专利名称：槲皮素及其组合物在制备抗缺氧药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明 涉及医药领域，尤其涉及槲皮素、含有槲皮素的组合物及其在制备抗缺氧药物中的应用。
背景技术：
氧气是人体生命的第一要素。人不吃饭可以生存几周，不喝水可以存活几天，但没有氧气时几分钟后就会死亡。在人体所有的组织器官中，大脑、心脏和肺等器官需要的氧气最多，对氧气的供应最为敏感。当空气中氧气含量下降到15-19%时，会感觉不适，头痛无力，工作效率下降；如果持续6-12个月，会出现慢性疲劳综合症、性功能障碍或亚健康；如果持续10-20年，可能会患上癌症。当空气中氧气含量下降到12-15%时，会造成呼吸加快， 心跳加速，判断力下降，可能出现肺水肿或脑水肿；如果持续6-12个月，可能出现红细胞增多、高血压和心脏病，这就是部分高原游客和少数高原居民患上的所谓“高原病”。海拔每上升约1000米，空气含氧量将减少10%，在海拔3000-4000米以上，空气含氧量会下降到15% 以下，如青藏高原。当空气中氧气含量下降到10-12%时，会眼花缭乱，嘴唇发紫，动作失灵。 当空气中氧气含量下降到8-10%时，会脸色苍白，失去知觉。当空气中氧气含量下降到4-8% 时，人类将会在5分钟内死亡。由此可见氧气对人类的重要性不可忽视。我国1/2的国土面积位于西部，自然环境相对恶劣，高原低氧等自然因素严重影响了此地人群的居住、生存，但西部地区资源丰富、开发与发展的潜力巨大。为推动经济社会的全面、协调、可持续发展，党中央、国务院提出了“西部大开发”的战略任务。高原地区经济建设的带动作用必将引起这些地区前所未有的人员流动，更需要有效的医学防护。另夕卜，我国边陲要地大部分位于恶劣自然环境地区，且多为少数民族聚集地。因此，能否有效的管理与开发利用恶劣自然环境地区，除了经济、社会意义外，还有着深层次的政治与国防安全的意义。为了达到“拓展生命空间、开发西部资源、保障国家安全、促进整体发展”的目的，势必需要大量人员进入此类地区生活、工作，因此开展高原缺氧环境因素损伤防护的研究日益重要。目前，临床上使用的抗缺氧药物包括(1)生物制剂脑复素、细胞色素丙等；(2) 化学制剂吡拉西坦、尼莫地平和氟苯桂嗪等；(3)中药制剂红景天、刺五加和葛根素等。 近年来，随着人们对中药有效成分和药理作用的深入研究，发现中药及其提取物的抗缺氧作用具有效果持久稳定以及毒副作用小等特点。而且，由于中药治疗具有整体性和综合性的优势，目前被广泛的认为其在提高机体耐缺氧方面具有广阔的应用前景。PC12缺氧损伤模型可用于检测药物抗缺氧能力的强弱，其筛选原理如下，PC12为嗜铬细胞瘤细胞克隆，于1975年经辐射大鼠肾上腺髓质瘤中移植出一种肿瘤细胞，并经过连续单层培养而获得的细胞株。研究发现，缺氧培养PC12细胞株可导致细胞大量死亡，主要表现为凋亡。根据细胞凋亡的数目可以检测药物抗缺氧能力的强弱。此外，机体在遭受缺氧损伤时将产生大量的自由基，过量的自由基可导致核酸碱基缺失，氢键破坏，蛋白质交联，多肽链断裂，发生脂质过氧化，生成丙二醛(MDA)，同时可形成大分子的脂褐素在溶酶体中沉积，导致细胞功能严重受损。因此，自由基的清除也是有机体提高耐缺氧能力的一个重要途径。大多数自由基化学性质极为活泼，寿命极短，但也有少数自由基的化学性质十分稳定，如1，1- 二苯基-2-苦味酰基自由基 (1，l-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH ·)。DPPH自由基是一种相对稳定的自由基，其稳定性主要来自共振稳定作用及三个苯环的空间障碍，使其夹在中间氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。DPPH的乙醇溶液在517nm处有强的吸光值，呈紫色。当 DPPH自由基被抗氧化剂还原或与另一个自由基结合时，吸光值会降低或消失，故可利用此特性来测试样品提供质子清除自由基的功效。1958年Blos将其应用于抗氧化剂的筛选研允。
发明内容
本发明一方面提供了槲皮素作为制备抗缺氧药物的应用。本发明另一方面提供了一种组合物，含有药学有效量槲皮素以及药学上可以接受的辅料。所述辅料可以是药学上适用的赋形剂和添加剂，如无毒性的可配伍的填充剂、粘合齐U、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂等。槲皮素可以用一般的剂型给药，优选口服剂型，如片剂或胶囊剂。本发明还提供了上述含有槲皮素的组合物在制备抗缺氧药物中的应用。上述组合物中还可以加入绿原酸和/或原儿茶酸。上述组合物可以是槲皮素与绿原酸的组合，槲皮素与原儿茶酸的组合，还可以是槲皮素与绿原酸和原儿茶酸三种成分的组合物。在上述组合物中，槲皮素的重量百分含量为409Γ90%，优选509Γ90%。上述组合物可以与药学上可以接受的辅料混合，所述辅料可以是药学上适用的赋形剂和添加剂，如无毒性的可配伍的填充齐 、粘合剂、崩解剂、缓冲齐 、防腐齐 、抗氧化剂、润滑齐 、矫味剂、增稠剂、 着色剂、乳化剂等。上述组合物可以用一般的剂型给药，优选口服剂型，如片剂或胶囊剂。本发明还提供了上述含有槲皮素、绿原酸和/或原儿茶酸的组合物在制备抗缺氧药物中的应用。本发明采用小鼠密闭性缺氧损伤体内模型进行体内抗缺氧活性测试，并同时采用 PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆化细胞株)缺氧损伤体外模型以及DPPH自由基清除的体外抗氧化活性评价方法对槲皮素及本发明组合物中的活性组分进行了抗缺氧活性测试和DPPH自由基清除能力的考察，均显示了较好的活性。在体内抗缺氧活性测试中，本发明进一步给出了槲皮素对小鼠的有效 剂量范围为 0. 5g/kg体重 lg/kg体重。根据药理实验中小鼠与人之间的药物剂量换算，进一步给出了槲皮素的给药剂量范围为50mg/kg体重 100mg/kg。本发明中槲皮素以及含有槲皮素的组合物在抗缺氧方面的活性可以广泛的应用于开发和制备更为有效、低毒的抗缺氧天然药物，具有广阔的应用前景。
图1是槲皮素等成分对小鼠常压耐缺氧模型的测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。 一、主要化学成分抗缺氧活性的体内测定 1、实验材料
槲皮素、槲皮苷、原儿茶酸、绿原酸、黄芩苷由中国药品生物制品检定所提供；红景天胶囊为三普药业股份有限公司生产，0. 5g/粒，每IOOg相当于0. 4g红景天甙；羧甲基纤维素钠，F20050429，国药集团化学试剂有限公司；钠石灰，20050701-1，广州化学试剂厂。NIH小鼠，18-20g，雄性，由广东省医学实验动物中心提供；可密闭的250mL磨口广口瓶；秒表；架
盘天平。2、实验模型
实验选用体重为18士2g的健康雄性小白鼠，随机分为对照和药物各组，动物于缺氧前 3小时分别胃内灌注药物(20mg/0. 5mL，相当于lg/kg体重)，对照组胃内灌注或腹腔注射等量生理盐水或20% 二甲基亚砜(DMSO)稀释液0. 5 mL，然后将各组小鼠分别放入150 mL 三角烧瓶中，同时将瓶口用橡皮塞盖紧，在此密闭缺氧条件下观察小鼠的存活时间。3、实验方法
取18-20g的健康雄性小白鼠72只，随机分为8组，每组9只。第1组为正常对照组，灌胃给予0. 5%羧甲基纤维素钠20mL/kg ；第2、3组分别为槲皮素低剂量(10mg/0. 4mL，相当于 0. 5g/kg体重)、槲皮素高剂量(20mg/0. 4mL，相当于lg/kg体重)给药组；第4_7组分别为绿原酸、槲皮苷、原儿茶酸、黄芩苷给药组，给药量20mg/0. 4mL，相当于lg/kg体重；第8组为红景天胶囊给药组，胶囊内容物每IOOg中含红景天甙0. 4g，配成25%的溶液后红景天甙浓度为lmg/mL，给药量0. 4mg/0. 4mL,相当于20mg/kg体重。给药3小时后将小鼠分别放入250 mL的磨口广口瓶内，密封(瓶内放钠石灰5g，用以吸收二氧化碳和水，广口瓶用前均盛水校正容量，瓶口涂以凡士林油，以防漏气)，以最后一次呼吸为指标，观察小鼠的存活时间，所
有数据均以均数士标准差((χ
士s)表示，采用SPSS 13. 0统计软件，以多组间方差分析及组间t检验作统计学处理，ρ < 0. 05为差异具有统计学意义。4、实验结果
实验结果如图1所示，图1中组别标号为1至8组分别为对照组、槲皮素低剂量组、槲皮素高剂量组、绿原酸组、原儿茶酸组、槲皮苷组、黄芩苷组以及红景天组。由图1可见，两个阳性对照组黄芩苷组和红景天组的小鼠的存活时间(min)分别为 63. 70士8. 80,59. 33士8. 67，与对照组(47. 73士6. 27)比较，有显著差异(P < 0. 05)。 槲皮素低剂量、槲皮素高剂量、绿原酸、原儿茶酸组的小鼠的存活时间(min)分别为 68. 85士8. 07、68. 55士 10. 15、62. 49士6. 38、56. 68士7. 80，与对照组(47. 73士6. 27)比较，有显著差异(P < 0. 05)，与阳性对照组比较，差异不显著(P > 0. 05)。而槲皮苷组 (53. 98士4. 23)小鼠存活时间也有延长，但和对照组比较差异不显著(P > 0. 05)。上述实验结果说明，槲皮素、绿原酸和原儿茶酸均能提高密闭缺氧条件下小鼠的存活时间，具有较强的体内抗缺氧活性。活性效果和黄芩苷、红景天胶囊阳性对照组的活性相当。二、槲皮素及其组合物中主要化学成分对PC12细胞缺氧损伤的保护作用1、实验方法 取传5代以上PC12细胞，经胰蛋白酶消化分散后，制成2 X IO5个细胞/mL密度的细胞悬液，接种于涂有小牛皮胶的35 mm塑料培养皿中，每皿2mL，置于36 °C、含10% CO2的培养箱内进行培养。培养液由85% DMEM、5%胎牛马血清、10%马血清、谷氨酰胺0.10 g/L组成。取培养8天的各组PC12细胞，按实验分为对照组(H20、Me0H、DMS0)和药物各组(药物浓度分别为100 yg/mL,50 yg/mL和25 μ g/mL)。在缺氧处理前24 h分别加入不同药物。然后将细胞移置恒温(36 0C )密闭缺氧容器内，连续充以含90% N2和10% CO2的无氧气体，在缺氧条件下继续培养12 h后取出，并用4%台盼蓝染色，在倒置相差显微镜(400X) 下每皿按Z字顺序计数相邻视野中蓝染(死神经元)和未蓝染(存活神经元)的细胞数，计算神经元细胞存活百分率。实验重复2次。先后以25 μ g/mL,50 μ g/mLU00 μ g/mL浓度的实验A组和 50 μ g/mLUOO μ g/ mL、200 μ g/mL浓度的实验B组对化合物进行活性测试。在A组中，以DMSO等溶剂作阴性对照。在B组中，以黄芩苷作阳性对照，将各化合物的细胞存活率减去阳性对照的细胞存活率，然后将其结果与阳性对照的细胞存活率相除，从而得到相对存活率。2、实验结果见表1和表2所示。表1、槲皮素:槲皮苷的抗缺氧活性α组)、\±SD, n=20)_
权利要求
1.槲皮素在制备抗缺氧药物中的应用。
2.如权利要求1所述的槲皮素在制备抗缺氧药物中的应用，其特征在于，所述槲皮素剂量为50mg/kg体重 100mg/kg体重。
3.一种组合物，其特征在于，包括药学有效量的槲皮素以及药学上可以接受的辅料。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物可以制成片剂或胶囊剂。
5.权利要求3所述的组合物在制备抗缺氧药物中的应用。
6.如权利要求5所述的组合物在制备抗缺氧药物中的应用，其特征在于，所述槲皮素剂量为50mg/kg体重 100mg/kg体重。
7.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括药学有效量的绿原酸和/或原儿茶酸。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述槲皮素的重量百分含量为409Γ90%。
9.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物可以制成片剂或胶囊剂。
10.权利要求7所述的组合物在制备抗缺氧药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了槲皮素在制备抗缺氧药物中的应用。本发明还提供了一种组合物，包括药学有效量的槲皮素以及药学上可以接受的辅料。所述组合物还包括药学有效量的绿原酸和/或原儿茶酸。本发明中槲皮素以及含有槲皮素的组合物在抗缺氧方面的活性可以广泛的应用于开发和制备更为有效、低毒的抗缺氧天然药物，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K31/192GK102178675SQ20111007678
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月29日 优先权日2011年3月29日
发明者刘尧, 姚新生, 曹苹, 李军, 毛羽, 王乃利, 王平, 王晓炜, 郑俊霞, 鲁艺 申请人:深圳市药品检验所