和/或增殖。优选地，所述第六个方面的方法涉及到动物。在所述第五或第六个方面的优选实施方案中，所述动物是哺乳动物。甚至更优选地，所述哺乳动物是人类。所述第五或第六个方面的优选实施方案可能涉及到的预防性治疗方法和/或治疗方法。在第七个方面，本发明提供分离的蛋白复合体，包括(i) TG或其片段以及IGF或其片段；(ii) TG或其片段以及IGF受体家族的成员或其片段。在前述的任一方面的优选实施方案中，所述IGF受体家族成员选自IGF-I和 IGF-II。 更优选地，所述IGF为IGF-I。在前述的任一方面的优选实施方案中，所述IGF受体家族成员选自下组IGF-I受体、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGFl杂合受体。更优选地，所述IGF受体家族成员选自下组IGF-1受体、胰岛素受体和胰岛素-IGFl杂合受体。
甚至更优选地，所述IGF受体家族成员是IGF-I受体。在前述的任一方面的优选实施方案中，所述TG选自下组FXIII、TGI、TG2、TG3、 TG4、TG5、TG6 禾P TG7。更优选地，所述TG选自FXIII和TG2。甚至更优选地，所述TG是TG2。在优选实施方案中，前述任一方面的调节物选自下组分离的肽、分离的多肽、分离的核酸和有机小分子。所述分离的核酸可编码蛋白调节物，或者，所述分离的核酸本身可能具有调节物的活性如，但不仅限于，RNAi分子或核酶。在特别优选的实施方案中，所述调节物是抗体，更优选是单克隆抗体。在某些优选实施方案中，所述抗体结合和/或作用于TG。在其它优选实施方案中，所述抗体结合和/或作用于IGF或IGF受体家族的成员。在涉及IGF受体家族成员的优选实施方案中，所述调节物是抗体。在其它优选实施方案中，所述调节物是包括IGF或至少能够结合同源IGF受体以及玻连蛋白(VN)或纤维粘连蛋白(FN)的IGF的域，或至少VN或FN的结合整合素的域的分离的蛋白复合物。在前述任一方面的优选实施方案中，所述调节物是选择性调节物。在前述任一方面的优选实施方案中，所述调节物选自激活剂和抑制剂。在优选实施方案中，所述激活剂是GDP-抑制的TG激活剂。在其它优选实施方案中，所述激活剂选自包括聚阴离子氨基酸序列的分离的肽、 分离的多肽和分离的蛋白复合物。优选地，所述聚阴离子氨基酸序列是VN的聚阴离子结构域。更优选地，所述VN的聚阴离子结构域是与成熟VN(SEQ ID NO 2)的53_64氨基酸对应的聚阴离子区。在前述任一方面的优选实施方案中，所述调节物调节TG的底物位点。更优选地， 所述底物位点包括选自赖氨酸和谷氨酰胺的氨基酸残基。在某些优选实施方案中，所述调节物是TG底物供体位点的抑制剂。在某些优选实施方案中，所述调节物是用于TG底物供体位点的抑制剂。更优选地，所述调节物是底物供体位点的竞争性抑制剂，如单官能团的伯胺 (monofunctional primary amine)0然而更优选地，所述单官能团的伯胺是单丹磺酰戊二胺 (monodansylcadaverine) 0在其它优选实施方案中，所述抑制剂是非交联的分离的IGF和/或IGF受体家族的成员。优选地，所述非交联的分离的IGF选自IGF-I和IGF-II。在优选实施方案中，所述非交联的分离的IGF是分离的突变IGF，其包括与野生型 IGF-I氨基酸序列相关的一个赖氨酸残基突变。优选地，所述赖氨酸残基选自下组赖氨酸 27、赖氨酸65和赖氨酸68。更优选地，所述赖氨酸残基是赖氨酸68。在其它优选实施方案中，所述非交联的分离的IGF-I是分离的突变IGF-I，其包括与野生型IGF-I氨基酸序列相关的一个谷氨酰胺残基突变。优选地，所述谷氨酰胺残基选自下组与野生型IGF氨基酸序列相关的谷氨酰胺15和谷氨酰胺40。在其它优选实施方案中，所述调节物是非交联的IGF受体家族成员。在涉及IGFlR 的优选实施方案中，所述分离的突变IGFlR是包括谷氨酰胺供体残基突变的分离的突变。 更优选地，所述IGF中的谷氨酰胺供体位点选自下组与野生型IGFlR氨基酸序列相关的谷氨酰胺14、谷氨酰胺15、谷氨酰胺399、谷氨酰胺400、谷氨酰胺观7、谷氨酰胺318、谷氨酰胺321、谷氨酰胺396、谷氨酰胺511、谷氨酰胺596、谷氨酰胺619和谷氨酰胺623。在涉及IGFlR的其它优选实施方案中，所述分离的突变IGFlR是包括赖氨酸残基突变的分离的突变。优选地，所述赖氨酸残基选自下组与野生型IGFlR氨基酸序列相关的赖氨酸159、赖氨酸191、赖氨酸498、赖氨酸530和赖氨酸600。在上述任一优选实施方案中，所述突变选自插入、替代和缺失。更优选地，所述突变是替代。在进一步的优选实施方案中，上述抑制剂是TG特异性抑制剂。在特别优选的实施方案中，所述TG特异性抑制剂包括3-卤代-4，5- 二氢异噁唑基团。在优选实施方案中，前述任一方面的药物组合物进一步包括IGF。更优选地，所述 IGF选自IGF-I和IGF-II。甚至更优选地，所述IGF是IGF-I。优选地，前述任一方面的药物组合物能够治疗或预防转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状。在前述任一方面的优选实施方案中，上述转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状是细胞迁移和/或增殖相关的病症、疾病和/或症状。在优选实施方案中，上述细胞迁移和/或增殖相关的病症、疾病和/或症状选自下组伤口愈合、牛皮癣、动脉粥样硬化、癌症、抗化疗的肿瘤、烧伤、溃疡和增生性疤痕。在其它的优选实施方案中，所述相关病症、疾病和/或症状是自身免疫性疾病。更优选地，上述自身免疫性疾病是糖尿病，甚至更优选地，是I型糖尿病
虽然本发明优选针对于人类，应知道本发明也适用于其它哺乳动物，如牲畜、家畜、家养宠物等。纵观本发明，除非文意另有所指，单词“包括(comprise)”、“包括(comprises) ”和 “包括(comprising) ”将被理解为包含所述整体或整体的组，但不排除其它任何整体或整体的组。
为使本发明易于理解并产生实际效果，通过举例的方式，参照附图来说明优选的实施方案图1 (a)与FXIII和PEG反应60分钟后形成的带有谷氨酰胺(左道)或赖氨酸 FXIII底物(右道)的IGF-I蛋白质印迹(Western blot)。该结果表明IGF-I含有转谷氨酰胺酶的赖氨酸供体底物。(b) IGF-I的三维结构，推测D区的FXIII位点为确定的受体结合的重要的相关残基。图2 TG2介导的IGF-I信号转导通路的假定机制的概述。图3 (a)人 IGFlR(顶部；SEQ ID NO 5)与小鼠(SEQ ID NO 6)、(日本)鹌鹑(SEQ ID N0:7)和青蛙(SEQ ID NO :8)，以及与人IR(底部；SEQ ID N0:9)N_端序列的 BLAST/CLUSTAL W比对。人顶直接与人IGFlR比较。14和15位的谷氨酰胺残基似乎是相对较新的添加，发生于哺乳动物和鸟类分化后。(b) IGF1R-IGF-I复合物1模型的代表， IGF-I的D-域赖氨酸残基和IGFlR Gln 14和15所示为空间填充。不同于人顶中其对等物(counterpart)的IGFlR N末端结构域的其它残基以棍(sticks)表示。Glnl4和15周围的表面发生了显著的变化。图4由TG2催化的IGF-I与胰高血糖素的反应。1道IGF_I对照；2道IGF_I+TG2 ； 3 道:TG2 对照；4 道=Gn 对照；5 道:IGF-I+Gn ；6 道:TG2+Gn ；7 道TG2+Gn+IGF_I。(Gn =胰高血糖素)图5由TG2催化的IGF-IR与IGF-I反应的蛋白质印迹。由左至右的道表示如下 分子量标志物(marker)；单独的 IGF-I ；IGF-I+IGF1R，无 TG2 ；IGF-I+TG2 ；IGF1R+TG2,无 IGF-I ； IGF-I+IGF1R+TG2 ；单独的TG2 ；单独的IGFlR ；分子量标志物。发明详述本发明的转谷氨酰胺酶蛋白底物本发明部分涉及通过调节TG赖以发挥其酶活性的TG和底物蛋白之间的相互作用而调节胰岛素样生长因子信号转导通路。本发明提供了最广泛形式的调节TG和本发明底物蛋白之间的相互作用的治疗方法，以及利用以这种相互作用作为靶标，发现对TG-相关病症、疾病和/或症状，特别是本文中所述的细胞迁移和/或增殖-相关疾病治疗有效的治疗药物的方法。胰岛素样生长因子IGF信号转导通路的失调牵涉到许多治疗费用昂贵的临床相关疾病。为此，IGF信号转导通路中新的潜在靶标的阐述可能为药物开发提供迄今未实现的机会。因此本发明部分地，确认IGF信号转导通路的一个或多个方面的调控或修饰的可替代靶标的需要，从而提供用于众多IGF相关疾病治疗的潜在地有效的治疗药物。因此，本发明的一种形式是广泛涉及利用或开发以转谷氨酰胺酶的方式，IGF与其它蛋白交联的能力，以调控或调节IGF信号转导通路用于治疗或预防疾病。在广泛的形式中，本发明的前提是，至少部分地基于IGF-I为转谷氨酰胺酶的活性底物的发现。这一发现可能对IGF-I与其它蛋白，特别是与胞外基质和/或IGF-IR蛋白的交联具有潜在重要的关联。发明人设想TG和IGF之间相互作用的调节提供了调控临床上重要的IGF信号转导通路的其它途径。此外，发明人已证实，TG使IGF-I与IGF-I受体、IGF-1R交联。推测这种IGF-I和 IGF-IR之间复合物的交联形式可被内摄入细胞中，可能是IGF-I信号转导的重要一步。因此，本发明提供了最广泛形式的调节IGF-TG相互作用的治疗方法，以及以 IGF-TG的相互作用为靶标靶标，寻找对TG-相关病症、疾病和/或症状，优选本文中所述的细胞迁移和/或增殖-相关疾病的治疗有效的治疗药物的方法。在总的方面，本发明涉及药物组合物、治疗药物以及筛选和/或使用该调节TG和 IGF之间相互作用的物质的方法。优选地，IGF选自 IGF-I 和 IGF-II。甚至更优选地，IGF是IGF-I。
胰岛素样生长因子受体家族在另一个广阔的形式中，本发明涉及作为转谷氨酰胺酶底物的IGF受体家族成员。虽然不希望受到任何特定的理论的约束，发明人推测TG-IGF受体相互作用是一个控制开关，它决定了 IGF受体的命运，从而提供用于各种不同反应，如有丝分裂、迁移或分化的触发或控制开关。本发明的前提是，至少部分基于发现IGFlR是TG2的底物。此外，TG2能够使IGFlR与IGF-I交联。胰岛素样生长因子(IGF)受体家族(在本领域中也称为胰岛素受体家族)包括 IGFlR(别名JTK13)、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGF杂合受体。优选地， 胰岛素-IGF杂合受体是胰岛素-IGFl杂合受体。IGF受体家族成员都非常相似。IGF受体家族的成员以共价结合受体二聚体存在于细胞表面。IGF受体可作为同源二聚体存在，或者作为由一半的IGF受体家族和一半不同的IGF受体家族成员组成的杂合受体存在。在优选实施方案中，IGF受体家族成员选自下组IGF1R、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGF杂合受体。更优选地，所述IGF受体选自下组IGF_1R、胰岛素受体和胰岛素-IGF杂合受体。甚至更优选地，所述IGF受体选自IGF-IR和胰岛素-IGF杂合受体。而甚至更优选地，所述IGF受体是IGF1R。本领域中已知的“转谷氨酰胺酶”或“TG”表示一种酶，其具有除其它外，使一种或多种蛋白通过合适的蛋白结合态(protein-bound)谷氨酰胺的酰胺基团和蛋白结合态赖氨酸的ε -氨基之间的酰基转移反应而交联的催化能力或酶活性，结果在一种蛋白或肽上的谷氨酰胺(“酰基供体”)残基与来自生物多胺，如尸胺、腐胺或精胺的伯胺(“酰基受体”)之间形成ε-(Y-谷氨酰基)赖氨酸异构肽键，或在一种去质子化的赖氨酸供体残基蛋白和另一种蛋白的谷氨酰胺残基受体之间，在另一种蛋白或肽上形成合适的赖氨酸残基键。转谷氨酰胺酶还可以通过谷氨酰胺残基作为供体位点使一种或多种蛋白交联。参考 Griffin 等人 Biochem J (2002) 368 :377-396 以及 Lorand 和 Graham000；3)自然评论分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular Cell Biology)4 :140_156，提供合适的转谷氨酰胺酶的非限制性实例(如适用，包括每个转谷氨酰胺酶的同义词)，通过参考并入于此。适当地，本发明的丁6选自下组疋父111、161、162、163、丁64、TG5、TG6和TG7。在优选实施方案中，所述TG选自FXIII和TG2。甚至更优选地，所述TG是TG2。在涉及IGF-I的特别优选实施方案中，所述TG是TG2。鉴于上述情况，应理解在优选实施方案中，TG和其底物蛋白之间的相互作用是通过赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基的方式。在涉及IGF-I的优选实施方案中，赖氨酸残基选自与野生型IGF-I的氨基酸序列相关的赖氨酸27、赖氨酸65和赖氨酸68。甚至更优选地，所述赖氨酸残基是赖氨酸68。在其它涉及到TG与IGF-I之间通过TG谷氨酰胺供体位点的方式发生相互作用的实施方案中，优选所述谷氨酰胺残基选自与野生型IGF-I氨基酸序列相关的谷氨酰胺15和谷氨酰胺40。在优选实施方案中，所述谷氨酰胺残基是谷氨酰胺40。
在其它涉及IGF-II的优选实施方案中，所述谷氨酰胺残基和/或赖氨酸残基选自与野生型IGF-II氨基酸序列相关的谷氨酰胺18和赖氨酸65。在涉及到TG与IGF-IR之间相互作用的特别优选实施方案中，谷氨酰胺供体位点选自与野生型IGF-IR氨基酸序列相关的下组物质谷氨酰胺14、谷氨酰胺15、谷氨酰胺399、谷氨酰胺400、谷氨酰胺观7、谷氨酰胺318、谷氨酰胺321、谷氨酰胺396、谷氨酰胺 511、谷氨酰胺596、谷氨酰胺组619和谷氨酰胺623。在涉及IGFlR的优选实施方案中，赖氨酸残基选自与野生型IGF-IR氨基酸序列相关的下组物质赖氨酸159、赖氨酸191、赖氨酸498、赖氨酸530和赖氨酸600。在涉及到TG和胰岛素受体和/或IGF-胰岛素杂合受体之间相互作用的优选实施方案中，谷氨酰胺供体位点选自与野生型胰岛素受体氨基酸序列相关的谷氨酰胺177和谷氨酰胺521。在涉及到TG和胰岛素受体和/或IGF-胰岛素杂合受体之间相互作用的其它优选实施方案中，赖氨酸残基选自与野生型胰岛素受体氨基酸序列相关的下组物质赖氨酸 164、赖氨酸166、赖氨酸沈5、赖氨酸沈7、赖氨酸460、赖氨酸508、赖氨酸649和赖氨酸652。应理解，在涉及到IGF-胰岛素杂合受体、与TG相互作用的实施方案中，可通过前述的仅用于IGF-IR的残基的方式，通过前述的用于胰岛素受体的残基及其组合的方式。筛选方法和治疗药物在特定的方面，本发明广泛涉及筛选、设计、改造或以其它方式制备TG-相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物的方法，其包括调节TG和本发明的底物蛋白之间的相互作用的步骤。应该很容易理解，术语“调节(modulate) ”，“调节(modulation) ”，“调节物 (modulator) ”或“调节(modulating) ”包括在其范围内涉及防止、破坏、抑制、阻止或妨碍， 或者激活、促进、增加或增强了 TG和IGF和/或TG和IGF受体家族的成员之间的相互作用的行为。应理解，调节物可以是TG和本发明的底物蛋白之间相互作用的间接调节物，或TG 和本发明的底物蛋白之间相互作用的直接调节物。“抑制(inhibition) ”或“抑制(inhibit) ”是指阻止、干扰、防止、破坏或以其它方式降低生物活性，包括完全阻止生物活性。举例来说，“抑制(inhibition)”可以指生物活性下降约 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。“激活(activation) ”或“激活(activate) ”是指促进、增强或以其它方式提高生物活性。举例来说，“激活(activation)”可以指生物活性提高约10%,20%,30%,40%, 50%、60%、70%、80%、90% 或 100%。在优选实施方案中，调节物是选择性调节物。在优选实施方案中，选择性调节物是选择性激活剂或选择性抑制剂。设想“选择性的(selective)”或“选择性地 (selectively) ”是指本发明的调节物主要影响特定的TG和本发明的底物蛋白之间的相互作用，但也可能有其它交互影响。举例来说，某些实施方案包括的情况中，调节物可通过主要调节TG2来选择性地调节TG2和IGF-I之间的相互作用，但也有可能对其它TGjn TG1、 TG3、TG4、TG5、TG6、TG7 禾口 / 或 FXIII 有影口向。在优选实施方案中，本发明的候选药物和/或治疗药物调节TG-催化的反应，从而调节IGF与IGF受体家族成员，优选为IGF-I与IGFlR的交联。这可能是通过调节TG-IGF相互作用或者调节TG-IGFlR相互作用的方式。因此，本发明合适的治疗药物、候选药物和/或调节物可以是多肽、蛋白，包括抗体、核酸、蛋白复合物或其它有机分子，优选具有理想的生物活性和半衰期的有机小分子。为了本发明的目的，“分离的(isolated)”是指将物质从它的自然状态或以其它方式受到人工操作而分离出。分离的物质可大体上或基本上从它的自然状态下通常伴随着的成分中游离出，或可被人工操作以使在人工状态下，与其自然状态下通常伴随着的成分在一起。分离的物质可以是天然的、化学合成的或重组的形式。“蛋白”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是本领域所熟知的天然或非天然氨基酸、 D-或L-氨基酸或化学衍生的氨基酸。“多肽”是具有五十个(50)或以上氨基酸的蛋白。“肽”是具有不到50个(50)氨基酸的蛋白。本发明涉及应用和延伸到蛋白变体(variant)，在其范围内包括自然发生的变体， 如等位基因变体、同源物和同系物以及例如人工产生的突变。同源物包括任何哺乳动物蛋白的同源物，所述蛋白包括人类和其它灵长类动物，实验哺乳动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠，具有商业价值的哺乳动物，如马、牛、骆驼、猪和羊以及宠物哺乳动物如狗和猫中的同源物。在本发明的背景下，“基本上由…组成(consisting essentially of) ”或“基本上由…组成(consist essentially of) ”是指多肽和/或肽，除了在肽的N-和/或C-末端的多肽和/或肽序列以外，具有一个、两个或不超过三个氨基酸残基。该额外的氨基酸残基可能出现在多肽和/或肽的一端或两端，但不仅限于此。蛋白和多肽可能是以天然的、化学合成的或重组的合成形式应用，并可能以本领域已知的任何方法制备，包括但不限于，化学合成、DNA重组技术和蛋白裂解产生的肽片段。可由本领域技术人员采用标准方法方便地制备重组蛋白或肽，例如描述于 Sambrook等人，分子克隆实验室手册(冷泉港出版社，1989) (M0LE⑶LAR CLONING. A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press，1989)，通过参考并入于此，特别是在 16 和 17节中；分子生物学新技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，Ausubel 等人编，(John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999)，通过参考并入于此，特别是在10和16节中；以及蛋白质科学新技术(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)，Coligan 等人编，(John Wiley & Sons, Inc. 1995-1999)，通过引用的方式并入于此，特别是在1、5和6节中。在涉及肽的实施方案中，所述肽可为通过化学合成，包括固相和液相合成而制备的肽的形式。这种方法是本领域众所周知的，虽然参考了合成的疫苗(SYNTHETIC VACCINES)Nicholson编(Blackwell Scientific Publications)第9章以及蛋白质科学新技术(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE), Coligan 等人编(John Wiley & Sons， Inc. NY USA 1995-2001)第15章中提供的化学合成技术的实例。在这方面，还参考了国际公开WO 99/02550和国际公开WO 97/45444。本发明还涉及本文中所述的分离的蛋白和/或分离的蛋白复合物的片段的应用。“片段(fragment)”是蛋白的一个段、域、部分或蛋白的区，或编码它们的核酸，其构成小于100%的全长或整个蛋白。片段优选包括不到整个蛋白的99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或甚至少到 10%、5% 或
3 % ο在特定的实施方案中，片段是“生物活性片段”。“生物活性片段”是指蛋白的一个段、部分或片段，或编码它们的核酸，其具有整个或全长蛋白的至少约0.1%，优选至少约 10 %，更优选至少约25 %，甚至更优选至少50 %的分子活性，更优选至少70 %、80 %或90 % 的整个或全长蛋白的生物活性。在优选实施方案中，生物活性片段保留全长蛋白的生物的、 结构的和/或物理的活性。在其它优选实施方案中，生物活性片段对应于TG的显示酶交联蛋白能力的一部分，特别是使用IGF和/或IGF家族成员作为底物。在特别优选实施方案中，TG的生物活性片段能够催化蛋白结合态谷氨酰胺的Y-酰胺基团与蛋白结合态赖氨酸的ε -氨基基团之间的酰基转移反应，结果在一种蛋白的谷氨酰胺供体残基和来自生物多胺的受体伯胺或前述的另一种蛋白的赖氨酸残基之间形成ε -(Y-谷氨酰基)赖氨酸异构肽键。在其它特别优选的实施方案中，TG的生物活性片段在存在于一种或多种蛋白中的谷氨酰胺供体残基和生物多胺或赖氨酸受体残基之间形成异构肽键。在一般的实施方案中，本发明涉及作为在TG和本发明的底物蛋白之间相互作用的激活剂的治疗药物和/或调节物。根据这些优选实施方案，设想激活剂可能有助于促进细胞迁移和/或增殖以治疗或促进伤口愈合，治疗溃疡、烧伤等和/或哺乳动物的皮肤再生。在其它的优选实施方案中，本发明的激活剂可能促进从非活性状态的TG形成活性的TG。在某些其它优选实施方案中，激活剂是⑶P-抑制的TG激活剂。根据这些实施方案，激活剂可作为竞争性结合试剂而去掉结合的GDP，所述竞争性结合试剂模拟或极其类似形成TG的结合口袋的氨基酸残基，因而从TG的结合GDP的口袋中去掉抑制性的GDP。设想理想的情况是，通过二磷酸电荷相互作用和疏水性以及鸟嘌呤的范德华力相互作用的结合，使GDP结合于表面的口袋。因此，这样的结合口袋，包括主要为带正电荷的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。TG的结合GDP的口袋的合适非限制性实例包括TG2的氨基酸残基 173-174、476、478-479、482-483 和 583。鉴于上述情况，应理解激活剂可通过竞争性结合反应去掉TG中结合的抑制性 GDP，其具有与形成结合GDP的口袋的氨基酸残基相似的电荷、序列和理化特性，从而竞争性地结合并去掉抑制性的GDP。设想这种激活剂是竞争性结合试剂，其使GDP从结合GDP的口袋中移位。适当地，这种激活剂包括主要是带正电的氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。在其它的优选实施方案中，GDP-抑制的TG的激活剂可结合于结合GDP的口袋中， 或由去掉结合的GDP而诱导的构象改变所显露的裂缝中，以抑制GDP的进一步结合，因而使 TG可能成为永久活性状态。设想这种激活剂可保持GDP从TG中移位，更优选地永久地取代TG中的GDP。在优选实施方案中，这种GDP-抑制的TG的激活剂包括聚阴离子氨基酸序列，更优选成熟VN的聚阴离子结构域。甚至更优选地，VN的聚阴离子结构域聚阴离子结构域是对应于成熟VN的53-64位氨基酸的聚阴离子结构域。下面的氨基酸序列是含有前述VN的聚阴离子结构域的玻连蛋白的片段。所述聚阴离子序列以斜体和下划线(PT =磷酸苏氨酸，sY =硫化酪氨酸)表示，是带非常强的负电荷的序列
QVTRGDVF (pT)MPEDE(SY)(pT)V(sY)DDGEE knnatvh(seq id no :4)虽然不希望受任何特定的理论的约束，设想⑶p-抑制的TG2—方面通过二磷酸电荷的相互作用，另一方面通过疏水/范德华力相互作用保持在它的封闭构象中。在活性TG2 的晶体结构中(例如，描述于Pinkas等人(2007) PLoS Biology 5 ；e327 :2788-2796)存在一个裂缝，在GDP-结合的(无活性的)TG2中无法靠近该裂缝。该裂缝被大量带正电的残基所结合，且它的碱基具有较强的疏水特性，在这样的构象中，基于结合于TG的VN的聚阴离子序列的多肽似乎将阻止酶折叠成其无活性的状态。设想聚阴离子的氨基酸序列分别可以是含IGF的分离的蛋白复合物的组分，或至少为能够结合同源IGF受体和VN或或纤维粘连蛋白(FN) IGF的域，或至少为VN或FN结合整合素的域。在特别优选的实施方案中，聚阴离子的氨基酸序列是含有生长因子的氨基酸序列的合成嵌合蛋白形式的分离的蛋白复合物的组分，或至少为能够结合同源生长因子受体和VN或FN的生长因子的域，或至少为VN或FN结合整合素的域。应理解，在优选实施方案中，聚阴离子的氨基酸序列是成熟VN的聚阴离子结构域。以昆士兰科技大学名义的W0/2004/069871国际公开文本，提供了可用于本发明的合适的分离蛋白复合物和合成嵌合蛋白的非限制性实例，其通过引用的方式并入于此。在其它一般的实施方案中，本发明提供治疗药物和/或调节物，其为TG和本发明的底物蛋白之间的相互作用的抑制剂。本发明的抑制剂特别适用于期望抑制或防止细胞迁移和/或增殖，如癌细胞转移，过度增殖疾病如疤痕、牛皮癣和动脉粥样硬化的治疗方法。在某些优选实施方案中，抑制剂是一种可逆或不可逆地抑制TG催化活性的肽。这种抑制性多肽可通过结合于TG蛋白活性位点中的一种或多种残基来抑制TG。合适的TG的抑制性多肽的非限制性的实例是Pinkas等人(2007) PLoS Biology, 5, e327 :2788-2796中提供的 Ac-P (DON) LPF-NH2 (SEQ ID NO 1)。本发明在其范围内还包括作用于靶标或竞争位于本发明的TG底物上的TG底物供体位点的抑制剂。应理解，这些实施方案涉及竞争底物供体位点，如赖氨酸供体位点的TG 的竞争性抑制剂。在优选实施方案中，这种抑制剂可以是有机小分子。合适的非限制性的 TG抑制剂的实例是R-NH2B式的单官能团的伯胺，其中R是线性烃链。合适的伯胺抑制剂的非限制性实例是单丹磺酰尸胺。本发明涉及的其它抑制剂为TG特异性抑制剂。在优选实施方案中，合适的TG特异性抑制剂包括3-卤代-4，5-二氢异噁唑基团。参考美国申请No. 11/213，173(公开号US 2006/0052308)，其提供了合适的TG特异性抑制剂的非限制性实例，包括3-卤代_4，5_ 二氢异噁唑基团，通过引用的方式并入于此。虽然不希望任何特定理论的约束，通过鸟嘌呤核苷酸的结合可能使TG受到抑制， 特别是可通过结合GDP分子使TG失活，因此是在封闭的结合GDP的构象中。相反，从TG中去掉结合的GDP可使TG具有活性构象。在优选实施方案中，本发明的方法涉及抑制剂，它是抗体或抗体片段，其破坏或抑制TG和IGF或其片段之间的相互作用。在其它的优选实施方案中，本发明的方法涉及抑制剂，它是抗体或抗体片段，其破坏或抑制TG和IGF受体家族成员或其片段之间的相互作用。优选地，IGF受体家族成员选自下组IGF1R、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGF杂合受体。甚至更优选地，IGF受体选自下组IGF1R、胰岛素受体和胰岛素-IGF杂合受体，而更优选地，IGF受体选自 IGFlR和胰岛素-IGF杂合受体。在特别优选的实施方案中，IGF受体是IGF1R。根据某些优选实施方案，其涉及抑制TG和IGF受体家族成员之间的相互作用的抗体抑制剂，所述抗体抑制剂是适用于期望抑制或防止细胞迁移和/或增殖以治疗癌症的方法。这样的治疗药物也适用于治疗自身免疫性疾病，如糖尿病。在优选实施方案中，抗体或抗体片段结合和/或作用于转谷氨酰胺酶。参考Osman 等人 Q002)Eur J Gastroenterol Hepatol. Nov ； 14(11) : 1217-23，提供了适用于本发明和其产物的方法的TG抗体的非限制性的实例。在其它的优选实施方案中，本发明涉及治疗药物，其是抗体或抗体片段，作用于和 /或结合于IGF和/或IGF受体家族成员上的区域。应理解，根据这些实施方案的一些形式，这种抗体或其片段可能导致非交联的TG底物蛋白。本文中互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”，包括整个抗体和任何结合抗原的片段或其单链。术语“抗体”或“免疫球蛋白”，包括任何免疫球蛋白基因复合物的结合抗原的蛋白产物，其包括免疫球蛋白亚型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE及其结合抗原的片段。结合抗原的片段的实例包括但仅限于，Fab、F(ab)2、Fv、scFv等。设想涉及整个蛋白或其生物活性片段的多克隆和单克隆抗体是合适的治疗药物。如上所述，抗体可以是单克隆或多克隆抗体，例如通过免疫合适的产出动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊、鸡或山羊)而获得。然后可根据是否需要多克隆或单克隆抗体，从免疫动物体内分离血清或脾细胞。可采用如描述于免疫学新技术(CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY) (CoIigan 等人编，John Wiley & Sons. 1995-2000)以及 Harlow，E.& Lane，D.抗体实验室手册(冷泉港，冷泉港实验室，1988) (Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour, Cold Spring Harbour Laboratory, 1988))中的标准方法制备单克隆抗体。这种方法通常涉及如前述的从免疫动物体内获得产抗体的细胞，如脾细胞，并将脾细胞与永生的融合伴侣细胞 (immortalized fusion partner cell) g虫合。
还涉及重组抗体。适当的重组抗体的选择可以通过任何方法实现，包括噬菌体展示技术、芯片或核糖体展示技术，如通过举例的方式，讨论于Hoogenboom，2005，Nature Biotechnol. 23 1105 中。还涉及抗体片段，如本领域熟知的i^ab、F(ab) 2、Fv、scFV和Fe。本领域熟知的还有，为了辅助检测抗体-抗原复合物，抗体可与标签(label)包括但不限于，色原体、催化剂、酶、荧光基团、化学发光分子、生物素和/或放射性同位素共轭
纟口口。本领域技术人员应理解，用于人体治疗的抗体必须具备特异性，使这些抗体适用于人类。通常情况下，治疗性抗体被“人源化”，其中抗体或至少其一条链，通常包括基本上源自人类抗体的可变框架区域以及基本上衍生自非人类抗体的互补决定区(如，但不限于，啮齿动物抗体和鲨鱼抗体)。人源化抗体特别有利于医疗应用，因其引发对异物的免疫反应可能性下降。设想本发明包括类抗体拟肽类，其中抗体是小得多的模拟抗体的拟肽类。本发明还包括非交联IGF或IGF受体家族成员形式的抑制剂，其已丧失与其同源结合蛋白交联的能力。在优选实施方案中，本发明的非交联底物蛋白可发生突变，使TG-介导的交联消除。虽然不希望受到任何特定理论的束缚，本文中所述的IGF-I突变体可结合其同源受体(这样与野生型IGF-I竞争)，但不作用于转谷氨酰胺酶，因而不触发细胞内摄 (internalisation)。本文中使用的术语“突变体(mutant) ”，“突变(mutation) ”和“突变的(mutated) ” 一般包括保守或不保守的氨基酸替换、缺失和/或插入，其被引入到分离的蛋白或其片段中。本领域熟知的，某些氨基酸可能会变化成具有大致相似特性的其它氨基酸而不改变蛋白的活性或蛋白的结构(保守替换)。—般来说，有可能使蛋白的结构和功能发生最大变化的非保守替换是(a)亲水性的残基(如丝氨酸或苏氨酸)替换成或被替换成疏水性残基(如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸)；(b)半胱氨酸或脯氨酸替换成或被替换成任何其它残基；(C)具有带正电侧链的残基(如精氨酸、组氨酸或赖氨酸)替换成或被替换成带负电的残基(如谷氨酸或天冬氨酸)；或(d)具有庞大的疏水性或芳香侧链的残基(如缬氨酸、异亮氨酸、 苯丙氨酸或色氨酸)替换成或被替换成较小侧链(如丙氨酸、丝氨酸)或无侧链(如甘氨酸)。关于突变和/或蛋白变异，这些可以通过诱变蛋白或通过诱变编码核酸，如随机突变，寡核苷酸介导的(或定点)突变，PCR突变和盒式诱变。核酸诱变方法的实例由分子生物学新技术(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), Ausubel 等人，见上，第 9 章中提供，通过引用的方式并入于此。易于获得商业试剂盒，如Mratagene公司的快速变化定;点突变i式齐Ll盒(Quick-Change site-directed mutagenesis kit)。本领域技术人员应理解，定点突变最好是在有助于生物活性的氨基酸残基的知识是可获得的情况下进行。在许多情况下，该信息不可获知，或例如只能由分子近似模型推断。在特别优选实施方案中，非交联的IGF是包括与野生型IGF氨基酸序列相关的赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基发生替换的分离的突变IGF。在优选实施方案中，分离的突变IGF包括与野生型IGF氨基酸序列相关的赖氨酸残基突变和/或与野生型IGF氨基酸序列相关的谷氨酰胺残基突变。根据这些实施方案中，分离的突变IGF，且优选是分离的突变IGF-I是适用于期望抑制或防止细胞迁移和/或增殖的治疗方法的抑制剂。在特别优选实施方案中，分离的突变IGF包括与野生型IGF氨基酸序列相关的赖氨酸残基替换和/或与野生型IGF氨基酸序列相关的谷氨酰胺残基替换。应理解在某些优选实施方案中，分离的突变IGF或分离的IGF受体家族成员可包括一个或多个突变，优选是一个或多个赖氨酸残基的替换和/或一个或多个谷氨酰胺残基的替换。也即本发明涉及分离的IGF突变以及分离的IGF受体家族成员，其中一个或多个赖氨酸残基发生突变，或一个或多个谷氨酰胺残基发生突变，或其中赖氨酸和谷氨酸残基的组合发生突变。鉴于上述情况，应理解前述的替换是保守的替换，其中保持了被替换的残基所带电荷以保留住某些特性，如静电拓扑结构。举例来说，在赖氨酸残基的情况下，适当的氨基酸替换将是另一个带正电荷的氨基酸，如精氨酸。甚至更优选地，替换赖氨酸残基的残基选自下组丙氨酸残基、精氨酸残基和组氨酸残基。甚至更优选地，赖氨酸残基被精氨酸残基替换。在涉及谷氨酰胺残基替换的实施方案中，替换谷氨酰胺残基的残基选自下组丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和天冬氨酸。在涉及分离的IGF-I突变的某些实施方案中，分离的突变包括一个或多个选自下组的残基的突变赖氨酸27、赖氨酸65、赖氨酸68、谷氨酰胺15和谷氨酰胺40。在涉及分离的IGF-I突变的优选实施方案中，赖氨酸残基选自下组赖氨酸27、赖氨酸65和赖氨酸68。更优选地，赖氨酸残基是赖氨酸68。在其它涉及分离的IGF-I突变的优选实施方案中，谷氨酰胺残基选自下组谷氨酰胺15和谷氨酰胺40。优选地，谷氨酰胺残基是谷氨酰胺40。在涉及分离的IGF-I突变的某些优选实施方案中，一个或多个替换选自下组·谷氨酰胺15替换成天冬酰胺，·谷氨酰胺40替换成天冬酰胺，·谷氨酰胺15替换成天冬酰胺和谷氨酰胺40替换成天冬酰胺(双突变)，·赖氨酸27替换成精氨酸，·赖氨酸65替换成精氨酸，·赖氨酸68替换成精氨酸，·赖氨酸27替换成精氨酸和赖氨酸65替换成精氨酸，·赖氨酸27替换成精氨酸和赖氨酸68替换成精氨酸，·赖氨酸65替换成精氨酸和赖氨酸68替换成精氨酸，以及 赖氨酸27替换成精氨酸，赖氨酸65替换成精氨酸和赖氨酸68替换成精氨酸(三重突变)。根据其它优选实施方案，本发明的抑制剂包括IGF受体家族成员的非交联形式。 IGF受体家族成员的非交联形式有特定用途的，虽然不限于治疗细胞增殖疾病，如癌症。在特别优选实施方案中，分离的突变IGF受体家族成员包括与野生型IGF受体家族成员的氨基酸序列相关的赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基的突变。优选突变是替换。在涉及IGF-IR的实施方案中，分离的突变包括一个或多个选自下组残基的突变 与野生型IGF-IR序列相关的赖氨酸159、赖氨酸191、赖氨酸498、赖氨酸530和赖氨酸600、 谷氨酰胺14、谷氨酰胺15、谷氨酰胺399、谷氨酰胺400、谷氨酰胺观7、谷氨酰胺318、谷氨酰胺321、谷氨酰胺396、谷氨酰胺511、谷氨酰胺596、谷氨酰胺619和谷氨酰胺623。本发明还包括分离的核酸和含有编码本文中所述分离的肽、分离的蛋白和/或分离的蛋白复合物的所述分离的核酸的基因构建体(construct)。本发明还涉及抑制剂，其为分离的核酸。分离核酸可能是编码调节物的表达构建体，所述调节物是蛋白，或分离的核酸本身可具有调节物的活性，如但不限于，RNAi分子或核酶。本文中使用的术语“核酸”是指单链或双链mRNA、RNA、cRNA和DNA，所述DNA包括 cDNA和基因组DNA。核酸可以是天然的或重组的，并可包括一个或多个人工核苷酸，如通常不存在于自然界的核苷酸。RNA包括未处理的单链和双链RNA、mRNA、siRNA、miRNA、RNAi和 tRNA。核酸还包括修饰的嘌呤(例如，肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修饰的嘧啶(硫代尿苷和甲基胞嘧啶)。本文中使用的术语“分离的核酸”是指对核酸进行体外操作，形成通常不会在自然界中发现的形式。分离的核酸包括天然的和重组的(非天然的)核酸。例如，核酸可分离自人类。可互换使用的术语“mRNA”、“RNA”和“转录物”是指可转录的核酸转录的拷贝。用于本发明治疗方法的分离的核酸的一个特殊实例是抑制性的RNA构建体，如但不限于，抑制性的双链或其它包括以下更详细描述的内部碱基对的RNA。其它适用于治疗的抑制性RNA构建体包括具有自身切割功能的RNA分子，如核酶和RNA适体(aptamer)。在特定实施方案中，抑制性RNA构建体包括下调TG蛋白表达的siRNA或shRNA构建体。还应理解本发明提供编码抑制性的RNA构建体的DNA构建体。鉴于上述情况应理解，基于RNA的方法可用于抑制TG和IGF和/或IGF受体家族成员之间相互作用。RNA干扰，特别是(但不限于)siRNA和shRNA，提供了有吸引力的方法，即通过序列特异性的同源mRNA切割来沉默潜在的治疗靶基因。Takeshita和 Ochiya(Cancer Sci, 2006,97 :689-696)提供大量的RNA干扰对癌症治疗潜力的实例，通过引用的方式并入于此。本文中使用的术语“基因”用来描述基因组内的不连续的核酸座位、单元或区域， 可包括一个或多个内含子、外显子、剪接位点、开放阅读框以及5'和/或3'非编码调控序列如启动子和/或多聚腺苷酸序列。因此，本领域技术人员会很容易理解，本发明涉及包括一个或多个能够指导RNA 分子合成的核苷酸序列的基因构建体，所述核苷酸序列选自下述(i)可转录为RNA分子的核苷酸序列，所述RNA分子包括基本上与由目标核苷酸序列编码的RNA序列同源的RNA序列；(ii) (i)的核苷酸序列的反向互补序列；(iii)⑴和( )的核苷酸序列的组合，(iv) (i)、(ii)或(iii)的核苷酸序列的多个拷贝，任选被间隔序列分开；(v) (i)和(ii)的核苷酸序列的组合，其中(ii)的核苷酸序列表示⑴的核苷酸序列的反向重复，被间隔序列分开；(vi) (ν)中所述的组合，其中间隔序列包括可以从所述组合中切掉的内含子序列。如果核苷酸序列包括被非内含子间隔序列隔开的反向重复序列，转录后，通过反向重复序列的相互结合，非内含子的间隔序列的存在有利于形成茎环结构。非内含子的间隔序列的存在使得所形成的转录的RNA序列(本文中也称“转录物”)基本上保持为一条状态，即以本文中所指的“发夹”形式。另外，如果核苷酸序列包括反向重复的核苷酸序列，其中间隔序列包括内含子序列，转录后，内含子序列两侧中的一侧的内含子/外显子剪接序列(splice junction sequence)的存在有利于去除否则将会形成的环结构。所得转录物包括双链RNA (dsRNA)分子，任选在一端或两端具有悬突的3'序列。这种dsRNA转录物在本文中是指“完美的发夹(perfect hairpin)”。该RNA分子可包括含有在双链DNA序列区出现“凸起”的单链DNA的单个发夹或多个发夹。根据应用，所述RNA分子可作用于单个靶标或多个靶标。在进一步的一般方面，本发明涉及设计、改造、筛选或以其它方式制备调节TG和本发明的底物蛋白之间相互作用的治疗药物的方法。特定的实施方案涉及鉴定、筛选、设计、改造或以其它方式制备可能是“模拟的 (mimetic)”治疗药物。本文中使用的术语“模拟的”是指被设计为类似蛋白或多肽的特定功能域或结构域的分子，并包括在其范围内的本领域熟知的术语“激动剂(agonist) ”、“类似物”和“拮抗剂”。因此，在某些优选实施方案中，治疗药物是抑制剂。在其它的优选实施方案中，治疗药物是激活剂(activator)。在一个实施方案中，制备模拟TG和本发明的底物蛋白之间相互作用的激动剂。这种分子可作为细胞迁移和/或增殖，如伤口愈合、皮肤再生等中所需的刺激剂 (stimulator)。在另一个实施方案中，制备防止或抑制TG和本发明的底物蛋白之间相互作用的拮抗剂。这种分子可作为细胞迁移和/或细胞增殖的抑制剂，从而形成有用的抗肿瘤药物， 并用于治疗如动脉粥样硬化，皮肤疾病如牛皮癣和由异常细胞增殖导致的增生性疤痕。在某些实施方案中，可能需要设计模拟物(mimetic)如去除基于结合于TG的结合 GDP的口袋中的GDP的结构和分子相互作用的GDP的药物。根据这些实施方案，模拟物可能主要是天然带正电且疏水的。在其它优选实施方案中，通过防止进一步结合移位的GDP，模拟物被设计成使TG 保持永久活性，可基于对应于成熟VN的53-64氨基酸的聚阴离子结构域构建这种模拟物。或者，可基于不可逆地结合于TG活性位点残基上的肽构建模拟物。合适的抑制肽的模型可以是上文所述的Ac-P (DON) LPF-NH2。本领域技术人员会知道，本发明的治疗药物可采用本领域已知的任意数量的方法来确定。一般来说，本发明的治疗药物可通过筛选分子库，如合成的化学库，包括组合库， 如采用 Nestler & Liu, 1998, Comb. Chem. High Throughput Screen 1· 113 及 Kirkpatrick 等人，1999，Comb. Chem. High Throughput Screen 2 211 中描述的方法而确定。还涉及自然发生的分子库，可采用Kolb，1998，ftOg. Drug. Res. 51 185.中描述的方法进行筛选。设计治疗药物的更合理的方法可采用本领域熟知的X射线晶体学、核磁共振光谱、计算机辅助的结构数据库筛选、计算机辅助建模或更传统的检测分子结合相互作用的生物物理技术。 结构生物信息学发现药物的方法综述在Fauman等人，2003，Meth. Biochem. Anal. 44 :477 中提供。计算机辅助结构数据库检索和生物信息学方法正逐渐被用于确定和/或改造本发明的治疗药物，特别是激动剂和/或拮抗剂分子。数据库检索方法的实例，可见美国专利 No. 5，752，019和国际公开WO 97/41526 (针对鉴定EPO模拟物)和美国专利No. 7，158，891 和5，680，331，其涉及更通用的计算方法，用于蛋白建模和蛋白活性的结构模拟。一般来说，其它适用的方法，包括任何的多种确定分子间的相互作用的生物物理技术。适用于潜在应用的技术，如竞争性放射配体结合实验、电生理学、分析超速离心法、微量量热法、表面等离子体共振和基于光学生物传感器的方法，由蛋白质科学新技术 (CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)Coligan 等人编，(John Wiley & Sons, 1997) 第20章中提供，通过引用的方式并入于此。本领域技术人员应理解，调节剂，特别是治疗药物，可以是结合配体的形式，因此， 可通过相互作用检测，如但不限于，酵母双杂交的方法等。双杂交筛选方法在蛋白质科学新技术(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)Coligan 等人编，(John Wiley & Sons， 1997)第20章中提供，通过引用的方式并入于此。药物组合物本发明涉及对TG-相关病症、疾病和/或症状，更优选细胞迁移和/或增殖相关病症、疾病和/或症状治疗特别有效或适用的药物组合物。本发明的药物组合可包括采用前述任一方法确定的治疗药物。另外，本发明的药物组合可包括选自下组的药物⑴分离的TG，或其片段；(ii)分离的TG底物，或其片段；(iii)分离的IGF氨基酸序列，或结合于胞外基质或与胞外基质蛋白发生相互作用的连有分离的多肽的类似物，或其片段；(iv)TG和IGF之间相互作用的调节物。在优选实施方案中，本发明的药物组合物进一步包括IGF。优选地，分离的TG底物选自谷氨酰胺供体底物和赖氨酸供体底物。合适的谷氨酰胺供体底物的非限制性实例是NQEQVSPL(SEQ ID NO :10)和EAQQIV(SEQ ID N0:11)。此外， 合适的赖氨酸供体底物是FKGG (SEQ ID NO 12)，尽管不限于此。进一步设想，在这些实施方案中，其包括含有分离的TG底物和IGF的药物组合物， 所述IGF可与互补的转谷氨酰胺酶底物连接和/或IGF可连接到第二个“游离的”转谷氨酰胺酶底物。在这些涉及到IGF连接于第二个游离的TG底物的实施方案中，优选通过柔性连接序列(linker sequence)，例如但不限于(Gly4kr)n，可将所述游离的TG底物整合至IGF 的N-末端且不与其它蛋白相互作用。国际公开NO.W004/069871提供了合适的连接序列的一般实例，通过引用的方式并入于此。虽然不希望任何特定理论的约束，设想N-末端底物序列通过正常的、局部的转谷氨酰胺酶活性结合于一个或多个ECM蛋白上，从而形成相对固定的ECM上的连接。然后IGF可能结合IGF-IR并通过其自然发生的TG位点连接，在 IGF-IR和ECM之间形成非细胞内摄(non-internalisable)的复合物。在一般涉及包括连接于IGF的分离的互补TG底物的实施方案中，优选互补TG底物是谷氨酰胺供体底物，例如但不限于，NQEQVSPL(SEQ ID NO 10)。设想谷氨酰胺供体底物可结合于IGF中自然发生的TG底物中，阻止其反应性(但不是IGF和其同源受体如IGFlR 之间的非共价相互作用)。虽然不希望任何特定理论的约束，结果得到具有结合IGFlR能力的IGF类似物，但不经历进一步的TG介导的步骤。根据这些实施方案应理解，连接于IGF 的分离的互补TG底物可作为抑制剂。优选地，IGF和互补TG底物之间的连接通过TG活性的形式发生。
在本发明药物组合物的某些实施方案中，优选包括对应于含IGF的复合物的治疗药物，其不能被内摄至胞内。在优选实施方案中，这种非内摄的含IGF的复合物或治疗药物可包括连同分离的多肽或其片段的IGF，其结合于胞外基质或与胞外基质蛋白发生相互作用。合适的分离多肽的非限制性的实例是分离的包括源自FN结合胶原蛋白的序列的多肽。虽然不受到特定理论的约束，根据这些实施方案设想，永久性地连接IGF-I至所述分离的多肽，可将整合素-TG2-IGF1R复合物结合至连接IGF-I的位点，并连接该复合物至胞外胶原蛋白基质，从而抑制所述复合物的内摄。在替代的优选实施方案中，非内摄的IGF可采用IGF的形式，其可通过N-末端连接到足够小以使其离开血液而滞留在组织中的颗粒上， 但颗粒过大而不能被内摄至细胞中(0. 5-10微米左右)。根据这些实施方案，IGF将结合至合成的颗粒上，其过大而无法被内摄。设想可采用His-标签(tag)通过金属亲和性连接 IGF,或采用N-末端半胱氨酸进行天然的化学连接。适当地，药物组合物进一步包括药用载体、稀释剂或赋形剂。“药用载体、稀释剂或赋形剂”是指可安全地用于全身给药的固体或液体填料、稀释剂或装入胶囊的物质。根据特定的给药途径，可使用本领域熟知的各种载体。这些载体选自下组糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石粉、硫酸钙、植物油、合成油脂、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、等渗盐水和盐类如无机酸类，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐，有机酸如醋酸、丙酸酯和丙二酸和无热原的水。描述药用载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考是雷明顿药物科学(Remington’ s Pharmaceutical Sciences) (Mack Publishing Co. NJ. USA，1991)，通过引用的方式并入于此。任何安全的给药途径可用于给病人提供本发明的组合物。例如，可采用口服、直肠、静脉、舌下、颊、静脉、内关节、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、侧脑室内、经皮等给药。肌内和皮下注射是适当的，例如，用于免疫治疗组合物、蛋白疫苗和核酸疫苗的给药。 在基因治疗的情况下，考虑使用电穿孔或脂质体转染到组织，药物可与DNA —起转染到细胞中。剂型包括片剂、分散剂、悬浮液、注射剂、溶液、糖浆、含片、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型也可包括注射或植入专门为此目的设计的控释装置或以这种方式发挥作用的其它修饰的植入体形式。治疗药物的控释可能会受到包被的治疗药物的影响，例如， 疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚羟基脂肪酸和某些纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素。此外，控释可受到使用其它聚合物基质、脂质体和/或微球的影响。本发明适用于口服或肠外给药的组合物可以是分散的单位，如各自包含预先确定一种或多种本发明的治疗药物量的胶囊、袋或片剂，作为粉末或颗粒、或作为溶液或悬浮于水溶液中、非水液体、水包油型乳液或油包水型乳液。这些组合物可采用任何药学的方法进行准备，但所有方法包括将上述一种或多种药物与构成一种或多种必须成分的载体结合的步骤。一般情况下，所述组合物是采用均一地和密切地将本发明的药物与液体载体或极细的固体载体或两者混合，然后，根据需要，将产品制成想要的形状。以上组合物可以与制剂剂量相容的方式给药，且给药量是药用有效的，在本发明的背景下，对病人的给药剂量在适当的时间内应足以对病人产生有利的响应。给药量可取决于待治疗个体包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素将取决于医生的判断。治疗方法本发明提供治疗TG-相关病症、疾病和/或症状的方法，其是根据前述任一方法， 对转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状施用治疗有效的治疗药物；和/或施用本文中所述的药物组合物。优选地，TG-相关病症、疾病和/或症状是本发明的细胞迁移和/或增殖相关病症、 疾病和/或症状。在优选实施方案中，细胞迁移和/或增殖相关病症、疾病和/或症状选自下组伤口愈合、牛皮癣、动脉粥样硬化、癌症、抗化疗的肿瘤、烧伤、溃疡和增生性疤痕。在其它优选实施方案中，转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状是自身免疫性疾病。更优选地，自身免疫性疾病是糖尿病，甚至更优选地，I型糖尿病。还应理解，治疗方法和药物组合可用于预防或治疗哺乳动物，包括人类和非人类的哺乳动物，如牲畜(如马、牛和羊)、宠物(如狗和猫)、实验动物(如小鼠、大鼠和豚鼠) 和表演动物(如赛马、赛狗和骆驼)，以及用于异种器官移植的细胞、器官和组织来源的动物，尽管不限于此。本发明还涉及美容治疗方法，其中施用本发明的治疗药物和/或药物组合物，以改善或提升皮肤的品质或皮肤的外观。这种治疗可包括预防或治疗皮肤疾病，如由皮肤细胞异常增殖导致的牛皮癣和增生性疤痕。另外，治疗方法涉及，通过阻断肿瘤细胞迁移到第二位点从而防止或抑制肿瘤转移。此外，还涉及通过阻断细胞增殖而治疗癌症的方法。还涉及调节在治疗IGF-介导的或相关的抗化疗的肿瘤中TG和IGF之间相互作用的方法。还涉及调节在治疗IGF-IR-介导的或相关的抗化疗的肿瘤中TG和IGF-1R之间相互作用的方法。应知道，促进本文中所述的细胞迁移和/或增殖的方法还可能涉及到体外或胞外细胞培养技术，以及治疗动物的预防性的和/或治疗性的方法。因此，本发明易于理解和产生实际效果，提供以下非限制性的实施例。
实施例实施例1IGF-I含有用于通过转谷氨酰胺酶交联的位点在人类中，转谷氨酰胺酶(TGs)是九个密切相关的酶的家族，其中只有五个酶已被详细地研究。这些迄今为止研究过的酶具有非常相似底物的偏好，同源性研究表明其余四个酶也不例外。确切地说，TGs的主要不同在于它们的时空表达及它们的激活机制。TGs最常见的作用是催化选定的谷氨酰胺和赖氨酸残基之间异构肽键的形成，并伴随着氨(ammonium)的释放。然而，还发现TCs催化谷氨酰胺残基水解脱氨基，以及最近发现通过水解为谷氨酸和赖氨酸残基使交联反应部分逆转。
TG2或组织TG，是因子XIII之后最具代表性的TGs。它在体内无处不在，并发现大量存在于细胞质内、胞外基质(ECM)中和细胞表面。正常情况下，胞外TG2是无活性的，但组织损伤后立即被激活。在本实验中，将IGF-I与用谷氨酰胺O -或赖氨酸(K)供体TG底物肽功能化的 FXIII和PEG孵育。用作用于IGF-I的单克隆抗体(图la)进行的蛋白质印迹清楚地表明， Ih后，IGF-I被定量整合至Q-供体，而不是K-供体PEG中，表明IGF-I含有TG K-供体位
点ο在溶液中，IGF-I的C-末端的“D域”可能是非常柔性的，具有以下氨基酸序列-61caplkpaksa70-oh(seq id no :i3)。本发明的发明人认为，这个D域代表TGs在κ68处发挥作用的迄今未知的位点，导致IGF-I共价整合至ECM和/或血液凝块中。为了证实这一发现，我们使用TG2而不是FXIII进行重复实验，并用已知的TG2 Gln-供体底物胰高血糖素(&1)作为探针(图4)。出乎我们的意料，该反应(7道)产生了范围很广的分子量，表明高度有序的IGF-I-&1聚合物的形成。同样地，当IGF-I单独与 TG2 (2道)反应时产生一系列的对应于IGF-I低聚物的条带。这并未见于FXIII(未显示)， 表明IGF-I包含TG2(而不是FXIII)的Gln-供体底物。2道中的大条带> 75kDa，显然是由于IGF-I和TG2本身之间的共价复合物的形成；IGF-I的聚合也是显而易见的。IGF-I与 &ι(7道)的反应也产生了聚合物。与(IGF-I) An1—致的丽条带用箭头表示。根据这些初步的发现，发明人提出了对目前的IGF-I信号转导通路模型的大量改进，归纳于图2中。第1步在稳态条件下，整合素结合于ECM(如纤维粘连蛋白)，TG2无活性，受体游离或结合于固定化的生长因子。第2步玻连蛋白取代纤维粘连蛋白并激活TG2。 第3步TG连接受体至转运中间体(mediator)上。第4步通过脂筏(lipid raft)运输至网格蛋白包被的小凹(clathrin-coated pits)上。第5步在初级内体(endosome)中， 转运中间体的确定决定了目的地和信号转导的本质。相关蛋白的结构研究已知IGF-I结合于由三个IGFlR的N-末端组成的口袋中。Epa和Ward已提出了该复合物的计算机三维模型，以适合所有目前已知的有关这一相互作用1的信息。有趣的是，在该构象中，D域赖氨酸残基是暴露的，并呈现出一定的流动性，使它们非常接近IGFlR N-末端域上的Gln 14和15(图北)。在ExPASy蛋白组学服务器上比较已知的序列(图 3a)表明，这些残基出现在哺乳动物顶分化后的IGFlR中，而且，事实上，随后从鸟类分化出哺乳动物。本发明人认为，进化的新残基表明IGFlR可能通过TG交联至IGF-I上，其在哺乳动物IGF-I信号转导中是重要的一步。结合基质的IGF-I异构体的作用IGF-I基因产生至少三个在残基1-70序列相同的拼接变异(splice variants), 但不同的是，有些组织特异的“Ε域”肽在C末端"。发现于循环中的主要种类是产生于肝脏的IGF-I ；产生于其它组织中的IGF-I异构体往往保留在原组织中6。该保留背后的机制尚不清楚。已发现拼接变异proIGF-IA分泌于人肝癌细胞和B淋巴细胞的体外培养物中，而 proIGF-IC，被称为“力生长因子(mechano growth factor) ”，已发现其在响应拉伸或损坏中由骨骼肌细胞分泌，是强效的肌肉肥大刺激剂34，明显作用于补充到损坏位点处11的卫星细胞。将proIGF-I加工为成熟的IGF-I，被认为是由丝氨酸蛋白酶在R71处形成切割而介导的；突变的研究表明，K68对于这种切割的发生是必须的。本发明人认为，TG-催化的 proIGF-I的交联可保留ECM中的生物活性的E-域肽。TG2在IGF-I介导的IGFlR的内摄和再循环中的作用本发明人认为，由结合基质的IGFlR的刺激，非内摄的IGF-I参与到组织动态平衡中，而TG介导的源自血流的IGF-I的内摄参与到伤口愈合反应的起始和延续，并在恶性肿瘤中观察到非常相似的行为。然而，以这种方式内摄的多数IGFlR可能需要以活性形式再循环至细胞表面。因此，本发明人假设TG-介导的IGF-I和IGFlR之间的交联将需要被反向(be reversed)以产生原始的赖氨酸和谷氨酰胺残基-一个迄今尚未见报道的现象。然而，本发明人认为， TG-形成的异构肽键可在内体中被TG2切割。实施例2序列PEDE(sY) (pT) V(sY) DDGEEKNNATVH(SEQ ID NO 14)，其中 sY 是硫代酪氨酸， PT是磷酸苏氨酸，采用上述图4描述的Autodock Vina,源自VN的聚阴离子序列对接于 (docked)活性TG2的晶体结构(PDB ID 2Q3Z)。结果示于图7，其中所示为肽的最低能量结合模式。这种结合具有计算的能量32kJ/mol至带正电的裂缝中，其在结合GDP的无活性的 TG2中是封闭的。以这种方式结合将防止TG2返回其无活性的状态。实施例3IGFlR 作为 TG2 底物在ImM CaCl2, pH7. 5 的条件下，使 TG2 (0. 70 μ M)与 IGF-I (25 μ g/mL)和 / 或 IGFlR 的重组胞外域(25 μ g/mL ；购自R&D Systems)反应1小时。此时，通过添加SDS-PAGE上样缓冲液停止反应。样品在4% -12%的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，转移到PVDF膜上，并用羊抗人IGF-I—抗(1 5000稀释)和HRP-标记的兔抗羊二抗(1 10，000)检测IGF-I，
并使用化学发光可视化。这一实验的基本原理是专门检测TG2是否使IGF-I交联至IGF1R，因此证明IGFlR 是TG底物。它能够做到这一点，IGF-I和IGFlR 二者都将成为转谷氨酰胺酶的底物。因为 TG2催化基本上与肽骨架一样稳定的异构肽键的形成，在还原SDS-PAGE条件下，形成的复合物不会被分开(而二硫键和非共价相互作用将被打破)。所以，在该检测中，我们使IGF-I和受体的可溶性重组胞外部分与TG2反应，并使用标准的蛋白质印迹方法检测IGF-I结束的位置。“冒烟的枪(smoking gun) ”的反应将用于IGF-I染色，在IGFlR或其一个片段处呈现出相应的分子量。检测中使用的IGFlR在还原SDS-PAGE中分解为四条带35、40、125和160kDa，对应于(按顺序)两个不同的β域、α域和未正确加工的α和β域在形成过程中从未经蛋白水解而彼此分开。所有已知的IGF-I结合位点位于受体的α域，所以这也正是我们希望看到它连接的位置。参考图5，图中出现的泳道(lane)从左至右依次为分子量标志物(marker)单独IGF-I (在约8kDa出现条带)IGF-I+IGF1R，无 TG2 (希望仅看到 IGF-I 条带)
IGF-I+TG2 (产生大量的IGF-I聚合物)IGF1R+TG2，无IGF-I (不期望看到什么)IGF-I+IGF1R+TG2(如果TG2使IGF-I连接到受体上，希望看到条带出现在相应受体的分子量。)单独TG2 (不期望看到什么)单独IGFlR (不期望看到什么)分子量标志物因此，我们在IGF-I+IGF1R+TG2泳道中看到一组在其它泳道中没有出现的条带， 其对应于α域的分子量，未分开的α-β构建体和(暂定)受体二聚体。这是一个阳性实验，TG2识别IGFlR和IGF-I上的位点，并能够使二者结合起来。实施例4定位IGF-I和IGF-II中的TG位点上述数据表明，IGF-I含有赖氨酸供体TG位点，IGF-I在Κ68、Κ27和Κ65中具有 3个赖氨酸残基，其为赖氨酸供体TG位点的潜在候选位点。为了确定每个赖氨酸残基在交联中的作用，将进行以下实验。使重组IGF-I和IGF-II与FXIII或TG2以及合成的、生物素化的谷氨酰胺供体肽， NQEQVSPLK(生物素)-OH(SEQ ID NO 15)反应，类似于Hirbar等人14’15的水凝胶系统中使用的。接着用胰蛋白酶消化反应混合物，如有必要，生物素化的片段可通过抗生蛋白链菌素亲和纯化，并采用基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS的)来确定，如有必要，对N-端测序。此外，为了进一步证实特异的赖氨酸供体TG位点，将产生一系列的IGF-I类似物。 这将涉及到定点突变和IGF-I的3个赖氨酸残基被替换为精氨酸，保守突变将使静电拓扑结构的变化最小化，而使突变的残基对TG无反应。这将涉及到K27R IGF-I、K65R IGF-I 和K68R IGF-I的产生。重组IGF类似物的表达及纯化将采用已经建立和验证的用于生产 cGM-P级IGF-I的方法。使用上述方法，将评估每个带有生物素化的谷氨酰胺-供体肽的 IGF-I类似物作用于rIGF-I的反应性。在类似于内体环境条件下研究TGs的活性为了部分评估，TG2是否通过重复连接和在Ginl4或15释放IGF-I来调节IGFlR 的活化、内吞和循环，将进行下面的实验以确定在类似于内体的环境酸性条件下，TG2-介导的交联。使用FXIII或TG2制备IGF-I-Gln底物结合物。一旦反应结束后，调节等分溶液 PH值范围为5至8。从Gln底物上切割IGF-I，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹和/或反相高效液相色谱(HPLC)进行监测。为了检测水解的Gln底物是否保持了对TCs的反应性，合成的Gln底物类似物将用Glu取代活性的Gin。通过上述标准的蛋白质印迹技术筛选出对IGF-I具有活性的底物。在补充的方法中，用荧光基团和淬灭基团功能化的适于F0rster共振能量转移 (FRET)分析17的TG交联的底物的合成的肽类似物将使用模拟肽(Mimotopes)。使用荧光酶标仪实时监控TCs对底物的切割。pH值在约6和约7. 4之间重复循环，使我们直接验证 TG交联是可逆循环的假设。
检测IGF信号转导中TG位点的作用在作用于野生型IGF-I的竞争性检测中，将在模式细胞培养物中测试具有TG位点处K — R替换的IGF-I的突变的活性。将采用标准方法来分析使用不同浓度的IGF-I和
kIGF-I刺激的培养物相对的增殖和迁移。固定的IGFs和衍生物对细胞培养物影响的探讨在上述实验中观察到IGF-I对FXIII的高反应性有力地表明，结合基质的IGF(s) 不同于可溶形式，起到生物信号转导的作用。因此，当曝露于结合基质的IGFs和它们的衍生物时，将进行初步实验以观察目标细胞类型的行为。目前被Hrrbar等人14’15开发的且使用的TG-交联的水凝胶系统，并由本发明人进一步开发，代表了一个理想的用于测试这种活性的平台，因为它允许细胞方便地和温和地封装在可降解的结构中，其组成完全有实验者限定。IGF-I、16 -11、嵌合的￥116 -1构建体以及，如果可能，ProIGF-I变异将被整合至含有或不含添加的结合整合素的RGD肽的水凝胶中。评估这些蛋白至少对伤口愈合、皮肤成纤维细胞的增殖和迁移的效果。结论IGF信号网络，尽管是首先和研究得最多的生化系统之一，然而有许多方面至今尚未完全理解。特别是，多年来D域已成为文献的焦点，尽管在关系较远的物种之间高度保守，没有确定它在IGF-I信号转导中的明确作用。观察到IGF-I在许多不同的生理(病理)系统中的作用，IGF-I轴也是药物开发的热门靶标。本发明人的观察，IGF-I具有用于整合至ECM的特定位点，开辟了一条新的研究途径，并可能导致在IGF-I如何调节伤口愈合反应的认识上的重大转变。全文的目的是描述本发明优选实施方案而不限于任何一个实施方案或特定功能的集合。因此，本领域技术人员应理解，鉴于本发明，在不脱离本发明的范围内，可对特定的实施方案进行各种修改和改进。本文中涉及的所有的计算机程序、算法、专利和科学文献，参考并入于此。参考文献1. Epa, V. C.和CW. Ward，胰岛素样生长因子I和它的受体的复合物模型针 % IGF-I ^ # if ^ifi ^lJ (Model for the complex between the insulin-like growth factor I and its receptor towards designing antagonists for the IGF-I receptor). Protein Eng. Des. SeL, 2006. 19(8) :377-384.2. Liu, S.，等人，组织转谷氨酰胺酶结合鸟嘌呤核苷的活性的结构基础及其转酰月安 舌t生白勺i周控(Structural basis for the guanine nucleotide-binding activity of tissue transglutaminase and its regulation of transamidation activity). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，2002. 99 (5) :2743-2747.3. Denley，A.，等人，IGF 系统的分子相互作用(Molecular interactions of the IGF system). Cytokine Growth Factor. Rev. ,2005. 16(4-5) :421-439.4. Adams,G. R.，肌肉胰岛素信号转导的精确效果和作用特邀评论自分泌/旁分泌 IGF-I 禾口骨豁肌适应(Exercise Effects on Muscle Insulin Signaling and Action Invited Review :Autocrine/paracrine IGF-I and skeletal muscle adaptation). J Appl Physiol, 2002. 93(3) :1159-1167.
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权利要求
1.一种筛选、设计、改造或以其它方式制备对转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物的方法，所述方法包括确定候选药物是否能够调节下列物质之间相互作用的步骤，(i)TG和 IGF ；禾口 / 或(ii)TG和IGF受体家族的成员。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述IGF选自IGF-I和IGF-II。
3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述IGF是IGF-I。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述IGF受体家族成员选自下组 IGF-1R、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGF杂合受体。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述IGF受体家族成员选自下组 IGF-1R、胰岛素受体和胰岛素-IGF杂合受体。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述IGF受体家族成员选自IGF-IR和胰岛素-IGF杂合受体。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述IGF受体家族成员是IGF-1R。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述TG选自下组FXIII、TG1、TG2、TG3、 TG4、TG5、TG6 禾P TG7。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述TG选自FXIII和TG2。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述TG是TG2。
11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述候选药物是选自下组的调节物 分离的肽、分离的多肽、分离的核酸和有机小分子。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述调节物调节TG的选自酰基-供体底物和酰基-受体底物的底物供体位点。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述底物供体位点包括选自赖氨酸和谷氨酰胺的残基。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述候选药物是选择性调节物。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述调节物选自激活剂和抑制剂。
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激活剂是GDP-抑制的TG的激活剂。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述激活剂选自包括聚阴离子氨基酸序列的分离的肽、分离的多肽和分离的蛋白复合物。
19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述聚阴离子氨基酸序列对应于成熟 VN的53-64氨基酸的VN聚阴离子结构域。
20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述抑制剂选自下组抗体、分离的核酸、非交联的分离的IGF、非交联的IGF受体家族的成员、TG抑制剂、TG底物供体位点的抑制剂和TG底物供体位点的竞争性抑制剂。
21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述非交联的分离的IGF是包括与野生型IGF氨基酸序列相关的一个赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基突变的分离的突变IGF。
22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的突变IGF是分离的IGF-I突变体，所述分离的IGF-I突变体包括与野生型IGF-I的氨基酸序列相关的一个或多个选自下组残基的突变赖氨酸27、赖氨酸65、赖氨酸68、谷氨酰胺15和谷氨酰胺40。
23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述非交联的IGF受体家族的成员是分离的IGF受体家族成员突变体，所述突变体包括与野生型IGF受体家族成员氨基酸序列相关的赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基的突变。
24.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述非交联的IGF受体家族的成员是分离的IGFlR突变体，所述突变体包括赖氨酸残基和/或谷氨酰胺残基突变。
25.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述分离的IGFlR突变体包括一个或多个与野生型IGF-IR序列相关的选自下组残基的突变赖氨酸159、赖氨酸191、赖氨酸 498、赖氨酸530和赖氨酸600、谷氨酰胺14、谷氨酰胺15、谷氨酰胺399、谷氨酰胺400、谷氨酰胺观7、谷氨酰胺318、谷氨酰胺321、谷氨酰胺396、谷氨酰胺511、谷氨酰胺596、谷氨酰胺619和谷氨酰胺623。
26.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述抑制剂是TG特异性抑制剂。
27.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述TG特异性抑制剂包括3-卤代-4， 5-二氢异噁唑基团。
28.根据权利要求1-27任一项所述方法设计、改造、筛选或以其它方式制备的对转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状治疗有效的治疗药物。
29.用于治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的药物组合物，其包括权利要求观所述的治疗药物。
30.用于治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的药物组合物，其包括选自下组的治疗药物(i)分离的转谷氨酰胺酶(TG)，或其片段；( )分离的TG底物，或其片段；(iii)与分离的多肽或其片段一起与胞外基质结合或相互作用的分离的胰岛素样生长因子(IGF)氨基酸序列，或其类似物；及(iv)TG和IGF之间相互作用的调节物；(V)TG和IGF受体家族成员之间相互作用的调节物，以及药用稀释剂、载体或赋形剂。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述分离的TG底物选自酰基供体底物和酰基受体底物。
32.根据权利要求30或31所述的药物组合物，其中所述底物供体位点包括选自赖氨酸和谷氨酰胺的残基。
33.根据权利要求30-32任一项所述的药物组合物，其中所述调节物是分离的蛋白复合物，其包括IGF或至少能够结合同源IGF受体以及玻连蛋白(VN)或纤维粘连蛋白(FN) 的IGF的域，或至少VN或FN的结合整合素的域。
34.根据权利要求30-33任一项所述的药物组合物，其中所述IGF选自IGF-I和 IGF-II。
35.根据权利要求30-34任一项所述的药物组合物，其中所述IGF是IGF-II。
36.根据权利要求30-35任一项所述的药物组合物，其中所述调节物选自激活剂和抑制剂。
37.根据权利要求30-36任一项所述的药物组合物，其中所述激活剂是GDP-抑制的TG 激活剂。
38.根据权利要求30-37任一项所述的药物组合物，其中所述激活剂选自包括聚阴离子氨基酸序列的分离的肽、分离的多肽和分离的蛋白复合物。
39.根据权利要求30-38任一项所述的药物组合物，其中所述聚阴离子氨基酸序列是与成熟VN的53-64氨基酸对应的聚阴离子结构域。
40.治疗动物体内转谷氨酰胺酶相关疾病、病症和/或症状的方法，所述方法包括给所述动物施以任一下列物质的步骤权利要求观所述的治疗药物；权利要求四所述的药物组合物；权利要求30-39任一所述的药物组合物，从而治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和 /或症状。
41.根据权利要求40所述的治疗方法，其中所述转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状选自细胞迁移和/或增殖相关病症、疾病和/或症状以及自身免疫性疾病。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中所述细胞迁移和/或增殖相关病症、疾病和/或症状选自下组伤口愈合、牛皮癣、动脉粥样硬化、癌症、抗化疗的肿瘤、烧伤、溃疡和增生性疤痕。
43.根据权利要求40-42任一项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是糖尿病。
44.根据权利要求40-43任一项所述的方法，其中所述动物是哺乳动物。
45.根据权利要求40-44任一项所述的方法，其中所述哺乳类动物是人类。
46.一种治疗转谷氨酰胺酶相关病症、疾病和/或症状的方法，所述方法包括调节下列物质之间相互作用的步骤(i)TG和 IGF ；和 / 或(ii)TG和IGF受体家族的成员，从而治疗转谷氨酰胺酶相关的病症、疾病和/或症状。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述IGF选自IGF-I和IGF-II。
48.根据权利要求46或47所述的方法，其中所述IGF受体家族的成员选自下组 IGF-1R、胰岛素受体、胰岛素受体相关受体和胰岛素-IGF杂合受体。
49.根据权利要求46-48任一项所述的方法，其中所述IGF受体家族的成员选自下组 IGF-1R、胰岛素受体和胰岛素-IGF杂合受体。
50.根据权利要求46-49任一项所述的方法，其中所述IGF受体是IGF1R。
51.根据权利要求46-50任一项所述的方法，其中所述调节TG和IGF之间相互作用的步骤是通过分离的突变IGF实施的。
52.根据权利要求46-51任一项所述的方法，其中所述调节TG和IGF受体家族的成员之间相互作用的步骤是通过抗体实施的。
53.根据权利要求46-52任一项所述的方法，其中所述抗体针对或作用于IGF1R。
54.根据权利要求46-53任一项所述的方法，其中所述转谷氨酰胺酶相关疾病、病症和 /或症状选自细胞迁移和/或增殖相关病症、疾病和/或症状以及自身免疫性疾病。
55.根据权利要求46-54任一项所述的方法，其中所述细胞迁移和/或增殖相关疾病选自下组伤口愈合、牛皮癣、动脉粥样硬化、癌症、抗化疗的肿瘤、烧伤、溃疡和增生性疤痕。
56.根据权利要求46-55任一项所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是糖尿病。
57.根据权利要求46-56任一项所述的方法，其中所述方法是一种治疗动物的方法。
58.分离的蛋白复合物，其包括(i)TG或其片段以及IGF或其片段；(ii)TG或其片段以及IGF受体家族的成员或其片段。
全文摘要
本发明提供了用于筛选或设计对转谷氨酰胺酶相关疾病、病症和/或症状治疗有效的治疗药物的方法，其包括确定候选药物是否能够调节转谷氨酰胺酶和胰岛素样生长因子和/或IGF受体家族的成员之间的相互作用。本发明还提供药物组合物以及使用所述药物组合物的治疗方法。
文档编号A61P17/02GK102405056SQ201080017430
公开日2012年4月4日 申请日期2010年3月19日 优先权日2009年3月19日
发明者兹·厄普顿, 德里克·范·龙克曾, 杰西·皮特, 特里斯坦·科罗尔, 盖里·基恩·谢特, 西蒙尼·瑞兹 申请人:昆士兰技术大学