血清淀粉样蛋白p衍生物及其制备和用途的制作方法

专利名称：血清淀粉样蛋白p衍生物及其制备和用途的制作方法
血清淀粉样蛋白P衍生物及其制备和用途相关申请的交叉参考本申请要求2009年6月4日提交的美国临时申请系列号61/217，931的权益。上述申请的所有教导内容通过引用方式并入本文。
背景技术：
血清淀粉样肽P(SAP)是五聚环蛋白(pentraxin)蛋白家族的成员。SAP是由肝脏分泌的，在血液中作为稳定的五聚体循环。之前的研究证明SAP在免疫应答的启动和消退期中都具有重要作用。SAP能够结合细菌表面上的糖残基，从而促进它们的调理素作用和被抗原呈递细胞的吞食。SAP还结合免疫应答消退的时候由调亡细胞产生的游离DNA和染色质，从而阻止针对这些抗原的继发性炎性应答。由于SAP的结合所有三种经典Fc γ受体 (Fe y R)[其对于FcyRII (CD32) ^P FcyRIII (CD16)尤其具有亲和性]的能力，由SAP结合的分子从细胞外区域中被除掉。与受体结合之后，SAP和任何附着的复合物一般会被细胞内化和处理。最近有人提出SAP可用作治疗性试剂以治疗多种病症，包括纤维化相关的病症， 超敏反应病症，自身免疫病症，粘膜炎，以及炎性病症，例如由于微生物感染引起的那些。 见，例如美国专利申请系列号11/707，333、12/217，617、12/720，845和12/720,847。用于治疗人类疾病的蛋白质治疗剂已经使卫生保健行业发生了革命。然而，生产具有必要的效力的蛋白质治疗剂和/或以足够数量生产以用作治疗性试剂的蛋白质治疗剂具有很多困难。 修饰了很多潜在的治疗性试剂以增加它们的生物学活性(相对于天然产生的蛋白质)，例如血浆半衰期。通常应用重组表达技术来生产足够数量的多肽。不幸的是，很多重组系统产生与天然产生的形式相比具有不同生物学性质的多肽，这可能会影响治疗性产品的药代动力学、安全性和功效。因此，需要开发适合于人类治疗的SAP多肽及其制备方法。

发明内容
本公开部分地提供了变体血清淀粉样蛋白P(SAP)多肽及其生产方法。本发明包括用于体外和体内添加、删除或修饰糖残基以产生具有需要的糖基化模式的变体SAP多肽的方法和组合物。在一些方面，本公开提供了糖基化的人SAP多肽，其包含N-连接的或0-连接的寡糖链，所述寡糖链具有至少一个分支末端，所述分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。在一些方面，本公开提供了糖基化的人SAP多肽，其包含N-连接的或0-连接的寡糖链，所述寡糖链相对于分离自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2，6_连接的唾液酸部分。在一些方面，本公开提供了制备糖基化的人SAP多肽的方法，包括在细胞中表达 SAP多肽并从该细胞中分离所述SAP多肽。在优选实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在一些方面，细胞是CHO-S细胞。
在一些方面，本公开提供了制备人SAP多肽的方法，包括在CHO细胞中表达人 SAP多肽并从该细胞中分离所述人SAP多肽。在一些方面，本公开提供了制备人SAP多肽的方法，包括提供包含N-连接的或 0-连接的寡糖链的糖基化的人SAP多肽；和酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的或 0-连接的寡糖链以产生修饰的糖基化的SAP多肽。在一些方面，本公开提供了制备人SAP多肽的方法，包括提供人SAP多肽；和酶促地或化学地改变SAP多肽以产生包含N-连接或0-连接的寡糖的糖基化的SAP多肽。在一些方面，本公开提供了通过以下方法制备的人SAP多肽，所述方法包括在 CHO细胞中表达SAP多肽，并从该细胞中分离所述SAP多肽。在一些方面，本公开提供了 CHO细胞，其包含人SAP多肽，所述人SAP多肽具有 N-连接的寡糖链，所述寡糖链的至少一个分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。在一些方面，本公开提供了 CHO细胞，其包含编码人SAP多肽的多核苷酸序列。在一些方面，本公开提供了人SAP多肽，其抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2，小于其1/3，小于其1/4，小于其 1/10，或小于其1/100。在优选实施方式中，本发明的人SAP多肽具有N-连接的寡糖链。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链的至少一个分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链相对于分离自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α2，6_连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链的所有分支都终止于α2，3_连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链实质上不含α 2，6_连接的唾液酸部分。 本发明的糖变体SAP多肽可以包含一个或多个分支，例如，N-连接的寡糖链的特征可以在于具有双触角、三触角、四触角或五触角结构。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链包含 Man [ ( α l，6_)-(Man(a 1,3)]-Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1，N) -Asn 的五糖核心。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链包含具有结构NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一个分支。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链的至少一个分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链的所有分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链的至少一个分支包含一个或多个甘露糖残基。在一些实施方式中，N-连接的寡糖链包含至少一个岩藻糖残基。本发明的任何糖变体SAP多肽可以包含至少一个修饰的糖基残基。修饰的糖基残基可以缀合于选自下列的一个或多个修饰基团水溶性和水不溶性聚合物、治疗部分、诊断剂和生物分子。在一些方面，本发明的SAP多肽可以是重组多肽。本发明的SAP多肽可以包含与 SEQ ID NO :1、2、3 或 4 至少 85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 同一的氨基酸序列。优选地，SAP多肽是人SAP蛋白。本发明的人SAP多肽可以包含与SEQ ID N0:1至少 85%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100% 同一的氨基酸序列。在一些方面，本发明的人SAP多肽是包含SAP结构域和一个或多个异源结构域的融合蛋白。所述异源结构域可以增强下列一项或多项体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成、和/或纯化。在一些方面，本发明的人SAP多肽包含一个或多个修饰的氨基酸残基，例如PEG化的氨基酸，糖基化的(例如0-连接的糖基化)氨基酸，异戊烯化的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，和/或缀合于有机衍生剂的氨基酸。修饰的氨基酸残基可以增强下列一项或多项体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成、和/或纯化。在优选实施方式中，本发明的人SAP多肽相对于分离自人血清的野生型SAP的对应样品具有增加的生物学活性。在一些方面，本发明的SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2，小于其1/3，小于其1/4，小于其1/10，或小于其1/100。在一些方面，制备本发明的任意人SAP多肽的方法包括以下的另外步骤酶促地或化学地改变SAP多肽以向SAP多肽附着N-连接或0-连接的寡糖链，或修饰SAP多肽中已有的N-连接的或0-连接的寡糖链。在一些实施方式中，酶促地或化学地改变SAP多肽包括以选自糖基转移酶、糖苷酶和磷酸酶的一种或多种酶蛋白处理SAP多肽。在一些实施方式中，酶促地或化学地改变SAP多肽的方法在存在一种或多种糖前体的情况下进行。合适的糖前体包括但不限于=UDP-N-乙酰葡萄糖胺，CMP-N-羟乙酰基神经氨酸、UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神经氨酸，UDP-半乳糖和⑶P-岩藻糖。在一些实施方式中，酶促地或化学地改变SAP多肽的方法从N-连接或0-连接的寡糖链除掉一个或多个末端的α 2， 6-连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，酶促地或化学地改变SAP多肽的方法将寡糖链上的一个或多个末端的α 2，6_连接的唾液酸部分替换为一个或多个α2，3_连接的唾液酸部分。在一些方面，本公开还提供了适合用于哺乳动物的本发明的人SAP多肽的药学制备物。本发明的药学制备物包括本文公开的至少一种SAP多肽和药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药学制备物还包含另外的活性试剂。在一些实施方式中，药学制备物配制为缓释制剂。在一些实施方式中，本公开的药学制备物适合于表面地、通过注射、通过静脉内注射、通过吸入、通过持续贮库或通过泵施用至患者。本公开还提供了通过向有此需要的患者施用治疗有效量的一种或多种本发明的 SAP多肽而治疗或预防SAP响应性病症或病况的方法。SAP响应性病症或病况包括但不限于纤维变性或纤维增殖性病症或病况，超敏反应病症或病况，自身免疫病症或病况，炎性疾病或病况，和粘膜炎。本发明的SAP多肽可以表面地、通过注射、通过静脉内注射、通过吸入、通过持续贮库或通过泵或其组合方式施用至患者。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽与一种或多种另外的活性试剂一起施用。


图1 纤维细胞分化测验。使用基于ELISA的测验法来测定单核细胞与SAP多肽一起温育之后MDC的产生。Y轴表明了相对于源自人血清的SAP (hSAP)，分离自CHO-S细胞的重组人SAP(rhSAP)的平均效力(即，7个独立实验的平均值)。hSAP的相对活性设定为 1. 0。图2 变体SAP多肽的聚糖结构分析。使用液体色谱质谱(LCMS)分析法㈧和阴离子交换高效液体色谱(AEX-HPLC)分析法(B)测定分离自CHO-S细胞的糖改组的重组人 SAP上的唾液酸连接情况。使用液体色谱质谱(LCMQ分析法(C)和阴离子交换高效液体色谱(AEX-HPLC)分析法(D)测定糖改组的hSAP(源自人血清的SAP)上的唾液酸连接情况。使用液体色谱质谱(LCMQ分析法(E)和阴离子交换高效液体色谱(AEX-HPLC)分析法(F) 测定以α2，3_唾液酸转移酶处理(以增加SAP聚糖上的末端的2，3_连接的唾液酸的数目)的rhSAP上的唾液酸连接情况。对于LCMS图，X轴代表质量，单位为道尔顿；Y轴代表相对强度。对于HPLC迹线，X轴是时间，单位为分钟；Y轴是吸收单位(mAU)。图3 纤维细胞分化测验。使用基于ELISA的测验法来测定单核细胞与SAP变体多肽一起温育之后MDC的产生。Y轴表明了相对于hSAP参考标准物，每种SAP变体的平均相对活性，hSAP的活性设定为1. 0 (见最左侧的条柱)。图4 纤维细胞分化测验。以hMCSF处理单核细胞，然后定量纤维细胞分化情况。 X轴代表与供体单核细胞一起温育的hMCSF的浓度。Y轴代表第5天时纤维细胞增殖的量 通过纤维细胞计数/5. OxlO4个细胞所测定。图5 纤维细胞分化测验。以hSAP处理单核细胞，然后定量纤维细胞分化情况。X 轴代表与供体单核细胞一起温育的hSAP的浓度。Y轴代表第5天时纤维细胞增殖的量通过纤维细胞计数/5. OxlO4个细胞所测定。
具体实施例方式概述多数天然产生的肽具有通过连接至原始肽链长度上的某些氨基酸的特定键而附着至肽的碳水化合物部分(即聚糖)，从而形成“糖肽”。任何给定肽上的糖基化模式都可能对于该肽的功能具有多种影响。例如，肽上的N-连接的聚糖的结构能够影响肽的多种特性，包括蛋白酶易感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期，和抗原性。这些特性中的一项或多项的改变大大影响肽在其天然环境下的功效。天然产生的糖肽中存在的聚糖结构通常被分成两类N-连接的和0-连接的聚糖。 真核细胞中表达的肽通常在肽初级结构中的包含序列天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸的位点处的天冬酰胺残基上有N-糖基化，其中X可以是除了脯氨酸和天冬氨酸之外的任意氨基酸。此类肽的碳水化合物部分被称作N-连接的聚糖或N-连接的寡糖。N-糖基化的早期事件发生于内质网(ER)并且在哺乳动物、植物、昆虫和其它高等真核细胞中是保守的。首先，在载脂分子上构建包含14个糖残基的寡糖链。随着初生肽被翻译并转运至ER，整个寡糖链通过与膜结合的糖基转移酶催化的反应被转移至天冬酰胺残基的酰胺基团上。N-连接的聚糖进一步在ER和高尔基体中被处理。进一步处理一般会除掉一些糖残基并添加其它的糖残基这是通过特异于除掉的和添加的糖残基的糖基化酶和糖基转移酶催化的反应进行的。通常而言，N-连接的聚糖的最终结构取决于肽所产生自的生物体。例如，在细菌中产生的肽一般是非糖基化的。在昆虫细胞中表达的肽通常含有大量甘露糖或少量甘露糖 N-连接的寡糖链。在哺乳动物细胞培养物中产生的肽通常差别化糖基化，取决于物种和细胞培养条件。即时在相同的物种并在相同的条件下，有时也会发生糖基链中一定量的异质性。一般地，在植物细胞中产生的肽包含的聚糖结构显著不同于在动物细胞中产生的肽。在本领域中已经提出了多种方法来定制肽的糖基化模式，包括在公布的国际申请号W 99/22764、WO 98/58964和WO 99/54342以及美国专利号5，047, 335中描述的那些。 基本上而言，已经克隆并测序了用于在体外糖基化肽所需的很多酶。在一些情况下，已经在体外使用这些酶以向肽上的聚糖添加特定的糖。在其它情况下，已经对细胞进行了遗传工程化以表达酶与所需肽的组合，从而在细胞内实现向表达的肽添加所需的糖部分。在合成碳水化合物时主要使用两类酶糖基转移酶和糖苷酶。糖基转移酶添加或修饰肽上已有的寡糖结构。糖基转移酶对于产生具有良好的立体化学和区域化学控制的特定产物是有效的。已经使用糖基转移酶来制备寡糖和修饰末端的N-和0-连接的碳水化合物结构，尤其是在哺乳动物细胞中产生的肽上的那些。例如，可以使用糖基转移酶使糖肽的末端寡糖完全唾液酸化和/或岩藻糖化，以提供更一致的糖结构，这可以改善糖肽的药代动力学和多种其它生物学性质。糖苷酶进一步分类为外切糖苷酶(例如，例如β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶)， 和内切糖苷酶(例如，Endo-A、Endo-M)。糖苷酶通常催化糖苷键的水解。然而，在合适的条件下，它们可用于形成该键。用于合成碳水化合物的多数糖苷酶是外切糖苷酶糖基转移发生在底物的非还原末端。糖苷酶结合糖基-酶中间体中的糖基供体，其被水截获以产生水解产物，或被受体截获以产生新的糖苷或寡糖。使用外切糖苷酶的示例性途径是所有的 N-连接的糖肽的核心三糖的合成，包括甘露糖苷键，其是通过甘露糖苷酶的作用形成的(Singh等人，Chem. Commun. 993-994(1996))。虽然内切糖苷酶的用途不如外切糖苷酶常见，但是内切糖苷酶也用于制备碳水化合物。内切糖苷酶可用于将整个寡糖链而非单糖转移至多肽上。已经使用内-β -N-乙酰葡萄糖胺、例如endo-F和endo-M将寡糖片段添加到了底物上(Wang 等人，Tetrahedron Lett. 37 :1975-1978 ；和 Haneda 等人，Carbohydr. Res. 292 :61-70(1996)) 0已经成功地使用这些类别的酶中的每一种产生了糖基化的肽。关于一般综述，见 Crout 等人，Curr. Opin. Chem. Biol. 2 :98-111 (1998)。血清淀粉样蛋白P (SAP)是哺乳动物中天然产生的血清蛋白，其由5个相同的亚基或“原体”组成，它们非共价地结合于圆盘样复合物中。SAP属于五聚环蛋白(pentraxin) 蛋白超家族，其特征在于该环式五聚结构。经典的短的五聚环蛋白包括SAP以及C-反应性蛋白(0smand，A. P.，等人，Proc. Nat. Acad. ki.，74 :739_743，1997)。SAP 通常在肝脏中合成，并且具有M小时的生理半衰期。以下公开了人SAP亚基的序列，其对应于Gene bank 登记号NP_001630的氨基酸20-223 (未显示信号序列)。HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRAYSLFSYNTQGRDNELLVYKERVG EYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPVHICVSWESSSGIAEFWINGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQDSYGGKFDR SQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEIRGYVIIKPLVffV(SEQ ID NO :1)。以下公开了原鸡(Gallus gallus) SAP亚基的序列QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRPHSLFSYATKAQDNEILLFKPKPG EYRFYVGGKYVTFRVPENRGEWEHVCASWESGSGIAEFWLNGRPffPRKGLQKGYEVGNEAVVMLGQEQDAYGGGFDV YNSFTGEMADVHLWDAGLSPDKMRSAYLALRLPPAPLAW GRLRYEAKGDVVVKPRLREALGA(SEQ ID NO :2)。以下公开了牛(Bos taurus)SAP亚基的序列QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRGYSLFSYNIHSKDNELLVFKNGIG EYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVHICTSWESSTGIAEFWINGKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQEQDSYGGGFDK NQSFMGEIGDLYMWDSVLSPEEILLVYQGSSSISPTILDffQALKYEIKGYVIVKPMVffG(SEQ ID NO :3)。以下公开了灰仓鼠(Cricetulus migratorius) SAP亚基的序列QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSYNTKNKDNELLIYKERMGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWVNGIPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQEQDNYGGGFDK SQSFVGEMGDLNMWDSVLTPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPRVffH(SEQ ID NO :4)。本发明的一个方面涉及以下令人惊奇的发现修饰人SAP多肽上的聚糖结构能够相对于分离自人血清的野生型SAP的对应样品而言增加SAP多肽的生物学活性。如本公开的实施例所证实，分离自人血清的SAP仅含有α 2，6-连接的唾液酸残基。与此相反，在 CHO细胞中产生的重组人SAP仅包含α 2，3-连接的唾液酸残基。使用体外的基于细胞的生物测验法证明α 2，3-连接的唾液酸SAP多肽比野生型SAP (即含有α 2，6_连接的唾液酸部分的SAP)具有一贯地较高的活性。本发明的变体SAP多肽作为治疗试剂将更加有效，因为它们具有增加的生物学效力。例如，效力更强的SAP变体相对于分离自人血清的野生型 SAP可能需要更低的配量和/或频率更低的配量。本公开提供了变体人SAP多肽及其制备方法。特别地，本公开包括用于体外和体内添加、删除或修饰糖残基以产生具有需要的糖基化模式的人SAP多肽的方法和组合物。定义除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语一般具有如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。一般地，本文使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学与杂交中使用的实验程序是本领域熟知并通常使用的。使用标准技术用于核酸和肽的合成。一般根据本领域的常规方法和多项一般性的参考文献进行技术和程序操作(例如 Sambrook 等人，1989, Molecular Cloning :ALaboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.),在该文献中通篇有提供。冠词"a"和"an"在本文中用于指一个或多个该冠词的语法客体(即至少一个)。举例而言，“an element"意指一个元件或多个元件。如本文使用的术语“处理”是指获得需要的药理学和/或生理学效应。该效应可以是预防性的完全或部分预防其病症或症状；和/或，可以是治疗性的部分或完全治愈病症和/或归因于病症的不利影响。如本文使用的“治疗”涵盖了哺乳动物、尤其是人类的疾病的任何治疗，包括(a)延长生存时间；(b)降低由于疾病造成的死亡风险；(c)抑制疾病，即，阻抑其发展或降低疾病进展速率；和(d)减轻疾病，即，引起疾病消退。如本文使用的“抑制”或“预防”病症或病况的治疗剂是这样的化合物在统计样本中，使经处理的样品中的病症或病况的发生相对于未经处理对照样品降低；或使疾病或病况的一种或多种症状的发生延缓或使其严重性相对于未经处理的对照样品降低。如本文使用的术语“受试者”和“患者”是指动物，包括哺乳动物，例如人。术语 “哺乳动物”包括灵长类，驯养的动物，包括狗、猫、绵羊、牛、马、山羊、猪、小鼠、大鼠、兔子、 豚鼠，俘获的动物，例如动物园的动物，和野生动物。如本文使用的术语“组织”是指器官或特化细胞的集合，例如皮肤组织、肺组织、肾组织和其它类型的细胞。术语“治疗效应”是本领域认识到的，是指动物、尤其是哺乳动物、更特别是人类中的由药理学活性物质引起的局部或全身效应。词语“治疗有效量”是指在适用于任何治疗的合理的利弊比率下，产生一些期望的局部或全身效应的此类物质的量。此类物质的治疗有效量将根据所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、给药方式而变化，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。例如，本文描述的一些组合物可以按照在适用于此类治疗的合理的利弊比率下，足以产生期望效应的量来施用。如本文使用的术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)，以及，在适当情况下，是指核糖核酸(RNA)。该术语应该被理解为包括从核苷酸类似物制备的RNA或 DNA的等同物、类似物，以及，在适用于所描述的实施方式的情况下，包括单链(例如正义或反义)和双链多核苷酸。术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中相互替换地使用。术语“纯化的蛋白，，是指蛋白制备物，其优选分离自在细胞或细胞裂解物中通常与该蛋白结合的其它蛋白，或实质上不含在细胞或细胞裂解物中通常与该蛋白结合的其它蛋白。术语“实质上不含其它细胞性蛋白”或“实质上不含其它污染性蛋白”定义为包括每种蛋白的各制备物，其中包含20% 以下(干重)的污染性蛋白，优选包含5%以下的污染性蛋白。可以使用本领域熟知的克隆的基因以纯化的制备物的形式制备每种蛋白的功能形式。“纯化的”意指所述分子在实质上不存在其它生物大分子、例如其它蛋白(特别是可能实质上掩盖、减少、混淆或改变成分蛋白的特性的其它蛋白它们作为纯化的制备物，或在对象重构混合物中发挥作用)的情况下存在。如本文使用的术语“纯化的”优选意指存在至少80%干重、更优选85%干重、更优选95% -99%干重，最优选至少99. 8%干重的相同类型的生物大分子(但是可以存在水、 缓冲液和其它小分子，尤其是具有小于5000分子量的分子)。如如本文使用的术语“纯的” 优选具有与上述“纯化的”相同的数值限制。“N-连接的”寡糖是通过天冬酰胺连接至肽骨架的寡糖通过天冬酰胺-N-乙酰葡萄糖胺键连接。N-连接的寡糖也被称作“N-聚糖”。天然产生的N-连接的寡糖具有下列的共同的五糖核心:Man [(α 1,6-)- (Man (α 1,3)] -Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc ( β 1， N)。它们的区别在于是否存在外周糖例如N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸的分支(也称作触角)，以及分支的数目。任选地，该结构还可以包含核心岩藻糖分子和/或木糖分子。术语“唾液酸”是指九碳羧化糖家族的任意成员。最常见的唾液酸家族成员是 N-乙酰-神经氨酸(通常简写为Neu5AC、NeuAC或NANA)。该家族的第二个成员是N-羟乙酰基-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟化。唾液酸家族的第三个成员是 2-酮-3-脱氧-nonulosonic acid (KDN) (Nadano 等人(1986) J. Biol. Chem. 261 11550-11557 ；Kanamori 等人，J. Biol. Chem. 265 :21811-21819 (1990))。还包括 9-取代的唾液酸，例如9-0-C1C6-酰基-Neu5Ac，例如9-0-乳酰基-Neu5Ac或9-0-乙酰基_Neu5Ac， 9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮-9-脱氧-Neu5Ac。关于唾液酸家族的综述，见，例如，Varki, Glycobiology 2 :25-40(1992) ；Sialic Acids Chemistry, Metabolismand Function, R.Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992))。“遗传工程化的”或“重组的”细胞是具有对于细胞的遗传物质的一个或多个修饰的细胞。此类修饰包括但不限于插入遗传物质、删除遗传物质和插入染色体外的遗传物质，无论此类物质是否是稳定维持的。如本文使用的术语“修饰的糖”是指在本发明的方法中酶促地添加至肽的氨基酸或糖基残基上的天然或非天然产生的碳水化合物。修饰的糖选自多种酶底物，包括但不限于糖核苷酸(单、双和三磷酸酯)，激活的糖(例如，糖基卤化物、糖基甲磺酸酯)，以及既非激活也非核苷酸的糖。“修饰的糖”可以被“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包括但不限于水溶性和水不溶性的聚合物，治疗部分，诊断部分，生物分子。将被修饰基团官能化的位置选择为其不阻止“修饰的糖”被酶促地添加至肽或肽的糖基残基。变体SAP多肽本公开部分地提供了变体血清淀粉样蛋白P(SAP)多肽。特别地，本发明的SAP变体包括糖基化的人SAP多肽，其包含一个或多个N-连接的或0-连接的寡糖链，每个寡糖链独立地具有1、2、3、4、5或更多个分支，所述分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，N-连接的或0-连接的寡糖链的所有分支都终止于α2，3_连接的部分。本发明的其它SAP变体包括糖基化的人SAP多肽，其含有N-连接的或0-连接的寡糖链，相对于源自人血清的野生型SAP多肽，所述寡糖链具有低至少20 %，25 %，30 %，35 % 40 %， 45%, 50%, 55%,60%,65% 75%，80%，85%或甚至低至少95%的α 2，6_连接的唾液酸部分。在一些实施方式中，N-连接的或0-连接的寡糖链实质上不含α2，6_连接的唾液酸部分，例如相对于源自人血清的野生型的SAP多肽，具有低80 %，85 %，90 %，95 %，97 %，98 % 或甚至低99%的α 2，6_连接的唾液酸部分。本发明的糖变体SAP多肽可以包含具有一个或多个分支的N-连接的寡糖或0-连接的链(例如，具有双触角、三触角、四触角、五触角等结构)。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽包含N-连接的或0-连接的寡糖链，其中寡糖链的1、2、3、4、或5个分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺(例如，相对于源自人血清的野生型SAP多肽，具有低80 %，85 %，90 %，95 %，97 %，98 %或甚至低99 %的N-乙酰葡萄糖胺)。本发明的某些SAP多肽具有N-连接的或0-连接的寡糖链，所述寡糖链实质上不含半乳糖和和N-乙酰葡萄糖胺(例如，相对于源自人血清的野生型SAP多肽，具有低80 %， 85%,90%,95%,97%,98%或甚至低99%的半乳糖和/或N-乙酰葡萄糖胺)。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽包含N-连接的或0-连接的寡糖链，其中寡糖链的1、2、3、4或5 个分支包含一个或多个甘露糖残基。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽包含N-连接的寡糖，所述寡糖具有以下五糖核心:Man[(a l,6)-(Man(a 1,3)]-Man(^ l,4)-GlcNAc(^ 1, 4)-GlcNAc(i3 1，N)-Asn。该五糖核心也可以包含一个或多个岩藻糖或木糖残基。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽包含N-连接的寡糖链，其中寡糖链的1、2、3、4或5个分支具有结构NeuNAc2 a 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6。本发明的SAP多肽还可以包含N-连接的寡糖链，其中所有分支具有结构NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6。本发明的变体SAP多肽可以包含一个或多个“修饰的”糖残基。修饰的糖在允许附着修饰部分或基团的任意位置被取代。在优选方面，修饰的糖在仍然允许糖作为那些用于将修饰的糖偶联至SAP肽的酶之底物的位置被取代。修饰基团可以通过酶促方式、化学方式及其组合方式附着至糖部分，从而产生修饰的糖，例如修饰的半乳糖、岩藻糖或唾液酸。 适合用于本发明的修饰基团以及用于将这些修饰基团缀合至糖残基的方法如下文所描述。在优选方面，本发明的变体SAP多肽在体外抑制单核细胞分化为纤维细胞的IC5tl 小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。在一些实施方式中，本发明的变体SAP 多肽在体外抑制单核细胞分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的 1/3、1/4、1/10 或 1/100。本发明的变体SAP多肽可以与SEQ ID NO 1的氨基酸序列至少60%、至少70%、 至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少 100% 同一，如使用基于 Brutlag 等人的算法(Comp. App. Biosci.，6 :237-245(1990))的FASTDB计算机程序所测定。在优选实施方式中，用于计算氨基酸比对的同一性和相似性的百分率的参数包括Matrix = PAM 150，k_元组=2，错配罚分=1，连接罚分=20，随机组长度=0，截止分数=1，空隙罚分=5，空隙大小罚分=0. 05。术语“SAP多肽”包括功能片段和包含上述任意项的融合蛋白。一般地，SAP多肽将被设计为在含水溶液中在生物相关的温度、PH水平和渗透性时是可溶的。非共价地结合在一起以形成五聚体SAP复合物的SAP原体可以具有相同的氨基酸序列和/或翻译后修饰，或，备选地，单一复合物内的各个SAP原体可以具有不同的序列和/或修饰。术语SAP 多肽包括任何天然产生的SAP多肽及其任何变体(包括突变体、片段和融合物)。本发明的 SAP多肽可以是重组多肽。在优选实施方式中，本发明的SAP多肽是人SAP多肽。在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含本发明的变体SAP多肽，或其功能片段。在一些方面，SAP变体的氨基酸序列可以是这样的相对于SEQ ID NO :1具有一个或多个保守性或非保守性置换。如本文使用的“保守性置换”是物理上或功能上类似于对应的参考残基的残基，即，保守性置换与其参考残基具有相似的大小、形状、电荷和/或化学性质(例如，形成共价键或氢键的能力)。优选的保守性置换是满足在Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure5 :345-352(1978 & Supp.)中就接受的点突变定义的标准的那些置换。保守性置换的实例为下列组内的置换(a)缬氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f) 丝氨酸、苏氨酸；(g)赖氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。关于哪些氨基酸变化可能是表型上沉默的另外的指导可以见Bowie等人，Science247 :1306-1310(1990)。变体SAP多肽及其保留生物学功能的片段用于本文描述的药物组合物和方法中。 在一些实施方式中，变体SAP多肽或其片段结合Fc γ RI、Fc γ RIIA和/或Fc γ RIIIB0在一些实施方式中，变体SAP多肽或其片段抑制纤维细胞、纤维细胞前体、肌成纤维细胞前体和/或造血单核细胞前体中的一项或多项的分化。SAP变体可以通过修饰SAP多肽的结构来产生，以实现例如增强治疗功效或稳定性的目的(例如，离体保质期和在体内的针对蛋白水解降解的抗性)。在一些方面，本公开的变体SAP多肽除了天然存在于SAP多肽中的任何修饰之外还可以包含翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化(例如0-连接的寡糖、N-连接的寡糖等)、磷酸化和脂化。结果是，修饰的SAP多肽可以包含非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂、多糖或单糖和磷酸酯。在一些方面，本文描述的SAP多肽的一种或多种修饰可以增强SAP多肽的稳定性。 例如，此类修饰可以增强SAP多肽的体内半衰期或减少SAP多肽的蛋白水解降解。在一些方面，本发明的变体SAP多肽包括融合蛋白，其具有人SAP多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域或异源部分。此类融合结构域的熟知的实例包括但不限于聚组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G和免疫球蛋白重链恒定区(Fe)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以将融合结构域选择为用于赋予所需的性质。例如，一些融合结构域对于通过亲和层析分离融合蛋白是特别有用的。为了亲和纯化的目的，使用亲和层析的相关基质，例如谷胱甘肽_、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。作为另一个实例，可以将融合结构域选择为用于促进SAP多肽的检测。此类检测结构域的实例包括多种荧光蛋白(例如GFP)以及“表位标签)，它们通常是短的肽序列，针对它们的特异性抗体是可获得的。熟知的表位标签(针对它们的特异性单克隆抗体可容易地获得)包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有这样的蛋白酶切割位点其允许相关的蛋白酶部分地消化融合蛋白，从而从其中释放重组蛋白。然后可以通过随后的色谱分离从融合结构域分离释放的蛋白。在一些情况下，SAP 多肽可以与异源结构域融合，所述异源结构域在体内使SAP多肽稳定化。“稳定化”意思是增加血清半衰期的任意事项，而不论其是通过减少破坏、减少肾对其的清除，还是其它药代动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分和血清白蛋白形成的融合物会赋予增强的稳定性。理解到融合蛋白的不同元件可以按照与所需的功能一致的任何方式排列。例如， SAP多肽可以置于异源结构域的C-末端，或，备选地，异源结构域可以置于SAP多肽的C-末端。SAP多肽和异源结构域无需在融合蛋白中彼此邻近，可以在任一结构域的C-或N-末端或结构域之间包括另外的结构域或氨基酸序列(例如接头序列)。产生改变的N-糖基化分子的方法本文描述了产生变体人SAP多肽的方法。该方法一般包括下列步骤将SAP多肽与一种或多种化学或酶学试剂接触以产生或修饰SAP多肽上的糖基化结构。该方法可以是基于细胞的或非基于细胞的。用于产生或修饰聚糖结构的酶是本领域熟知的。用于本公开的方法中的多数酶/ 蛋白可以归类为下列两个功能类别之一糖基转移酶和糖苷酶。如本文使用的糖基转移酶 (例如N-乙酰葡萄糖胺转移酶、半乳糖基转移酶、岩藻糖基转移酶、唾液酸转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶等)是指具有将供体糖转移至受体部分的任何酶/蛋白。如本文使用的糖苷酶(例如葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、N-乙酰氨基葡糖苷酶、唾液酸酶、岩藻糖苷酶等)是指具有催化糖部分之间的糖苷键水解的能力的任何酶/蛋白。用于产生改变的糖形式的SAP多肽的基于细胞的方法使用野生型(例如CHO细胞)或相对于人类细胞具有至少一种修饰的糖基化活性的经遗传工程化的细胞。适合于本公开的方法的细胞包括例如真菌细胞、原核细胞(即，细菌、古生菌)、植物细胞或动物细胞(例如，线虫、昆虫、植物、鸟、爬行动物或哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔子、仓鼠、 沙鼠、狗、猫、山羊、猪、牛、马、鲸、猴子或人)。细胞可以是原代细胞、永生化细胞或转化的细胞。此类细胞可以获自多种商业来源和研究来源机构，例如，美国典型培养物保藏中心 (Rockville, Md.)。在一些方面，用于产生变体SAP多肽的细胞是CHO细胞。术语“糖基化活性”是指下列任何活性⑴能够向靶分子添加N-连接的或0-连接的聚糖(即寡糖基转移酶活性)；(ii)从靶分子除掉N-连接的或0-连接的聚糖；(iii) 修饰靶分子上的一个或多个N-连接的或0-连接的聚糖；(iv)修饰多萜醇连接的寡糖；(ν) 能够辅助一种或多种i-iv的活性的活性。相应地，糖基化活性包括例如，糖苷酶活性，糖基转移酶活性，糖核苷酸合成，修饰或转移活性。靶分子上的一个或多个N-连接或0-连接的聚糖的修饰包括甘露糖基磷酰基转移酶活性，激酶活性，或磷酸酶活性，例如改变靶分子上的聚糖的磷酸化状态的甘露糖基磷酰基转移酶活性，激酶活性，或磷酸酶活性。本公开的方法中有用的工程化细胞可以具有一种或多种遗传修饰，包括但不限于(i)删除编码具有糖基化活性的蛋白的内源基因；(ii)导入编码具有糖基化活性的蛋白(例如内源或外源蛋白)的突变形式的重组核酸；(iii)导入或表达干扰具有糖基化活性的蛋白的功能性表达的RNA分子；(iv)导入编码具有糖基化活性的野生型蛋白(例如内源性或外源性)的重组核酸；或(ν)改变编码具有糖基化活性的蛋白的一个或多个内源基因的启动子或增强子元件，从而改变所编码的蛋白的表达。以上描述的RNA分子包括，例如，小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、反义RNA或微RNA(miRNA)。要理解，项目(ii) 包括例如，将内源基因替换为(例如通过同源重组)编码相对于所替换的内源基因具有更高的糖基化活性的蛋白的基因。本文描述的遗传工程化的细胞具有一种或多种改变的糖基化活性，例如(i)遗传修饰的细胞中的一种或多种糖基化活性的增加；(ii)遗传修饰的细胞中的一种或多种糖基化活性的降低；(iii)遗传修饰的细胞中的一种或多种糖基化活性的定位或细胞内分布的改变；或(iv)遗传修饰的细胞中的一种或多种糖基化活性相对于相同来源的未经修饰的细胞的比例的变化。要理解糖基化活性的量的增加可以是由于具有糖基化活性的一种或多种蛋白的过表达，内源基因的拷贝数的增加(例如基因复制)，或内源基因的启动子、 增强子或阻抑子的改变，其刺激该基因编码的蛋白的表达的增强。一种或多种糖基化活性的降低可以是由于具有糖基化改变活性的一种或多种蛋白的突变体形式(例如显性阴性形式)的过表达，降低具有糖基化活性的一种或多种蛋白的表达的一种或多种干扰RNA分子的导入或表达，或，编码具有糖基化活性的蛋白的一种或多种内源基因的删除。本公开的方法使用的遗传工程化的细胞能够表达(例如过表达)编码具有糖基化活性的蛋白的野生型或突变基因。此类基因包括但不限于ALG7、ALG13、ALG14、ALG1、ALG2、 ALGl 1、RFT1、ALG3、ALG9、ALGl2、ALG6、ALG8、ANLl、ALGlO、ALG5、0ST3、0ST4、0ST6、STT3、 OST1、0ST5、WBP1、SffPU 0ST2、DPMI、SEC59、0CH1、MNN9、VAN1、MNN8、MNNlO、MNNl 1、HOCl、 MNN2、MNN5、MNN6、KTRl、YURI、MNN4、KRE2、KTR2、KTR3、MNNl、MNSl、MNN4、PNOl、MNN9,葡萄糖苷酶I，葡萄糖苷酶II，或内甘露糖苷酶。编码具有糖基化活性的蛋白的基因可以来自任何物种(例如，低等真核生物(例如真菌(包括酵母)或锥虫)，原核生物(即细菌或古生菌)，植物，或动物(例如昆虫、鸟、爬行动物或哺乳动物，例如小鼠或大鼠、狗、猫、马、山羊、 牛、猪、非人灵长类或人)。要理解用于本公开的方法中的遗传工程化的细胞可以表达任意数目的基因(例如编码具有糖基化活性的蛋白的基因)和/或一种或多种(例如2、3、4、 5、6、7、8、9 10、11、12、15或20或更多种)本文提及的任何基因的任何组合。此外，本公开的方法中使用的任何遗传工程化的细胞可以包含改变或消除一种或多种糖基化活性的任何数目的突变。在一些实施方式中，术语“基因表达”或“表达”是指这样的细胞过程生物学活性多肽从DNA序列中产生出来并在细胞中显示出生物学活性。因此，基因表达包括转录和翻译过程，但也包括能够影响基因或基因产物的生物学活性的转录后和翻译后过程。这些过程包括但不限于RNA合成、加工和转运，以及多肽合成、转运和多肽的翻译后修饰。例如，本公开提供了通过在细胞中表达SAP基因而制备本发明的SAP多肽的方法。 在一些实施方式中，细胞可以包含内源SAP基因或其片段。在其它实施方式中，可以向细胞中导入(例如转化或转染)编码外源SAP多肽或其片段的多核苷酸。可以导入细胞中的合适的SAP多核苷酸包括核酸片段以及核酸构建体或表达载体。在优选实施方式中，内源或外源基因编码人SAP多肽。在一些实施方式中，用于转化宿主细胞的核酸片段、例如编码人SAP多肽的核酸片段可以包括Siine-Dalgarno位点(例如核糖体结合位点)和起始位点(例如，密码子 ATG)以起始转录的信息的翻译以产生酶。其还可以包括终止序列以使翻译停止。终止序列通常是这样的密码子没有对应于它的氨基乙酰基-tRNA，从而多肽合成终止。在一些实施方式中，编码SAP多肽的核酸构建体可以递送例如表达质粒，当该表达质粒在细胞中被转录时，会产生SAP多肽。在一些实施方式中，合适的表达载体包含编码可操作地连接于至少一个调节序列的编码本发明的SAP多肽的核苷酸序列。调节序列是本领域所知的，并且被选择为指导本公开的任意多肽的表达。相应地，术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件。示例性的调节序列描述于 Goeddel ;Gene Expression Technology =Methodsin Enzymology, Academic Press, San Diego，CA(1990)。例如，这些载体中可以使用这样的任意表达控制序列以表达本公开的任何多肽当可操作地连接于DNA序列时，其调节DNA序列的表达。此类有用的表达控制序列包括，例如，SV40早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、Iac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T7启动子(其表达由 T7 RNA聚合酶指导)、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，fd被膜蛋白的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶例如Wio5的启动子，酵母α交配因子的启动子，杆状病毒系统的多角体启动子，和已知的控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其它序列，以及上述项的各种组合。应该理解表达载体的设计可以取决于下列因素， 例如所选的待转化的宿主细胞，和/或希望表达的蛋白的类型。此外，还应该考虑，载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，以及载体编码的任何其它蛋白例如抗生素标志物的表达。在一些实施方式中，用于转化宿主细胞的核酸片段或表达系统可选地可以包括一个或多个标志物序列。一般而言，合适的标志物序列通常编码基因产物，通常是使生长培养基中的化合物灭活或检测该化合物或被该化合物检测的酶。例如，加入标志物序列可以赋予经转化的细胞对于抗生素的抗性，或者其可以赋予经转化的细胞化合物特异性代谢。赋予抗性的合适的标志物序列的实例包括卡那霉素、氨比西林、氯霉素和四环素。备选地，除了选择压力之外，可以使用允许检测含有基因例如半乳糖苷酶的特定集落的标志物基因，其中使用提供有色产物的底物。有多种方法适合于以核酸片段或表达载体转化本发明的细胞。常见的转化方法包括电穿孔、脂质体介导的转化、钙介导的转化和病毒介导的转化。在一些方面，当以本发明的核酸片段或表达系统转化宿主细胞时，所述系统中的基因(例如人SAP)可以通过所谓的同源重组整合进入宿主细胞的染色体DNA，宿主将稳定携带该表达系统。为了使载体中的表达系统整合进入宿主细胞的染色体DNA，可以使用合适的选择标志物基因，其中所述标志物基因具有同源于特定宿主细胞的染色体DNA上的基因的序列。本领域技术人员可以容易地选择用于此目的的选择标志物。举例而言，优选的标志物是存在于染色体上并且与宿主细胞的代谢相关的基因。即，优选使用这样的宿主其经过了修饰，从而使得染色体上的上述基因将被适当的方式例如突变灭活。然后，宿主可以经历与含有相应的完整基因的表达载体的同源重组，只有含有正常代谢基因的转化子能够生长以被选择。因此，如果此类标志物基因已经被导入至表达载体中，在所述表达载体中的标志物基因与染色体DNA的对应部分之间将发生同源重组，其中异源基因的表达盒将同时被整合进入染色体DNA。在一些实施方式中，术语在细胞中“表达”蛋白还包括将蛋白本身导入细胞的方法。因此，在一些方面，本公开提供了通过将SAP多肽导入细胞而制备本发明的SAP多肽的方法。将多肽直接导入细胞的技术是本领域已知的，一般包括细胞膜通透化过程。此类技术包括但不限于微注射SAP多肽；将SAP多肽包裹在膜囊泡内(例如，脂质体、荚膜体、红细胞影、原生质体等)并将其与细胞膜接触，从而通过融合实现SAP多肽的细胞内导入；使用物理学方法(例如机械的、化学的、电学的等)，其依赖于大分子经由细胞质膜上短暂导入的孔通过扩散进入细胞(例如刮擦-载入、珠子-载入等)；通过自然胞吞(由于细胞吞噬作用)而摄取。细胞内导入方法可以利用受体介导的途径，其中细胞表面上表达的多个受体之一作为靶标，SAP多肽附着至(共价或非共价地)作为载体部分的同源配体。已经描述了使用静电吸附将蛋白导入活细胞的方法，其中首先将蛋白阳离子化，然后与细胞的带负电的表面接触(见日本专利公开号2004/049214)。在一些方面，本公开提供了表达SAP多肽的CHO细胞。在一些实施方式中，CHO细胞表达外源SAP多肽。在优选实施方式中，CHO细胞表达人SAP多肽。在一些实施方式中， 本公开提供了包含编码SAP多肽的多核苷酸序列的CHO细胞。在优选实施方式中，多核苷酸序列编码人SAP多肽。前述任意技术都可用于在CHO细胞或本文公开的任何其它合适的细胞中“表达”本发明的SAP多肽。当野生型或遗传工程化的细胞的任意糖基化活性在存在诱导刺激(例如化学或物理刺激)时可诱导或条件化时，任选可以在导入编码SAP多肽的核酸之前、之时或之后、 在存在诱导剂的情况下培养野生型或遗传工程化的细胞。例如，将SAP多肽导入细胞之后， 可以暴露于能够促进具有野生型或改变的N-糖基化活性的一种或多种蛋白表达的化学诱导剂。当多个诱导刺激诱导具有野生型和/或改变的N-糖基化活性的一种或多种蛋白之条件化表达时，可以将细胞与多个诱导剂接触。在一些实施方式中，可以修改培养基以产生 SAP多肽上的需要的聚糖结构。例如，可以修改培养基的血清、葡萄糖和/或脂质(例如多萜醇)浓度以最佳地产生所需的SAP糖变体。在一些实施方式中，可以改变培养基的温度、 PH和/或渗透压以最佳地产生所需的SAP糖变体。 在从细胞或细胞培养基中分离之前或之后，可以在体内或在体外进一步处理本发明的变体SAP多肽。进一步处理可以包括修饰SAP多肽的一个或多个聚糖残基，或除了聚糖结构之外对SAP多肽的修饰。在一些实施方式中，SAP多肽的另外的处理可以包括添加 (共价或非共价连接)一个或多个异源部分。在一些实施方式中，进一步处理包括酶促或化学处理SAP多肽。酶促处理可以包括将SAP多肽与一种或多种糖苷酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、糖基转移酶或蛋白酶接触足以诱导SAP多肽上的聚糖残基(例如半乳糖、甘露糖、岩藻糖、唾液酸、木糖、N-乙酰葡萄糖胺等)的修饰、添加或删除的时间段。可以通过使用本领域熟知的技术依次修饰、添加或删除所需的糖部分以完成N-连接的寡糖链的定制。可以通过使用多种内切和外切糖苷酶实现肽变体上的碳水化合物部分的酶促切割，如Thotakura 等人，1987，Meth. Enzymol. 138 :350所描述。添加糖部分的示例性方法公开于美国专利号 5，876，980,6, 030，815,5, 728，554 和 5，922，577。 在一些实施方式中，SAP聚糖结构的修饰需要一种或多种糖核苷酸的存在。用于本发明中的示例性的糖核苷酸包括核苷酸单、二或三磷酸酯或其类似物。在优选实施方式中，修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更优选地，糖核苷酸选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸或CMP-NeuAc。在一些实施方式中，修饰的糖核苷酸用于将修饰的糖残基添加至SAP多肽。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也用于本发明的方法。化学添加或除掉糖基部分可以通过任意合适的方法进行。例如，化学去糖基化可以包括将SAP多肽暴露于三氟甲磺酸或其它强酸。该处理导致多数或全部糖的切割，除了连接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)；同时保留肽的完整性。化学去糖基化的方法描述于 Haldmuddin 等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 :52 和 Edge 等人，1981， Anal. Biochem. 118 :131。化学处理可以包括，例如将改变的SAP多肽与酸例如氢氟酸接触足以诱导SAP多肽被修饰的时间段。在一定的条件下，氢氟酸处理特异性地除掉通过磷酸二酯连接至聚糖的甘露糖残基，同时保留聚糖上的磷酸酯。可以通过从一个或多个N-聚糖添加或除掉磷酸酯基团而进一步处理改变的SAP多肽。例如，可以将改变的SAP多肽与甘露糖基激酶或甘露糖基磷酸酶接触。在一些方面，理想的是，仅修饰SAP多肽聚糖结构(N-连接的或0-连接的寡糖)上的末端的糖部分。在一些实施方式中，通过添加、删除、置换或修饰至少一个末端的唾液酸残基来修饰SAP聚糖结构的一个或多个分支。修饰如本文描述的聚糖的合适的方法可用于仅改变SAP聚糖结构上的末端的糖部分。在一些实施方式中，具有α2，6-键、α2，8-键或 α 2，9-键的末端的唾液酸残基被替换为一个或多个末端的α 2，3-连接的唾液酸残基。在具体的方面，根据本公开的方法之一修饰包含末端的α 2，6-连接的唾液酸残基的人SAP， 以便将一个或多个末端的α 2，6_连接的唾液酸残基替换为一个或多个α 2，3_连接的唾液酸残基。在一些实施方式中，修饰末端的α 2，3_连接的唾液酸残基以添加一个或多个α 2， 6-连接的、α 2，8-连接的和/或α 2，9-连接的唾液酸残基。在一些方面，制备本发明的SAP多肽的方法包括使SAP多肽去糖基化的第一步骤。 SAP多肽可以被部分或完全去糖基化。在一些实施方式中，去糖基化的第一步骤包括从SAP 多肽上的聚糖结构的至少一个分支仅除掉末端的糖部分。在一些实施方式中，去糖基化的第一步骤除掉至少一个α 2，6-连接的唾液酸残基。在一些实施方式中，去糖基化的第一步骤除掉至少一个0-连接的聚糖。在一些实施方式中，去糖基化的第一步骤除掉至少一个 N-连接的聚糖。在一些实施方式中，去糖基化的第一步骤除掉所有的0-连接的和N-连接的聚糖。在一些实施方式中，根据本公开的方法进一步处理去糖基化的SAP多肽(部分或完全)，其包括但不限于酶促或化学地修饰经部分或全部去糖基化的SAP多肽，将经部分或全部去糖基化的SAP多肽导入细胞，或其组合，其中所述方法产生本发明的变体SAP多肽。在一些实施方式中，在将经部分或全部去糖基化的SAP多肽导入细胞之后，可以根据本公开的方法在体外或在体内进一步修饰它，以产生本发明的变体SAP多肽。类似地，可以将使用本文描述的酶促或化学方法在体外修饰的经部分或完全去糖基化的SAP多肽导入细胞中，以产生本发明的变体SAP多肽。要理解，本发明的SAP多肽可以在细胞内加工，但无需一定这样。例如，本公开还提供了无细胞的生产本发明的变体SAP多肽的方法。在一些方面，所述无细胞的方法包括下列步骤在糖基化条件下，将SAP多肽与从野生型细胞(例如真菌细胞、植物细胞或动物细胞)或经遗传工程化的具有至少一种修饰的糖基化活性的细胞制备的细胞裂解物接触，其中SAP多肽与该细胞裂解物的接触使得N-连接或0-连接的寡糖附着至SAP多肽，或修饰SAP多肽上已有的N-连接或0-连接的寡糖。“N-糖基化条件”意指在允许所需的改变的N-糖基化的条件下温育混合物(例如，SAP多肽与细胞裂解物的混合物)。用于获得在裂解物中保留一种或多种糖基化活性或其完整性的细胞裂解物的合适的方法可以包括使用适当的缓冲液和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂， 它们防止细胞裂解物中N-糖基化活性变化或使该变化最小化。此类抑制剂包括，例如，螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二醇双(P-氨基乙醚)N，N, Ni，Nl-四乙酸(EGTA)；蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)，抑肽酶(aprotinin)，亮抑酶肽(Ieup印tin)，抗蛋白酶(antipain)；和磷酸酶抑制剂，例如磷酸盐，氟化钠和钒酸盐。可以选择那些不干扰感兴趣的N-糖基化活性或对于该活性仅有极小的不利影响的抑制剂。用于获得含有酶活性的裂解物的合适的缓冲液和条件描述于，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47), Johnffiley & Sons, New York(1999) ；Harlow and Lane, Antibodies :ALaboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)； Harlow and Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press(1999) ；Tietz Textbook of Clinical Chemistry,3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W. B. Saunders, Philadelphia, (1999)。视需要，可以进一步处理细胞裂解物以消除干扰性物质的存在或使其最小化。 如果需要，可以通过本领域技术人员熟知的多种方法中的任何方法使细胞裂解物分为级份，包括亚细胞分级和色谱技术，例如离子交换色谱、疏水和反相色谱，尺寸排阻色谱， 亲和色谱和疏水电荷诱导色谱(见，例如Scopes，Protein Purification principles andPractice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993) ；Burtonand Harding, J. Chromatogr. A 814 :71-81 (1998))，或任何其它合适的纯化技术。可以制备这样的细胞裂解物，其中全部细胞器保持完整和/或保持功能性。例如， 裂解物可以包含下列一项或多项完整的糙面内质网，完整的光面内质网，或完整的高尔基体。用于获得包含完整细胞器并测试细胞器功能的方法描述于，例如，Moreau等人(1991) J. Biol. Chem. 266(7) :4329-4333 ;Moreau 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 (7) :4322-4328 ； Rexach 等人(1991) J. Cell Biol. 114(2) :219-2 ；和 Paulik 等人(1999)Arch. Biochem. Biophys. 367(2) :265-273 ；各自通过引用方式全文并入本文。SAP多肽可以仅与一种具有糖基化活性的纯化蛋白接触。在一些实施方式中，SAP 多肽可以与多种具有糖基化活性的纯化蛋白接触。可以使用标准蛋白分离技术纯化一种或多种具有糖基化活性的一种或多种蛋白。SAP多肽可以与合适的缓冲液中的一种或多种蛋白接触足以诱导如上所述的SAP多肽修饰的时间段。SAP多肽可以同时或依次与多种蛋白接触。当SAP多肽依次与多种具有糖基化活性的蛋白接触时，可以在一个或多个步骤之后对SAP多肽进行纯化，但无需一定如此。S卩，SAP多肽可以与蛋白活性“A”接触，然后进行纯化，然后将该分子与蛋白活性“B”接触。修饰肽的此类方法是本领域已知的，例如Lee and Park (2002)30(6) :716-720 and Fujita and Takegawa(2001)Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3) :678_682，其公开内容通过引用方式全文并入本文。在一些方面，本公开的方法包括分离SAP多肽的步骤，例如，从细胞或从细胞裂解物的成分中分离。用于蛋白分离的很多标准技术是本领域已知的。例如，分离多肽的方法包括但不限于尺寸排阻色谱，反相色谱，液体色谱(例如HPLC)，亲和色谱(例如金属螯合或免疫亲和色谱)，离子交换色谱，疏水相互作用色谱，沉淀，差别溶解，免疫沉淀，离心(例如超离心，蔗糖梯度离心等)，或其任何组合。在一些实施方式中，SAP多肽可以缀合于亲和标签以促进多肽的纯化。用于纯化SAP的适当的亲和标签包括但不限于几丁质结合蛋白 (CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、链霉亲和素、生物素和多聚组氨酸。亲和标签可以作为重组蛋白的一部分而产生(即，作为包含异源亲和标签结构域和SAP 多肽结构域的融合蛋白)或在体内或体外附着(共价或非共价)至SAP多肽。在一些实施方式中，可以使用多个纯化步骤分离SAP多肽。例如，可以使用亲和纯化方法从细胞裂解物或多成分混合物中亲和-纯化包含纯化标签的SAP多肽。然后可以通过另外的纯化步骤、 例如尺寸排阻色谱或RP-HPLC进一步纯化该亲和-纯化的SAP多肽以除掉任何微小的不希望的污染物。当本发明的多肽在细胞中产生时，可以从细胞本身分离SAP多肽或从培养细胞的培养基中分离它。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽从细胞中产生并且分泌进入培养基中。在一些实施方式中，分离可以包括从可溶性的包含SAP的级份中分离细胞级份 (例如通过离心)。在一些方面，在将靶分子与一种或多种N-糖基化活性接触之前使SAP多肽连接于固相支持物可能是有利的。此类连接可以允许在N-糖基化修饰之后更容易进行纯化。合适的固相支持物包括但不限于多孔检测平板、颗粒(例如磁性或编码的颗粒)、色谱柱或膜。在一些实施方式中，可以使用酶促或化学方式将本文描述的任意的改变的SAP多肽附着至异源部分。“异源部分”是指连接(共价或非共价地)于改变的靶分子的任何成分，所述成分不同于最初存在于SAP多肽中的成分。异源部分包括，例如，水溶性的和水不溶性的聚合物，靶向部分，治疗部分，诊断部分和生物分子。本发明的SAP多肽可以包含一个或多个“修饰的”糖残基。可以通过酶学方式、 化学方式或其组合将修饰基团附着至糖部分，从而产生修饰的糖，例如修饰的半乳糖、岩藻糖或唾液酸。当使用修饰的唾液酸时，这些方法中可以使用唾液酸转移酶或转唾液酸酶 (trans-sialidase)。可以在允许附着修饰部分、但仍然允许糖担当用于将修饰的糖附着至肽的酶的底物的任何位置进行糖的取代。一般地，通过使用反应性基团将糖部分和修饰基团连接在一起，通常是通过连接新的有机官能团或非反应性物质而转化。糖反应性官能团可以位于糖部分上的任意位置。 用于实施本发明的反应性基团和反应类别一般是生物缀合化学领域中熟知的。与反应性糖部分一起可用的目前受欢迎的反应类别是那些在相对温和条件下进行的反应。这些包括但不限于亲核取代(例如胺和醇与酰基卤、活性酯的反应)，亲电子取代(例如，烯胺反应)和碳-碳以及碳-杂原子多键的加成(例如迈克尔反应，狄耳士-阿德尔加成)。 这些和其它有用的反应描述于，例如，Smith and March, Advanced Organic Chemistry, 5th Ed. , Johnffiley & Sons, New York,2001 ；Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 ；禾口 Feeney 等人，Modification ofProteins ；Advances in Chemistry Series, Vol. 198,American ChemicalSociety, Washington, D.C.,1982。悬于糖核或修饰基团的有用的反应性官能团包括但不限于(a)羧基及其多种衍生物(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酸性卤化物、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯)；(b)羟基，其可以转化为酯、醚、醛等；(C)卤代烷基， 其中卤素可以随后被亲核基团替换，所述亲核基团是例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、负碳离子或醇盐离子，从而引起新的基团在卤素原子的官能团上附着；(d)亲二烯基团，其能够参与狄耳士-阿德尔反应，例如马来酰亚胺基团；(e)醛或酮基团，从而使得可以通过羰基衍生物例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟的形成或通过例如格里尼亚加成或烷基锂加成而进行后续衍生；(f)磺酰基卤化物基团，用于与胺进行后续反应，例如，形成硫胺类；(e)硫醇基，其能够例如被转化为二硫化物或与烷基和酰基卤化物反应；(h)胺或巯基，其能够例如被酰基化、烷基化或氧化；(i)链烯，其可以进行例如环式加成、酰基化、迈克尔加成、复分解反应，Heck反应等；(j)环氧化物，其能够与例如胺和羟基化合物反应。可以将反应性官能团选择为它们不参与或干扰那些组装反应性糖核或修饰基团必需的反应。备选地，可以通过保护基的存在对反应性官能团进行保护使其不参与反应。本领域技术人员理解如何保护某特定的官能团从而使其不干扰所选的一组反应条件。关于有用的保护基的实例，见例如Greene等人，Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York,1991。在一些实施方式中，修饰的糖是活化的糖。用于本发明中的活化的修饰的糖通常是糖苷，其通过合成被改变以包含激活的离去基团。如本文使用的术语“激活的离去基团” 是指在酶调节的亲核取代反应中容易地被置换的那些部分。很多激活的糖是本领域已知的° 见，例如 Vocadlo 等人，In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst 等人编，Wiley-VCH Verlag :ffeinheim, Germany, 2000 ；Kodama 等人，Tetrahedron Lett. 34 6419(1993) ；Lougheed，等人，J. Biol. Chem. 274 :37717 (1999)。此类离去基团的实例包括 氟、氯、溴、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、triflate等。用于本发明中的优选的激活的离去基团是那些对于糖苷向受体的酶促转移没有显著空间位阻的那些。因此，激活的糖苷衍生物的优选实施方式包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，糖基氟化物是特别优选的。在糖基氟化物中，α -半乳糖基氟化物、α -甘露糖基氟化物、α -葡萄糖基氟化物、α -岩藻糖基氟化物、 α -木糖基氟化物、α -唾液酸基氟化物、α -N-乙酰葡萄糖胺氟化物、α -N-乙酰半乳糖胺氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡萄糖基氟化物、β-岩藻糖基氟化物、β -木糖氟化物、β -唾液酸基氟化物、β -N-乙酰葡萄糖胺氟化物和β -N-乙酰半乳糖胺氟化物是最优选的。在一些方面，修饰的糖残基缀合于一种或多种水溶性聚合物。很多水溶性聚合物是本领域技术人员已知的，并且可用于实施本发明。术语“水溶性聚合物”包括例如下列物质糖(例如葡聚糖，淀粉，透明质酸，聚唾液酸、类肝素，肝素等)；聚氨基酸；核酸；合成的聚合物(例如，聚(丙烯酸)、聚(酯)，例如，聚乙二醇)；肽、蛋白等。可以使用任何水溶性聚合物实施本发明，唯一条件是该聚合物必须包括缀合物的其余部分能够缀合的点。用于激活水溶性聚合物和糖以及用于将糖和聚合物缀合至多种物质的方法和化学知识见于文献中的描述。用于激活聚合物的通常使用的方法包括使用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双-环氧化物、表氯环氧丙烷、二乙烯基砜、碳二亚胺、磺酰基商化物、三氯三嗪等激活官能团(B R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilization, Fundamentalsand Applications, Marcel Dekker, N. Y. ；S.S.Wong, (1992), Chemistryof Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton ;G. T. Hermanson 等人，(1993),Immobilized Affinity Ligand Techniques，Academic Press，N. Y. ；Dunn，R. L，等人， Eds.Polymeric Drugs andDrug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469， AmericanChemical Society, Washington, D.C. 1991) 0在一些方面，修饰的糖残基缀合于一种或多种水不溶性聚合物。在一些实施方式中，缀合至水不溶性聚合物可用于以受控方式递送治疗肽。多聚物的药物递送系统是本领域已知的。见，例如 Dunn 等人，Eds. Polymeric drugs and Drug Delivery Systems, ACS SymposiumSeries Vol. 469, American Chemical Society，Washington，D. C. 1991。本令页域技术人员将认识到，基本上任何已知的药物递送系统都适用于本发明的缀合物。代表性的水不溶性聚合物包括但不限于聚膦腈、聚(乙烯醇)、聚酰胺类、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚亚烷基氧化物、聚亚烷基对苯二甲酸酯，聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、 聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、普郎尼克类和聚对羟基苯乙烯，及其共聚物。本文讨论的这些和其它聚合物可以容易地从商业来源获得，例如Sigma Chemical Co. (St.Louis, Mo.), Polysciences (ffarrenton, Pa.), Aldrich (Milwaukee, Wis.), Fluka (Ronkonkoma, N. Y.)和 BioRad (Richmond，Calif.)，或者使用标准技术从获自这些供应商的单体合成。用于本发明的缀合物中的代表性的生物可降解聚合物包括但不限于聚丙交酯、聚乙交酯及其共聚物，聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共聚-己内酯)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、及其共混物和共聚物。特别有用的是形成凝胶的成分，例如，包括，胶原和普郎尼克类。在优选实施方式中，一个或多个修饰的糖残基缀合于一个或多个PEG分子。在一些方面，修饰的糖缀合于生物分子。本发明的生物分子可以包括但不限于功能性蛋白、酶、抗原、抗体、肽、核酸(例如单一核苷酸或核苷，寡核苷酸，多核苷酸和单链和更高链的核酸)，血凝素，受体或其组合。一些优选的生物分子基本上是非荧光的，或发射极小量的荧光，以致它们不适合在测验中用作荧光标志物。其它生物分子可以是荧光的。在一些实施方式中，生物分子是靶向部分。如本文使用的“靶向部分”和“靶向试剂”是指将选择性定位于身体的特定组织或区域的物质。在一些实施方式中，生物分子被选择为指导本发明的SAP多肽至特定的细胞内区室，从而增强肽至该细胞内区室的递送 (相对于递送至组织的非衍生肽的量)。定位是由分子决定簇的特定识别、靶向试剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水相互作用等调节的。将某试剂靶向特定组织或区域的其它机制是本领域技术人员已知的。在一些实施方式中，修饰的糖包括治疗部分。本领域技术人员将认识到，治疗部分与生物分子这两个类别彼此有重叠，即，很多生物分子具有治疗性质或潜力。有用的治疗部分的类别包括，例如非甾族抗炎药物；甾族抗炎药物；佐剂；抗组胺药；镇咳药；止痒药；抗胆碱能药；镇吐药和止恶心药；减食欲药；中枢兴奋药；抗心律失常药物；β -肾上腺素能阻滞药；强心药；抗高血压药；利尿药；血管扩张药；血管收缩药；抗溃疡药；麻醉药；抗抑郁药；强安定剂和镇静剂；抗精神病药物；和抗微生物药物。用于实施本发明的其它药物部分包括抗肿瘤药、杀细胞试剂、抗雌激素类和抗代谢物。该类别中还包括基于放射性同位素的试剂，其用于诊断(例如成像)和治疗，以及缀
合的毒素。治疗部分也可以是激素、肌肉松弛药、镇痉剂、骨激活剂、内分泌调节剂、糖尿病调节剂、雄激素、抗利尿药或降钙药。其它有用的修饰部分包括免疫调节药物、免疫抑制剂等。具有抗炎活性的基团， 例如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸，也是有用的。用于本发明中的其它药物将是本领域技术人员显而易见的。通过本公开的方法产生的改变的N-糖基化SAP多肽可以是勻质的(S卩，SAP多肽的样品在特定的N-聚糖结构上是单一的)或实质上勻质的。“实质上勻质”意思是至少大约25% (例如，至少大约27%，至少大约30%，至少大约35%，至少大约40%，至少大约45%，至少大约50%，至少大约55%，至少大约60%，至少大约65%，至少大约70%，至少大约75 %，至少大约80 %，至少大约85 %，至少大约90 %，或至少大约95 %，或至少大约 99% )的SAP多肽含有相同的特定的N-聚糖结构。在一些实施方式中，本发明的变体SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl与分离自人血清的野生型SAP的对应样品相比，小于其1/2，小于其1/3，小于其 1/4，小于其1/10，或小于其1/100。有很多完善确立了的用于测定外周血单核细胞(PBMC) 或单核细胞对于SAP的响应性(就纤维细胞分化而言)的方法。这些方法可用于确定本发明的任意SAP变体多肽相对于源自人血清的SAP样品、任何其它SAP变体多肽或其它纤维细胞抑制剂或激活剂的相对效力。适合用于这些方法中的PBMC或单核细胞可获自多种组织培养系。备选地，适合于纤维细胞分化测定的细胞可以获自包含PBMC或单核细胞的任何生物样品。生物样品可以获自血清、血浆、健康组织或纤维变性组织。一般地，通过将培养基中的PBMC或单核细胞与多种浓度的SAP多肽一起温育来进行纤维细胞分化测定，以确定纤维细胞分化程度。SAP的浓度可以介于0. 0001 μ g/mL至lmg/ml，在一些实施方式中是 0. 001 μ g/mL,1. 0 μ g/mL,5 μ g/mL,10 μ g/mL,15 μ g/mL,20 μ g/mL,25 μ g/mL,30 μ g/mL, 35 μ g/mL,40 μ g/mL,45 μ g/mL,50 μ g/mL,100 μ g/mL,200 μ g/mL,300 μ g/mL 或 500 μ g/ mL。在一些测验中，培养基中可以补充l-100ng/ml hMCSF ;hMCSF的优选浓度是25ng/mL。 本领域技术人员可以确定PBMC和单核细胞已经分化为纤维细胞的指征。一般地，纤维细胞在形态上确定为粘附细胞，具有延长的纺锤形状，并存在椭圆形细胞核。在一些测验中，固定细胞并以Hema 3染色，然后通过直接计数法计数纤维细胞，例如使用倒置显微镜。本领域技术人员通过判读纤维细胞分化的量而作为细胞对于SAP应答的指示。如本公开的实施例中所示，纤维细胞分化的较大的抑制表示较大程度的SAP应答。测定纤维细胞分化的备选方法包括测定纤维细胞特异性细胞表面标志物或分泌的因子的表达，例如细胞因子(例如IL-lra，ENA-78/CXCL-5，PAI-l)、纤连蛋白、胶原_1。检测和/或定量细胞表面标志物或分泌的因子的方法是本领域熟知的，包括但不限于多种基于ELISA和FACS的技术使用针对一种或多种纤维细胞特异性标志物的免疫反应性抗体。如本公开的实施例中所描述， 测定巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)是测定纤维细胞分化的有效方法。用于检测和/或表征SAP多肽的N-糖基化(例如，改变的N-糖基化)的方法包括DNA测序仪辅助的(DSA)、荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)或表面增强的激光解吸附电离-飞行时间-质谱(SELDI-TOF MS)。例如，分析可以采用DSA-FACE，其中，例如，将糖蛋白变性，然后固定于例如膜上。然后使用合适的还原剂例如二硫苏糖醇(DATA)或β-巯基乙醇将糖蛋白还原。可以使用酸例如碘代乙酸羧化蛋白的巯基。接下来，可以使用酶、例如 N-糖苷酶F使N-聚糖从蛋白上释放。任选地，可以通过还原性胺化使N-聚糖重构和衍生。
然后可以浓缩衍生的N-聚糖。适合于分析N-聚糖的仪器包括，例如ABI PRISM 377 DNA 测序仪(Applied Biosystems)。可以使用例如软件GENESCAN . 3. 1 (Applied Biosystems)进行数据分析。任选地，可以使用一种或多种酶进一步处理分离的甘露糖蛋白以确认它们的N-聚糖状态。示例性的酶包括，例如，α-甘露糖苷酶或α-1，2甘露糖苷酶。分析N-聚糖的另外的方法包括，例如，质谱(例如，MALDI-T0F-MS)，正常相位上的高压液体色谱(HPLC)，反相色谱和离子交换色谱(例如，当聚糖不被标记时，使用脉冲化电流计检测；如果聚糖被适当标记，则使用紫外吸收或荧光)。另外参考Callewaert等人Q001) Glycobiology 11(4) :275-281 和 Freire 等人(2006)Bioconjug. Chem. 17(2) :559-564, 们各自的公开内容通过引用方式全文并入本文。治疗方法在一些方面，本公开提供了通过向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的变体SAP多肽而治疗SAP响应性病症的方法。治疗的剂量和频率可以由本领域技术人员确定，并且将根据患者的症状、年龄和体重以及待治疗或预防的病症的性质和严重性而变化。 在一些实施方式中，变体SAP多肽向患者施用为每天1或2次，每周1或2次，每月1或2 次，或仅在症状发作前或发作时施用。剂量可以通过本领域技术人员已知的技术或按照本文教导来容易地确定。SAP 的毒性和治疗功效可以通过实验动物中的标准药学程序来确定，例如，测定LD5tl和ED5tlt5 ED5tl(有效剂量50)是在50%的动物群体中产生指定效应所需的药物的量。LD5tl(致死剂量 50)是杀死50%的样品群体的药物剂量。在一些实施方式中，SAP响应性病症是纤维化。SAP用作纤维化的治疗性处理的用途描述于美国专利申请号2007/0M3163，通过引用方式并入本文。可以根据本发明的方法治疗的纤维化相关的病症包括但不限于胶原疾病、间质性肺病、人纤维变性肺病(例如， 闭塞性细支气管、特发性肺纤维化、病因已知的肺纤维化、肺病中的肿瘤间质、影响肺的系统性硬化病、赫曼斯基-普德拉克综合征、煤工尘肺、石棉肺、矽肺、慢性肺高压、AIDS-相关的肺高压、肉瘤样病、中度至重度哮喘等)、纤维变性性血管疾病、动脉硬化、动脉粥样硬化、 静脉曲张、冠状梗死、大脑梗塞、心肌纤维化、肌骨骼纤维化、手术后黏着、人肾病(例如，肾病综合征、奥尔波特综合征、HIV-相关的肾病、多囊肾病、法布里病、糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、与全身性红斑狼疮相关的肾炎等)、进行性系统性硬化(PSS)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝纤维化、肝硬变、肾纤维化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性移植物抗宿主病、硬皮病(局部和全身)、格雷夫斯眼病、糖尿病视网膜病变、青光眼、Peyronie病、阴茎纤维化、膀胱镜后尿道狭窄、手术后内粘连、结瘢、骨髓纤维化、特发性腹膜后纤维化、已知病因的腹膜纤维变性、药物诱导的麦角中毒、伴随良性或恶性癌症的纤维化、伴随微生物(例如，病毒、 细菌、寄生虫、真菌等)感染的纤维化、阿尔茨海默病、伴随炎性肠病的纤维化(包括克罗恩病和微观结肠炎中的狭窄形成)、间质细胞肿瘤、粘膜炎、化学或环境刺激诱导的纤维化 (例如，癌症化疗、杀虫剂或放射(例如，癌症的放疗))。在一些实施方式中，纤维化相关的病症选自全身或局部硬皮病、瘢痕疙瘩、肥厚性瘢痕、动脉粥样硬化、再狭窄、肺炎症和纤维化、特发性肺纤维化、肝硬化、由于慢性乙肝或丙肝感染造成的纤维化，肾疾病、由于瘢痕组织造成的心脏疾病、黄斑变性以及视网膜和玻璃体视网膜病变。在一些实施方式中，纤维化相关病症是由于下列造成的化疗药物、放射诱导的纤维化和损伤及烧伤。在一些实施方式中，纤维化相关的病症或病况是由于手术后结痂，例如小梁切除术或眼睛的其它过滤外科手术之后造成的。在一些实施方式中，SAP响应性病症是超敏反应病症，例如由Thl或Th2应答介导的那些。SAP用作超敏反应病症的治疗性处理的用途也描述于美国临时申请号 61/209，795，通过引用方式并入本文。可以通过SAP治疗的超敏反应相关病症包括但不限于变态反应性鼻炎、变应性鼻窦炎、变应性结膜炎、变应性支气管收缩、变应性呼吸困难、 肺中粘液产量的变应性增力Π、特应性湿疹、皮炎、荨麻疹、过敏反应、肺炎和变应性哮喘。在一些实施方式中，本发明的变体SAP多肽可用于治疗变应原特异性免疫应答， 例如针对多种抗原的过敏反应，包括但不限于抗微生物试剂(例如，头孢菌素类，磺胺类、 青霉素和其它β-内酰胺类)，抗惊厥药(例如，苯妥英、苯巴比妥、卡马西平、氨苯砜、别嘌呤醇和米诺环素)，化疗剂(例如，紫杉烷类、钼化合物、天冬酰胺酶和表鬼白毒素)，肝素、 胰岛素、鱼精蛋白、阿斯匹林和其它非留族抗炎药物，肌肉松弛剂(例如，琥珀酰胆碱、阿曲库铵、维库溴铵和泮库溴铵)，诱导剂(例如，巴比土酸盐、依托咪酯、二异丙酚)，麻醉品 (例如，芬太尼、哌替啶、吗啡)，用于静脉内体积扩张的胶体，放射对比物质，血液制品，胶乳，动物制品，动物屑，尘螨，昆虫(例如，叮咬、螫伤或毒液)，化妆品，金属(例如，镍、钴和铬酸盐)，植物，孢子，花粉，食物(例如，牛奶、鸡蛋、小麦、大豆、花生和坚果、海鲜)，疫苗接种和真菌抗原(例如，曲霉菌属、弯孢霉属、明脐菌属和链格孢属)。在一些实施方式中，SAP响应性病症是自身免疫病症，例如由Thl或Th2应答介导的那些。SAP用作自身免疫病症的治疗性处理的用途也描述于美国临时申请号 61/209，845，通过引用方式并入本文。可以通过SAP治疗的自身免疫相关病症包括但不限于1型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、自身免疫心肌炎、天疱疮、 重症肌无力、乔本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、阿狄森病、自身免疫性肝炎、慢性莱姆关节炎、 家族性扩张型心肌病、青少年型皮肌炎、多软骨炎、干燥综合征、牛皮癣、青少年特发性关节炎、炎性肠病、系统性红斑狼疮、慢性阻塞性肺病和移植物抗宿主病。在一些实施方式中，SAP响应性病症是粘膜炎。SAP用作粘膜炎的治疗性处理的用途也描述于美国申请号12/217，614，通过引用方式并入本文。本发明的方法可用于治疗口的、食道的和胃肠的粘膜炎，以及胃和十二指肠溃荡，或胃和食道的侵蚀。在一些实施方式中，本发明的变体SAP多肽可用于治疗炎性疾病或病况。在一些实施方式中，炎性疾病可以是病毒、细菌、真菌或寄生虫感染。SAP用作病毒感染的治疗性处理的用途也描述于美国专利6，406，698和国际专利申请号W01997/(^6906，二者通过引用方式并入本文。药学制备物和制剂在一些实施方式中，本文描述的方法包括向受试者施用至少一种本发明的变体SAP多肽，作为治疗剂。本发明的治疗剂可以按照常规方式配制使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂。例如，治疗剂及其生理上可接受的盐和溶剂化物可以配制为用于通过例如注射(例如SubQ、IM、IP)、吸入或喷洒(通过口或鼻)或口、口腔、舌下、透皮、鼻、胃肠外或直肠施用。在一些实施方式中，治疗剂可以局部施用，在靶细胞所存在的位点，即，在特定组织、器官或液体(例如，血液、脑脊髓液、肿瘤质等)。本发明还提供了本发明的任意变体SAP多肽在制备用于治疗或预防患者中的如本文描述的病症或病况的药物中的用途，例如，变体SAP多肽在制备用于治疗本文描述的病症或病况的药物中的用途。在一些方面，本发明的任意变体SAP多肽可用于制备用于治疗或预防如本文描述的疾病或病况的药学制备物。治疗剂可以配制为通过多种方式给药，包括全身性和表面或局部给药。一般地，技术禾口制剂可以见 Remington’s PharmaceuticalSciencesjMeade Publishing Co. ,Easton, PA。对于胃肠外给药，注射是优选的，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下。就注射而言，化合物可以配制于溶液中，优选为生理相容的缓冲液，例如Hank溶液或Ringer溶液。另外，化合物可以配制为固体形式并在临使用前溶解或悬浮。也包括冻干的形式。在一些实施方式中，可以通过本领域熟知的多种方法向细胞施用治疗剂，包括但不限于包裹于脂质体中， 通过离子电渗法，或通过掺入其它介质中，例如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊以及生物粘附性的微球体。对于口服给药，药物组合物可以采取下列形式，例如，片剂、锭剂或胶囊，其通过常规方式使用药学上可接受的赋形剂制备，例如，粘合剂(例如，预胶凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、云母或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠)。可以通过本领域熟知的方法包被片剂。用于口服给药的液体制备物可以采取以下形式，例如，溶液、糖浆或悬浮液，或者它们可以呈现为干燥产品，在使用前以水或其它合适的介质复原。此类液体制备物可以通过常规方式制备，使用药学上可接受的添加剂，例如，悬浮剂(例如山梨醇浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水性介质(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。制备物还可以视需要包含缓冲盐、香味剂、 着色剂和甜味剂。用于口服给药的制备物可以适宜地配制以提供活性化合物的受控释放。对于通过吸入施用(例如肺部递送)，治疗剂可以方便地以气雾剂喷雾剂的形式递送，从加压包或雾化器中制得，并使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它的合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单元可以通过提供阀门来确定，以递送计量的量。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如明胶的)可以配制为包含化合物与合适的粉末基底例如乳糖或淀粉的粉末混合物。在本发明的方法中，药学化合物也可以通过鼻内或支气管内途径施用，包括吸Λ法、粉末和气雾剂制剂(例如，类固醇吸入剂，见Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacology. 35 :1187-1193 ；Tjwa(1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75 :107-111)。例如，可以将气雾剂制剂置于加压的可接受的推进剂、例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等之中。 它们也可以配制为非加压制备物的药物，例如在喷雾器或雾化器中。通常而言，此类施用方式是在含水的药学可接受的缓冲液中。
适合于呼吸道递送(例如鼻内、吸入等)变体SAP多肽的药物组合物可以配制为固体或液体形式。本发明的SAP多肽可以配制为通过注射而用于胃肠外施用，例如通过推注或持续滴注。用于注射的制剂可以是单元剂量形式，例如在安瓿或多剂容器中，使用添加的防腐剂。组合物可以采取下列形式，例如，油性或水性介质中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。备选地，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前通过合适的介质、例如无菌的无热源的水来复原。此外，本发明的SAP多肽还可以配制为贮库制剂。此类长效制剂可以通过移植(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，治疗剂可以与合适的聚合材料或疏水性材料一起配制(例如，作为可接受的油中的乳液)，或与离子交换树脂一起配制，或作为略溶性衍生物，例如，作为略溶性的盐。控释制剂也可以包括贴剂。在一些实施方式中，本文描述的化合物可以配制为递送至中枢神经系统(CNS) (综述见 Begley，Pharmacology & Therapeutics 104 :29-45 (2004)) 用于将药物递送至 CNS的常规方法包括神经外科方法(例如大脑内注射或脑室内注入)；试剂的分子操作 (例如，产生嵌合的融合蛋白，其包含具有针对内皮细胞表面分子的亲和性的转运肽，以及在尝试利用血脑屏障的内源性转运途径之一时本身不能跨越血脑屏障的试剂)；设计为增加试剂在液体中的溶解性的药理学策略(例如，将水溶性试剂缀合于脂或胆固醇载体)；以及，通过高渗破坏(由于甘露醇溶液浸入颈动脉或由于使用生物活性试剂例如血管紧张素肽而引起)短暂破坏血脑屏障的完整性。在一些实施方式中，本发明的SAP多肽掺入包含表面载体的表面制剂中，所述表面载体一般适合于表面药物施用并且包括本领域已知的任何此类材料。可以将表面载体选择为以所需的形式提供组合物，例如膏、洗液、霜、微乳剂、胶、油、溶液等，并且可以包含天然产生的或合成来源的物质。优选的是，所选的载体对于表面制剂的活性试剂或其它成分没有不利影响。用于本文的合适的表面载体的实例包括水、醇和其它无毒性有机溶剂，甘油，矿物油，硅酮，凡士林，羊毛脂，脂肪酸，植物油，对羟苯甲酸酯，蜡等。药物组合物(包括美容制备物)可以包含大约0. 00001%至100%重量的一种或多种本文描述的变体SAP多肽，例如0.001%至10%，或0. 至5%。在一些表面制剂中，活性试剂的存在量是制剂的大约0. 25wt. %至75wt. %，优选为制剂的大约0. 25wt. % 至30wt. %，更优选为制剂的大约0. 5wt. %M 15wt. %，最优选为制剂的大约1. Owt. %M IOwt. %。眼睛的病况可以通过例如全身性、表面性、眼内注射治疗剂，或通过插入释放治疗剂的持续释放装置来治疗或预防。本发明的SAP多肽可以通过药学上可接受的眼科介质来递送，从而化合物保持与眼睛表面接触足以允许化合物进入眼睛的角膜和内部区域的时间段，例如，前房、结膜、后房、玻璃体、眼房水、玻璃体液、角膜、虹膜/睫、晶状体、脉络膜/视网膜和巩膜。药学上可接受的眼科介质可以是，例如，膏、植物油或封装材料。备选地，化合物可以直接注射进入玻璃体液和眼房水。在进一步的备选方案中，化合物可以全身施用，例如通过静脉内注入或注射，以治疗眼睛。本文描述的治疗剂可以根据本领域的方法储存于无氧环境下。示例性的组合物包含SAP多肽和一种或多种药学上可接受的载体，以及，可选地包含其它治疗成分。载体必须是“药学上可接受的”，其意指与组合物中的其它成分兼容并且不在受试者中引发不能接受的有害的效应。此类载体在本文中有描述或者是药理学技术领域技术人员熟知的。在一些实施方式中，药物组合物是无热源的，并且适合于向人类受试者施用。在一些实施方式中，药物组合物是无刺激物的并且适合于向人类患者施用。在一些实施方式中，药物组合物是无变应原的并且适合于向人类患者施用。组合物可以通过药学领域熟知的任何方法制备。在一些实施方式中，SAP多肽以时间释放制剂施用，例如，包括缓释聚合物的组合物。可以使用保护SAP多肽免于迅速释放的载体来制备SAP多肽。实例包括控释介质，例如聚合物、微胶囊化递送系统或生物粘附性凝胶。备选地，可以通过在组合物中加入延迟吸收的试剂、例如单硬脂酸铝水凝胶和明胶来实现SAP多肽的延长的递送。用于递送核酸化合物的方法是本领域已知的(见，例如Alchtar等人，1992， Trends Cell Bio. ,2,139 ；and Delivery Strategies forAntisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995 ；Sullivan 等人’ International Application No. WO 94/02595)。这些程序可用于递送基本上任何核酸化合物。可以通过本领域技术人员熟悉的多种方法将核酸化合物施用于细胞，包括但不限于封装于脂质体中，通过离子电渗法， 或通过掺入其它介质中，例如水凝胶、环糊精、生物可降解的纳米胶囊以及生物粘附性的微球体。备选地，通过直接注射或通过使用输液泵局部递送核酸/介质组合。其它的递送途径包括但不限于口服(药片或药丸形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience, 76,1153-1158)。其它方法包括使用多种转运子和载体系统，例如通过使用缀合物和生物可降解聚合物。关于药物递送方法的全面综述，见Ho等人，1999，Curr. Opin. Mol. Ther. , 1,336-343 and Jain, DrugDelivery Systems !Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 禾口 Groothuis 等人，1997, J. Neuro Virol. ,3, 387-400。在 Sullivan 等人，见上文，Draper 等人，PCT W093/23569, Beigelman 等人，国际申请号W099/05094和Klimuk等人，国际公开号W099/04819中提供了关于核酸递送和给药的更详细的描述。以下实施例用于更详细地描述使用上述发明的方式，并给出了用于实施本发明的多个方面的最佳方式。应该理解，这些实施例不是为了限制本发明的真实范围，而是为了示例性的目的。实施例实施例1 重组SAP效力比源自人血清的SAP更高使用体外生物测验法分析了分离自CHO-S细胞的重组人SAP (rhSAP)和源自人血清的SAP(hSAP)的生物活性。在该测验中，将富含外周血单核细胞(PBMC)的单核细胞与不同浓度的rhSAP或hSAP —起温育96小时。温育之后，收集得到的培养上清液并通过ELISA 测定以定量所产生的巨噬细胞衍生的趋化因子(MDC)的量。MDC是由纤维细胞产生的，因此其是单核细胞分化为纤维细胞的指示。通过比较样品与hSAP参考标准物的抑制性浓度， 50% (IC5tl),可以测定SAP糖变体的相对效力。结果表示为样品的IC5tl值与hSAP参考标准物之比。在经补充的FibroLife 培养基(Supplemented FibroLife Media)中将所有的 SAP 样品和标准物的最初浓度稀释至1. Omg/mL。连续稀释SAP标准物以产生下列工作标准浓度:60, 30，20，13. 4，8. 8，6. 0，3. 0，1. 5 和 0. 75 μ g/mL (最终标准物的浓度为 30，15，10，6. 7， 4. 4,3. 0. 1. 5,0. 75 和 0. 375 μ g/mL)。见下表 1。
权利要求
1.糖基化的人血清淀粉样蛋白P(SAP)多肽，其包含N-连接的寡糖链，其中所述寡糖链的至少一个分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。
2.糖基化的人SAP多肽，其包含N-连接的寡糖链，其中所述寡糖链相对于分离自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2,6-连接的唾液酸部分。
3.权利要求1的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链的所有分支终止于α2，3-连接的唾液酸部分。
4.权利要求2的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链实质上不含α2，6-连接的唾液酸部分。
5.权利要求1-4任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链具有双触角结构。
6.权利要求1-4任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链具有三触角结构。
7.权利要求1-4任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链具有四触角结构。
8.权利要求1-4任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链具有五触角结构。
9.权利要求1-8任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述N-连接的寡糖链包含以下的五糖核心:Man [(α 1,6)-(Man (α 1,3)] -Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1, N) -Asn0
10.权利要求1-9任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链包含具有结构 NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一个分支。
11.权利要求1-10任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链的至少一个分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
12.权利要求11的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链的所有分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
13.权利要求1-12任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链的至少一个分支包含一个或多个甘露糖残基。
14.权利要求1-13任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链包含至少一个岩藻糖残基。
15.权利要求1-14任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述寡糖链包含至少一个修饰的糖基残基。
16.权利要求15的糖基化的人SAP多肽，其中至少一个修饰的糖基残基缀合于选自下列的一个或多个修饰基团水溶性和水不溶性的聚合物、治疗部分、诊断试剂和生物分子。
17.权利要求1-16任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述SAP多肽是重组多肽。
18.权利要求1-17任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含与SEQID NO=I 至少85%同一的氨基酸序列。
19.权利要求1-17任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含与SEQID NO=I 至少95%同一的氨基酸序列。
20.权利要求1-19任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽是包含SAP结构域和一个或多个异源结构域的融合蛋白。
21.权利要求20的糖基化的人SAP多肽，其中所述一个或多个异源结构域增强下列一项或多项体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成，和/ 或纯化。
22.权利要求1-21任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述多肽包含一个或多个修饰的氨基酸残基。
23.权利要求22的糖基化的人SAP多肽，其中所述一个或多个修饰的氨基酸残基包括 PEG化的氨基酸，异戊烯化的氨基酸，乙酰化的氨基酸，生物素化的氨基酸，和/或缀合于有机衍生剂的氨基酸。
24.权利要求23的糖基化的人SAP多肽，其中所述一个或多个修饰的氨基酸残基增强下列一项或多项体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白复合物的形成、和/或纯化。
25.权利要求I-M任一项的糖基化的人SAP多肽，其中所述SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
26.适合用于哺乳动物的药学制备物，其包含权利要求1-25任一项的人SAP多肽和药学上可接受的载体。
27.权利要求沈的药学制备物，其还包含另外的活性试剂。
28.权利要求沈的药学制备物，其中所述药学制备物配制为缓释制剂。
29.权利要求沈的药学制备物，其中所述药学制备物适合于表面地、通过注射、通过静脉内注射、通过吸入、通过持续贮库或通过泵施用至患者。
30.治疗或预防患者中的纤维变性或纤维增殖性病症或病况的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的SAP多肽。
31.治疗或预防患者中的超敏反应病症或病况的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的SAP多肽。
32.治疗或预防患者中的粘膜炎的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的SAP多肽。
33.治疗或预防患者中的自身免疫病症或病况的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-25任一项的SAP多肽。
34.权利要求30-33任一项的方法，其中所述SAP多肽表面地、通过注射、通过静脉内注射、通过吸入、通过持续贮库或通过泵或其组合施用。
35.权利要求30-33任一项的方法，还包括向患者施用另外的活性试剂。
36.制备糖基化的人SAP多肽的方法，包括i)在细胞中表达权利要求1- 任一项的SAP多肽；和 )从细胞中分离SAP多肽。
37.制备人SAP多肽的方法，包括i)在CHO细胞中表达人SAP多肽；和 )从细胞中分离人SAP多肽。
38.权利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-连接的寡糖链，并且其中所述寡糖链的至少一个分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。
39.权利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-连接的寡糖链，并且其中所述寡糖链相对于分离自人血清的野生型SAP具有低至少50%的α 2,6-连接的唾液酸部分。
40.权利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-连接的寡糖链，并且其中所述寡糖链的所有分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。
41.权利要求37的方法，其中所述SAP多肽包含N-连接的寡糖链，并且其中所述寡糖链实质上不含α 2，6-连接的唾液酸部分。
42.权利要求38-41任一项的方法，其中所述寡糖链具有双触角结构。
43.权利要求38-41任一项的方法，其中所述寡糖链具有三触角结构。
44.权利要求38-41任一项的方法，其中所述寡糖链具有四触角结构。
45.权利要求38-44任一项的方法，其中所述分离的人SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
46.权利要求38-45任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖链包含以下的五糖核心 Man [ ( α 1，6)-(Man (α 1,3)]—Man (β 1,4) -GlcNAc (β 1,4) -GlcNAc (β 1，N)_Asn。
47.权利要求38-46任一项的方法，其中所述寡糖链包含具有结构 NeuNAc2 α 3Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6 的至少一个分支。
48.权利要求38-47任一项的方法，其中所述寡糖链的至少一个分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
49.权利要求48的方法，其中所述寡糖链的所有分支实质上不含半乳糖和N-乙酰葡萄糖胺。
50.权利要求38-49任一项的方法，其中所述寡糖链的至少一个分支包含一个或多个甘露糖残基。
51.权利要求38-50任一项的方法，其中所述寡糖链包含至少一个岩藻糖残基。
52.权利要求38-51任一项的方法，其中所述寡糖链包含至少一个修饰的糖基残基。
53.权利要求52的方法，其中至少一个修饰的糖基残基缀合于选自下列的一个或多个修饰基团水溶性和水不溶性的聚合物、治疗部分、诊断试剂和生物分子。
54.权利要求36的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
55.权利要求35或36的方法，进一步包括酶促地或化学地改变分离的SAP多肽以产生具有修饰的寡糖链的SAP多肽。
56.权利要求55的方法，其中酶促地或化学地改变分离的SAP多肽的方法包括以选自糖基转移酶、糖苷酶和磷酸酶的一种或多种酶蛋白处理分离的SAP多肽。
57.权利要求55的方法，其中酶促地或化学地改变分离的SAP多肽的方法在存在一种或多种糖前体的情况下进行。
58.权利要求57的方法，其中一种或多种糖前体选自=UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神经氨酸，UPD-半乳糖和⑶P-岩藻糖。
59.权利要求55的方法，其中酶促地或化学地改变分离的SAP多肽的方法从寡糖链除掉一个或多个末端的α 2，6_连接的唾液酸部分。
60.权利要求55的方法，其中酶促地或化学地改变分离的SAP多肽的方法将寡糖链上的一个或多个末端的α 2，6_连接的唾液酸部分替换为一个或多个α2，3_连接的唾液酸部分。
61.权利要求36-60任一项的方法，其中所述分离的SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
62.制备SAP多肽的方法，包括i)提供糖基化的SAP多肽，其中所述糖基化的SAP多肽包含N-连接的寡糖链；和 )酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的寡糖链以产生修饰的糖基化的SAP多肽。
63.权利要求62的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的寡糖链的方法从寡糖链除掉一个或多个末端的α 2，6-连接的唾液酸部分。
64.权利要求62的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的寡糖链的方法将寡糖链上的一个或多个末端的α 2，6_连接的唾液酸部分替换为一个或多个α 2，3_连接的唾液酸部分。
65.权利要求62-64任一项的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的寡糖链的方法包括以选自糖基转移酶、糖苷酶和磷酸酶的一种或多种酶蛋白处理SAP多肽。
66.权利要求62-65任一项的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的N-连接的寡糖链的方法在存在一种或多种糖前体的情况下进行。
67.权利要求66的方法，其中一种或多种糖前体选自=UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神经氨酸，UPD-半乳糖和⑶P-岩藻糖。
68.权利要求62-67任一项的方法，其中N-连接的寡糖链相对于分离自人血清的野生型人SAP蛋白具有低至少50%的α 2，6-连接的唾液酸部分。
69.权利要求62-67任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖链实质上不含α2，6_连接的唾液酸部分。
70.权利要求62-69任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有双触角结构。
71.权利要求62-69任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有三触角结构。
72.权利要求62-69任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有四触角结构。
73.权利要求62-69任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有五触角结构。
74.权利要求62-73任一项的方法，其中寡糖链的至少一个分支终止于α2，3-连接的唾液酸部分。
75.权利要求74的方法，其中寡糖链的所有分支终止于α2，3-连接的唾液酸部分。
76.权利要求62-75任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖链具有至少一个修饰的糖基残基。
77.权利要求76的方法，其中至少一个修饰的糖基残基缀合于选自下列的一个或多个修饰基团水溶性和水不溶性的聚合物、治疗部分、诊断试剂和生物分子。
78.权利要求62-77任一项的人SAP多肽，其中所述修饰的糖基化的SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
79.制备SAP多肽的方法，包括i)提供SAP多肽；和 )酶促地或化学地改变SAP多肽以产生包含N-连接的寡糖的糖基化的SAP多肽。
80.权利要求79的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的方法包括以选自糖基转移酶、糖苷酶和磷酸酶的一种或多种酶蛋白处理SAP多肽。
81.权利要求79或80的方法，其中酶促地或化学地改变SAP多肽的方法在存在一种或多种糖前体的情况下进行。
82.权利要求81的方法，其中一种或多种糖前体选自UDP-N-乙酰葡萄糖胺， UDP-N-乙酰半乳糖胺，CMP-N-乙酰神经氨酸，UPD-半乳糖或⑶P-岩藻糖。
83.权利要求79-82任一项的方法，其中N-连接的寡糖链相对于分离自人血清的野生型SAP蛋白具有低至少50%的α 2，6-连接的唾液酸部分。
84.权利要求79-82任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖链实质上不含α2，6_连接的唾液酸部分。
85.权利要求79-84任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有双触角结构。
86.权利要求79-84任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有三触角结构。
87.权利要求79-84任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有四触角结构。
88.权利要求79-84任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖具有五触角结构。
89.权利要求79-88任一项的方法，其中寡糖链的至少一个分支终止于α2，3-连接的唾液酸部分。
90.权利要求89的方法，其中寡糖链的所有分支终止于α2，3-连接的唾液酸部分。
91.权利要求79-90任一项的方法，其中所述N-连接的寡糖链具有至少一个修饰的糖基残基。
92.权利要求91的方法，其中至少一个修饰的糖基残基缀合于选自下列的一个或多个修饰基团水溶性和水不溶性的聚合物、治疗部分、诊断试剂和生物分子。
93.权利要求79-92任一项的人SAP多肽，其中所述糖基化的SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
94.通过包括下列的方法制备的人SAP多肽 i)在CHO细胞中表达SAP多肽；和 )从细胞中分离SAP多肽。
95.权利要求94的人SAP多肽，其中所述SAP多肽的抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
96.权利要求94或95的人SAP多肽，其中所述方法还包括改变分离的SAP多肽的糖基化结构。
97.包含人SAP多肽的CHO细胞，所述人SAP多肽包含N-连接的寡糖链，其中所述寡糖链的至少一个分支终止于α 2，3-连接的唾液酸部分。
98.包含编码异源SAP多肽的核酸的CHO细胞。
99.人SAP多肽，其抑制单核细胞在体外分化为纤维细胞的IC5tl小于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的1/2。
100.治疗或预防患者中的炎性病症或病况的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求1-15任一项的SAP多肽。
全文摘要
本发明的一个方面涉及如下的令人惊奇的发现修饰人SAP多肽上的聚糖结构能够增强SAP多肽相对于分离自人血清的野生型SAP的对应样品的生物学活性。本公开提供了变体人SAP多肽及其制备方法。特别地，本发明提供了用于体外和体内添加、删除或修饰糖残基以产生具有需要的糖基化模式的SAP多肽、例如人SAP多肽的方法和组合物。
文档编号A61P29/00GK102574902SQ201080028923
公开日2012年7月11日 申请日期2010年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者R·J·凯梅, W·S·维莱特 申请人:普罗麦迪奥股份有限公司