专利名称：具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白、其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白及编码该蛋白的多核苷酸。本发明还涉及采用高表达效率的表达系统表达该蛋白的制备方法以及该蛋白在制备心脏疾病药物中的用途。
背景技术：
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡(programmedcell death，PCD)。作为细胞生命的基本特征之一，细胞凋亡是一个主动的、高度有序的、由遗传基因控制及一系列酶参与的细胞主动死亡过程，是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。细胞凋亡对于多细胞有机体调控机体发育、维护内环境稳定、维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。细胞凋亡是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施，许多疾病的发生与细胞凋亡失控有着密切的联系。如神经退行性疾病及缺血性心肌损伤就与细胞的过度凋亡有关。心脏是由有丝分裂后的处于终末分化状态的心肌细胞组成的，即心肌细胞不再进行分裂和增殖。这就意味着心肌细胞的损伤和死亡及由此造成的心肌细胞数目减少在进化上并不能够通过有效的心肌细胞分裂和增殖来弥补。心肌细胞的凋亡在成年人类心脏是一种正常的生理现象，有很多因素可引起心肌细胞发生凋亡，包括氧化应激反应、缺血缺氧、血管紧张素IKFasligand、机械张力、肿瘤坏死因子-α、β-肾上腺素拮抗剂、抗肿瘤药蒽环霉素等等。凋亡的心肌细胞参与心血管系统的许多生理和病理变化过程，是导致多种心血管疾病发生和演变的重要细胞学基础。越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡与许多心脏疾病，如心肌梗塞、心力衰竭、原发性心肌病、 心肌肥厚以及抗肿瘤药物蒽环霉素诱导所致的心肌毒性等有密切的关系。不同的因素可能通过不同的机制启动诱导心肌细胞凋亡的信号转导，激活凋亡的执行器从而造成细胞凋亡。心肌细胞是失去了分裂能力的终末分化细胞，其细胞周期的调节、促凋亡因子和抗凋亡因子的分布及凋亡的信号转导过程与有分裂能力的细胞不同。目前已发现，心肌细胞至少存在有两条凋亡途径一条由Bad —细胞色素-C — caspase-9 — caspase-3 — PARP构成； 另一条由caspase-6禾口 Lamin A构成。目前，心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势， 已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8%，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。因此，本领域迫切需要了解与抗心肌细胞凋亡相关的蛋白，并利用其作用特性，将其改造成一个药物分子，或将其作为一个药物的“靶分子”应用到临床治疗中，这必将带来巨大的经济效益和良好的社会效益。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种新型的具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白。本发明的另一个目的是提供编码上述蛋白的多核苷酸。本发明的另一个目的是提供所述蛋白的制备方法及其用途。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供了一种具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白，所述蛋白为包含 SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、变体或衍生物。优选地，所述蛋白为SEQ. ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽。另一方面，本发明提供了编码上述蛋白的多核苷酸以及与该多核苷酸互补的多核苷酸。在编码上述蛋白的多核苷酸中，该多核苷酸优选包含SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列；进一步优选地，该多核苷酸为SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列。此外，本发明还提供包含上述多核苷酸的重组载体；优选地，所述重组载体为本发明所提供的 pPIC9K-Cardiac Salvation。并且，本发明还提供包含上述的重组载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；进一步优选地，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。再一方面，本发明提供一种上述具有抗心肌细胞凋亡功能蛋白的制备方法，所述制备方法包括在表达可检测量的所述蛋白的条件下转录和翻译本发明所提供的上述多核苷酸。优选地，该制备方法包括1)构建所述具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白的多核苷酸序列；2)构建包含步骤1)所构建的多核苷酸序列的表达载体；3)将步骤2)构建的表达载体用于转化宿主细胞，并使所述多核苷酸序列在宿主细胞中表达；4)纯化步骤3)中得到的蛋白。其中，步骤2)的表达载体优选为pPIC9K-CardiaC Salvation ；并且优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；进一步优选地，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。又一方面，本发明提供上述蛋白在制备用于治疗心肌细胞坏死引起的心脏疾病药物中的用途；优选地，所述心脏疾病包括心肌病、心肌梗死和心力衰竭。本发明的详细描述如下本发明提供了编码一种新的具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白Cardiac&ilvation 的多核苷酸序列，全长为375bp (含起始密码子和终止密码子)，该多核苷酸的具体序列见 SEQ ID NO :2。所述多核苷酸编码了一个由123个氨基酸组成的蛋白(SEQ ID N0:1)，该蛋白容易穿过细胞膜，进入靶器官的细胞内发挥生物学作用。根据本发明的一个具体实施方式
，本发明构建了 Cardiac Salvation的真核表达载体，并且对核苷酸序列进行了一些改造，以提高在真核系统中的表达量以及表达产物的活性。本发明中采用高表达效率的毕赤酵母真核表达系统表达该蛋白，作用于经hsL处理的原代大鼠心肌细胞和结扎心脏冠状动脉后前降支的心肌梗死大鼠模型，检测了该种新蛋白在细胞模型中和动物模型中的抗心肌细胞凋亡的效果。根据本发明的一个具体实施方式
，本发明可通过如下的技术方案得以实现1、真核表达载体 pPIC9K-Cardiac &ilvation 的构建将编码Cardiac Salvation的多核苷酸序列克隆入pPIC9K，同时在蛋白的N 端连上六聚组氨酸标签(His Tag)以及肠激酶酶切位点，得到如图1所示的重组质粒 pPIC9K-Cardiac Mlvation。将重组载体转化进入大肠杆菌DH5 α进行扩增，酶切线性化之后，使用电转化的方法将线性化的pPIC9K-Cardiac&ilvati0n转入巴斯德毕赤酵母GS115， 使用组氨酸缺陷平板RDB筛选出成功参入外源基因的酵母，然后使用G418平板复筛，选出多拷贝重组子，并进行PCR验证。挑取阳性克隆扩增后使用甲醇诱导表达，取上清浓缩，以抗组氨酸标签的抗体进行Western Blot，验证重组蛋白的表达。将验证得到的三株菌株进行摇瓶表达。选用载量较大的M-IDA作为填料，进行镍离子螯合亲和层析，利用组氨酸蛋白标签与金属离子的相互作用，分离重组蛋白。发酵液经过离心、超滤，在蛋白纯化系统上经镍离子螯合亲和层析分离纯化，收集重组蛋白，用 Western Blot验证蛋白表达。将收集到的重组蛋白经过脱盐柱脱盐，使用重组肠激酶进行酶切消化去除Cardiac&ilvation的His标签，后经镍离子螯合亲和层析去除重组肠激酶， 流出液中即为目的蛋白，使用真空冷冻干燥仪去除蛋白收集液中的水分，最终获得重组蛋白冻干粉末。本发明提供的制备方法采用目前表达效率最高的毕赤酵母真核表达系统，有利于 Cardiac &ilvation蛋白的规模化生产。根据本发明的另一个具体实施方式
，对本发明的Cardiac Salvation蛋白进行了下述生物活性测定1、Cardiac Salvation蛋白在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能将!^asL和Cardiac Salvation蛋白共同处理原代培养大鼠心肌细胞，结果如图2 所示，表明Cardiac Salvation蛋白可以阻断!^asL造成的TUNEL阳性细胞增多；同时Cell Death ELISA实验也证实Cardiac Salvation蛋白能阻断!^asL所致的核小体DNA断裂(图 2B)。2、Cardiac Salvation蛋白在动物模型中的抗心肌细胞凋亡功能将Cardiac Salvation蛋白经静脉注射入大鼠，立即结扎心脏冠状动脉后前降支， 造成心肌梗死模型。三天后取出心脏进行凋亡检测，发现注射Cardiac&ilvation蛋白大鼠的心脏的TUNEL阳性细胞数目明显少于不注射的对照组(图3)。以上所示的实验结果表明，Cardiac Salvation蛋白在细胞模型中和动物模型中均具有明显的抗心肌细胞凋亡效果。本发明提供了一段新的多肽(命名为Cardiac Salvation)，在细胞模型和动物模型中的实验均表明其具有明显的抗心肌细胞凋亡功能。并且，可以采用高表达效率的毕赤酵母真核表达系统大量表达本发明的Cardiac Salvation蛋白并将其分离纯化，从而将纯化的蛋白改造成药物分子，用于制备治疗心肌细胞坏死相关的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心脏疾病的生物技术蛋白药物。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为本发明的重组质粒pPIC9K_Cardiac Salvation的结构示意图；图2为Cardiac Salvation蛋白在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能；其中，2A TUNEL法检测细胞凋亡(R&D Systems) ；2B =Cell Death ELISA检测细胞凋亡;图3为Cardiac Salvation蛋白在动物模型中的抗心肌细胞凋亡功能；其中，3A 冠状动脉结扎手术20天后测量心肌梗死面积；3B 冠状动脉结扎手术2天后Cell Death ELISA检测心肌细胞凋亡。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。本发明所用的真核表达质粒pPIC9K和宿主菌毕赤酵母GSl 15购自invitrogen公司；限制性内切酶购自NEB公司；dNTP购自北京天根生物工程公司。引物的合成和核苷酸序列测序均由北京博尚公司完成。纯化用的镍柱购自GE公司。实施例1 构津真核表汰质粒oPIC9K-Cardiac Salvation和工程菌毕赤酵母 GS1151、真核表达质粒 pPIC9K_Cardiac Salvation 的构建采用全基因合成方法获得基因序列SEQ. ID. NO :2，在该基因两侧加入酶切位点 SnabI和AvrII后，采用本领域常规技术，将得到的序列与质粒pPIC9K构建得到重组质粒 pPIC9K-Cardiac Salvation0将该重组载体转化进入大肠杆菌DH5 α (购自天根生化科技有限公司)进行扩增，分别使用SacI、Sail以及BglII进行酶切，经过乙醇沉淀，ddH20溶解，得到浓度为5ug/ul的线性化质粒。2、工程菌毕赤酵母GS115的制备选择巴斯德毕赤酵母中的GS115，使用电转化的方法将外源基因转入GS115中，使用组氨酸缺陷平板RDB初筛后，使用G418平板复筛。电转化步骤具体如下在含5mlYPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，30°C过夜。取0. 1-0. 5ml过夜培养物，接种含500ml新鲜培养基的2L摇瓶，过夜生长至0D600为1. 3-1. 5。4°C,1500g离心 5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。之后再离心，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞。离心后，用20ml预冷的IM山梨醇悬浮细胞。离心，用Iml预冷的IM山梨醇悬浮细胞，至终体积约1. 5ml。取80 μ 1上述细胞与20 μ g线性化DNA混合，转入预冷的0. 2cm 电转杯中，冰浴5min。使用Bio-Rad Gene Pulser进行电转，设置参数为电压1.5kV，电容 25 μ F，电阻200 Ω，电击时长10ms。按照所述参数电击两次。立即加入Iml预冷的IM山梨醇至杯中，然后转移至灭菌离心管中。分成200-600 μ 1等份，涂于RDB平板上。30°C培养， 约3-5天后克隆产生。将RDB平板上长出的重组子刮下重新悬浮，涂布于浓度为0. 75mg/ ml, 1. 5mg/ml和％ig/ml的G418平板。30°C培养，约2_5天后克隆产生。挑取G418平板中的酵母菌落，混勻在10 μ 1的无菌蒸馏水中，取1 μ 1进行菌落PCR。使用Α0Χ13’和5’端的引物检验目的基因在酵母菌落中的插入情况。McI和MlI线性化的质粒转化GS115后， 只产生表型为His+Mut+的菌株，而BglII线性化的质粒转化后可以产生表型为His+Mut+和 His+Muts的菌株，具有His+Muts表型的菌株。实施例2 =Cardiac Salvation蛋白的诱导表达选取上一步中条带明显的HiS+Mut+表型的酵母菌，使用BMMY培养基30°C摇床培养 3-4天，每M小时补加甲醇，使其浓度保持在左右。分离上清，浓缩后用Western Blot 验证表达情况。实施例3 =Cardiac &ilvation蛋白的分离纯化选取Western Blot验证结果为阳性的菌株，在500ml的 BufferedMethanol-complex Medium(BMMY)中诱导毕赤酵母表达重组蛋白，离心收集上清， 调pH到7. 9并使用0. 45 μ m的滤膜过滤。过柱的时候用缓冲液1 (IOmM pH7. 9含0. 25M NaCl的Tris-HCl缓冲液)平衡10个床体积，控制流速为lml/min。将过滤好的毕赤酵母培养基上样，流速为lml/min，用缓冲液1再洗10个柱床体积，流速为lml/min，用含IOOmM 咪唑的缓冲液3 (10mMpH7. 9的Tris-HCl缓冲液含0. 25M NaCl以及300mM咪唑)进行阶段洗脱，流速为anl/min，收集洗脱峰，洗脱5个柱床体积。将收集到的蛋白溶液使用真空离心干燥机(型号LNG-L96，厂商太仓华利达实验室设备公司)进行浓缩。将浓缩后的蛋白样品溶液采用接有GE的脱盐柱的AKTA蛋白纯化仪(型号=AKTApurifier 10，厂商GE) 进行脱盐，收集蛋白峰，并使用离心冻干浓缩仪进行浓缩。实施例4 =Cardiac Salvation蛋白的生物活性鉴定1、Cardiac Salvation蛋白在细胞模型中的抗心肌细胞凋亡功能以200ng/ml FasL处理分别经Cardiac Salvation蛋白处理过的大鼠原代培养心肌细胞(购买Wistar成年大鼠，处死后直接取心脏，经过一系列处理后做成原代培养细胞，详细步骤参照“Signaling Pathways in Reactive OxygenSpecies-Induced Cardiomyocyte Apoptosis，，，Riidiger von Harsdorf, Pei-Feng Li 禾口 Rainer Dietz, Circulation 1999 ；99 ；2934-2941) !^asL处理M小时后收集心肌细胞进行实验分析。 TUNEL法检测细胞凋亡，按照TUNEL检测试剂盒(R&D Systems)说明进行。统计50个视野下共400个细胞。结果如图2所示，表明Cardiac Salvation蛋白可以阻断!^sL造成的 TUNEL阳性细胞增多(图2A)。Cell Death ELISA检测细胞凋亡，按照Cell Death ELISA 检测试剂盒(Roche)说明进行。在405nm波长处用多功能酶标仪(型号Synergy 〗，厂商 BioTek)测光密度值，数据以倍增的方式表达。图中的数据是4次独立实验的平均值Γρ < 0. 05vs FasL.)。数据证实Cardiac Salvation蛋白能阻断!^asL所致的核小体DNA断裂 (图 2 。2、Cardiac Salvation蛋白在动物模型中的抗心肌细胞凋亡功能雄性韦氏大鼠Q50-300g)(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)随机分组，每组8只。实验大鼠经静脉注射Cardiac Salvation蛋白(1. 0 μ M/kg体重)，立即结扎心脏冠状动脉后前降支，造成心肌梗死模型。假手术组处理方法类似，只是冠状动脉不结扎。冠状动脉结扎手术20天后测量心肌梗死面积，注射Cardiac Salvation蛋白大鼠的心脏梗死面积小于不注射Cardiac Salvation蛋白的对照组大鼠心脏(图3A)。冠状
7动脉结扎手术2天后Cell Death ELISA检测心肌细胞凋亡，按照Cell Death ELISA检测试剂盒(Roche)说明进行。在405nm波长处用ELISA检测仪测光密度值，数据以倍增的方式表达(图:3B)。图3A和;3B中的数据是4次独立实验的平均值Cp < 0. 05vs saline广ρ <0. 05vs CardiacSalvation)，数据表明，Cardiac Salvation蛋白在动物模型中有对抗心肌细胞凋亡的功能。 以上实验结果表明，Cardiac Salvation蛋白分子在细胞模型中和动物模型中都具有显著的抗心肌细胞凋亡的作用。因此，可用其制备用于治疗由心肌细胞坏死所引起的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心脏疾病的生物技术蛋白药物。
权利要求
1.一种具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白，其特征在于，所述蛋白为包含SEQ. ID.N0 :1 所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、变体或衍生物。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白为SEQ.ID. NO 1所示氨基酸序列的多肽。
3.编码如权利要求1或2所述蛋白的多核苷酸。
4.与如权利要求3所述多核苷酸互补的多核苷酸。
5.一种编码具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列；优选地，所述多核苷酸为SEQ. ID. NO 2所示的多核苷酸序列。
6.包含如权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸的重组载体；优选地，所述重组载体为pPIC9K_Cardiac Salvation0
7.包含如权利要求6所述的重组载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；进一步优选地，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115。
8.—种如权利要求1或2所述的蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括在表达可检测量的所述蛋白的条件下转录和翻译权利要求3-5中任一项所述的多核苷酸。
9.一种如权利要求1或2所述蛋白的制备方法，该制备方法包括1)构建根据权利要求1至4中任一项所述蛋白的多核苷酸序列；2)构建包含步骤1)所构建的多核苷酸序列的表达载体；3)将步骤2)构建的表达载体用于转化宿主细胞，并使所述多核苷酸序列在宿主细胞中表达；4)纯化步骤3)中得到的蛋白。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中步骤幻的表达载体为 pPIC9K_Cardiac Salvation ；优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母；进一步优选地，所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GSl 15。
11.如权利要求1或2所述的蛋白在制备用于治疗心肌细胞坏死引起的心脏疾病药物中的用途；优选地，所述心脏疾病包括心肌病、心肌梗死和心力衰竭。
全文摘要
本发明提供一种具有抗心肌细胞凋亡功能的蛋白，所述蛋白为包含SEQ.ID.NO1所示氨基酸序列的多肽、其生物活性功能片段、变体或衍生物。该蛋白由123个氨基酸组成，分子量为13.53KD，容易穿过细胞膜，进入靶器官的细胞内发挥生物学作用，因此可将其制备成治疗心肌细胞坏死相关的心肌病、心肌梗死和心力衰竭等心脏疾病的生物技术蛋白药物。
文档编号A61K38/16GK102363628SQ201110025369
公开日2012年2月29日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者周露玙, 李倩, 李培峰 申请人:中国科学院动物研究所