专利名称：一种双歧杆菌微胶囊及其制备方法
技术领域：
本发明属于益生菌制品制备技术领域，具体涉及一种双歧杆菌微胶囊及其制备方法。
背景技术：
双歧杆菌是人和动物肠道内重要的益生菌，具有调节肠道菌群平衡、提供营养、降低胆固醇和抗癌等特性。然而它专性厌氧，对氧气、PH、温度、湿度等外界不良环境极为敏感，在生产、贮存和运输过程中很难保持活性；而且干菌粉经口服食用时，无法耐受低pH值的胃酸、胆盐等环境，难以保证有大量的存活菌到达肠道而定殖于肠粘膜上。
发明内容
本发明的目的是提供一种能有效延长双歧杆菌保藏期的双歧杆菌微胶囊及其制备方法，解决了液体双歧杆菌制剂中活菌含量大幅度下降及不耐胃酸的问题。本发明所采用的技术方案是；
一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g胶原蛋白、11. 50 g糖类物质和 4.65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 (3-5)，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；
步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥。所述的步骤二中，胶原蛋白为动物源胶原蛋白或类人胶原蛋白； 所述的步骤二中，糖类物质为海藻糖或蔗糖。所述的步骤五中，乳化的搅拌速度为300-500 rpm/min,乳化时间为5_15分钟， CaCl2溶液的加入速度为20 mL/s。所述的步骤六中，离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；
所述的步骤六中，真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在-50°C、真空度为50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。所述的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g类人胶原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为1. 5%的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 4，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；乳化的搅拌速度为400 rpm/min,乳化时间为10分钟，CaCl2溶液的加入速度为20 mL/s ；
步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。如所述的一种双歧杆菌微胶囊。本发明具有以下优点
本发明的双歧杆菌微胶囊具有耐胃酸性、耐胆盐性和肠溶性的优点，菌体的存活率高， 制备方法简单，实用性强，便于工业化大生产；微胶囊的贮藏稳定性良好，解决了益生菌制剂保藏期短的问题。
图1为双歧杆菌微胶囊人工胃液的耐受性测试结果。图2为菌粉人工胆盐的耐受性测试结果。图3为双歧杆菌微胶囊人工胆盐的耐受性测试结果。图4为双歧杆菌微胶囊人工肠液的肠溶性测试结果。图5为常温下贮藏一年对双歧杆菌微胶囊活菌数的影响结果。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细的说明。真空冷冻干燥技术是制备高效活性制剂的重要方法之一。该过程中，保护剂的添加可以改变冻干过程中样品的物化性质，为菌体提供一个骨架结构，保持菌体原有的生化特征和生物活性。甘油、蔗糖、海藻糖和L-半胱氨酸已经被证实可以用来提高益生菌的存活率。胶原蛋白作为一种新型蛋白，具有良好的生物相容性，而且经基因工程改性过的胶原蛋白具有良好的水溶性特性，不但能为冻干粉末提供一种多孔结构，而且能使溶液呈过冷状态，即在零度以下的相同温度下溶质的浓度减小，蛋白质的盐析变性减少，相比大豆蛋白更具优势。本发明所涉及的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，由以下步骤实现
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g动物源胶原蛋白或类人胶原蛋白、11. 50 g海藻糖或蔗糖、以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 (3-5)，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；乳化的搅拌速度为300-500 rpm/min，乳化时间为5_15分钟，CaCl2溶液的加入速度为 20 mL/s ；
步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为_20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12 小时。在上述条件下，粒径分布在100-500 μ m的微胶囊的百分含量为78. 3%，且平均粒径为402. 834 μ m。通过扫描电镜观察，微胶囊的形态基本呈球形，表面结构均勻完整，没有破损、孔洞和裂缝现象。以下为本发明所涉及的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法的具体实施例 实施例一
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g动物源胶原蛋白、11. 50 g海藻糖、以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为1%的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 3，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；乳化的搅拌速度为300 rpm/min,乳化时间为5分钟，CaCl2溶液的加入速度为20 mL/ s ；步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。实施例二
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g类人胶原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为1. 5%的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 4，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；乳化的搅拌速度为400 rpm/min,乳化时间为10分钟，CaCl2溶液的加入速度为20 mL/s ；
步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。实施例三
步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；
步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g类人胶原蛋白、11. 50 g蔗糖、 以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；
步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；
步骤四向质量分数为m的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 5，混合均勻后得到菌胶混合液；
步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；乳化的搅拌速度为500rpm/min，乳化时间为10分钟，CaCl2溶液的加入速度为20 mL/ s ；
步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为_20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。以下为双歧杆菌微胶囊的功能特性实验 1、耐胃酸性
将1 g微胶囊置于9 mL的人工胃液中，人工胃液PH值为2.0，37°C厌氧处理，分别于 0,0. 5、1、2、3小时后收集微胶囊，并进行活菌计数，分析微胶囊对人工胃液的耐受情况，同时以未经包埋的冻干菌粉进行对照。实验结果表明，菌粉和微胶囊在pH 6. 5的条件下处理 3 h后，活菌含量基本不变。然而，当处于pH 2.0的人工胃液中时，活菌含量逐渐降低，而且随着处理时间的延长，菌粉中的活菌数要比微胶囊下降的多。分析其原因可能是菌粉中的双歧杆菌直接暴露于胃液环境中，遭受胃酸的破坏而死亡；海藻酸钠微胶囊在胃液中很难溶解，可以减少菌体的释放量，而且菌体周围的凝胶体系能够为细胞提供一个强有力的屏障，增大胃酸的穿透阻力，达到保护细胞的目的。之所以开始时间段内，活菌含量有所下降，是由于少量没有被包裹完全的微胶囊发生渗漏或者微胶囊表面附着有游离菌体的缘故。由此可见，制得的双歧杆菌微胶囊在人工胃液中性质较稳定，可以较好的保护菌体免受胃酸的伤害，可以以较高的活性状态到达肠道顺利定殖。结果见图1。2、耐胆盐性 分别配制质量分数为0%、1%和洲的胆盐溶液模拟人工胆盐，将1 g微胶囊置于9 mL
不同浓度的胆盐溶液中，37°C厌氧处理3小时和12小时后收集微胶囊，并进行活菌计数， 分析微胶囊对人工胆盐的耐受情况，同时以未经包埋的冻干菌粉进行对照。实验结果表明， 当胆盐浓度为1%时，处理12 h后，微胶囊中的活菌数为3. 16 X IO8 cfu/ml，明显高于菌粉的活菌数1.52 X IO7 cfu/ml，其结论与洲的胆盐条件相同。可见，双歧杆菌经微胶囊化后，可以提高菌体对高浓度胆盐的耐受程度。结果见图2和图3。3、肠溶性
将1 g微胶囊置于9 mL的人工肠液中，人工肠液的pH值为6.8，37°C厌氧处理，崩解破碎后稀释，并进行活菌计数，分析微胶囊在人工肠液中的肠溶情况。实验结果表明，微胶囊在人工肠液中处理15分钟后开始迅速释放菌体，30分钟后基本保持不变，释放率可达 80. 5%，而且经人工观察，30分钟后已无固体颗粒存在，可断定该微胶囊在人工肠液中已基本崩解完全，该法制得的微胶囊具有较好的肠溶性，能够使双歧杆菌从海藻酸钠体系中释放出来，从而发挥益生功能。结果见图4。4、常温贮藏特性
将双歧杆菌菌液、冻干菌粉和微胶囊在恒温37°C、相对湿度为60-65%的条件下储存3 个月，不同时间段内取样，研究菌体在此过程中的存活情况。实验结果表明，菌液中的双歧杆菌在贮存30天后就已全部死亡，可看出没有经过任何处理的双歧杆菌菌液常温下难以储存，这也证实了液体制剂中的活菌含量在储藏过程中会大幅度下降这一现象。对于冻干菌粉而言，由于添加了各类保护剂，使得活菌含量比菌液下降的慢，当37°C储存25天后活菌含量基本无法满足市售商品的最低标准。相比之下，冻干的微胶囊储存90天后，活菌含量虽然下降了 3个数量级，但活菌数仍然大于IO6 cfu/g，为1.12 X IO7 cfu/g，高于肠道中定殖的最小浓度。由此可见，本实验制得的微胶囊能够在常温条件下储存一年以上。结果见图5。
权利要求
1.一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g胶原蛋白、11. 50 g糖类物质和 4.65 mL甘油，其余为蒸馏水；步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；步骤四向质量分数为的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 (3-5)，混合均勻后得到菌胶混合液；步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30 分钟；步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥。
2.根据权利要求1所述的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 所述的步骤二中，胶原蛋白为动物源胶原蛋白或类人胶原蛋白；所述的步骤二中，糖类物质为海藻糖或蔗糖。
3.根据权利要求2所述的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于所述的步骤五中，乳化的搅拌速度为300-500 rpm/min，乳化时间为5_15分钟，CaCl2 溶液的加入速度为20 mL/s。
4.根据权利要求3所述的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 所述的步骤六中，离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；所述的步骤六中，真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在-50°C、真空度为 50-100毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。
5.根据权利要求4所述的一种双歧杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现步骤一在37°C的温度条件下，将活化的双歧杆菌在液体培养基中厌氧培养M小时， 离心收集菌体，用0. 85%的生理盐水洗涤制备菌悬液；步骤二制备保护剂，每1000 mL保护剂添加有1.23 g类人胶原蛋白、11. 50 g海藻糖、 以及4. 65 mL甘油，其余为蒸馏水；步骤三将经过灭菌处理的保护剂与菌悬液按2:1的体积比混合均勻，静置30分钟， 在-20°C的温度条件下预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥48小时，制备得到冻干菌粉；步骤四向质量分数为1. 5%的海藻酸钠溶液中加入0. 1 g冻干菌粉，冻干菌粉与海藻酸钠质量比为1 4，混合均勻后得到菌胶混合液；步骤五将菌胶混合液逐滴加入到含有0. 2%的吐温-80的大豆油中，菌胶混合液与大豆油的体积比为1 5，乳化并快速加入到摩尔浓度为0.1 mol/L的氯化钙溶液中，静置30分钟；乳化的搅拌速度为400 rpm/min，乳化时间为10分钟，CaCl2溶液的加入速度为20 mL/s ；步骤六离心收集微胶囊，用质量分数为0. 85%的生理盐水洗涤，将制备好的微胶囊置于真空冷冻干燥箱中干燥；离心收集微胶囊的条件为350 g，10分钟，4°C ；真空冷冻干燥的条件为-20°C预冻2小时，然后在_50°C、真空度为75毫托的真空冷冻干燥箱中干燥12小时。
6.如权利要求1所述的一种双歧杆菌微胶囊。
全文摘要
本发明具体涉及一种双歧杆菌微胶囊及其制备方法。双歧杆菌专性厌氧，对氧气、pH、温度、湿度等外界不良环境极为敏感，在生产、贮存和运输过程中很难保持活性；而且干菌粉经口服食用时，无法耐受低pH值的胃酸、胆盐等环境，难以保证有大量的存活菌到达肠道而定殖于肠粘膜上。本发明将双歧杆菌冻干菌粉加入到海藻酸钠溶液中后混入大豆油中，乳化静置、离心收集微胶囊，采用真空冷冻干燥技术进行干燥。本发明的双歧杆菌微胶囊具有耐胃酸性、耐胆盐性和肠溶性的优点，菌体的存活率高，制备方法简单，实用性强，便于工业化大生产；微胶囊的贮藏稳定性良好，解决了益生菌制剂保藏期短的问题。
文档编号A61K9/50GK102210659SQ20111014741
公开日2011年10月12日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者严建亚, 朱晓丽, 段志广, 范代娣, 马晓轩 申请人:陕西巨子生物技术有限公司