专利名称：α1,3半乳糖基转移酶基因转染材料及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及ー种作用于肿瘤新生血管内皮细胞的α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，及其制备方法和应用。
背景技术：
在我国，肿瘤发病率高，病例数相当庞大。一直以来，人们都为攻克肿瘤而不懈努力，并提出了多种治疗方法，如放疗、化疗等等，但这些治疗手段或多或少存在诸如疗效不理想、副作用大、治疗费用高等问题。因此，有必要继续对肿瘤的治疗进行深入探索，开发出更加有效的治疗手段。超急性排斥反应(Hyperacute Rejection,HAR)由受体内(如人、猴)预存的天然抗体与异种供体(如猪)器官血管内皮细胞上的抗原靶分子结合激活补体系统，导致补体依赖细胞毒作用或/和直接激活血管内皮细胞释放血小板激活因子引起血栓形成。其中，抗原革E分子的末端均是由α 1，3半乳糖基转移酶(α 1，3-galaetosyltransferase, α I,3GT)催化连接的α半乳糖残基。因此，在肿瘤的治疗中，利用HAR反应，能够有效地在肿瘤部位导致补体依赖细胞毒作用毁坏癌细胞或/和引起局部血栓形成，切断肿瘤组织的养分供给，从而达到抗肿瘤的目的。然而，a 1，3GT只存在于非灵长类哺乳动物，而不存在于高级灵长目细胞内，故人类无α半乳糖抗原表达。因此，要利用前述HAR反应进行肿瘤治疗，必须寻找合适的手段将al，3GT导入人体中。目前，含有α1，3GT基因质粒的材料已经被研制出来，并可以直接被注射到肿瘤部位进行相关治疗。然而，这种含有a 1，3GT基因质粒的材料不具备靶向性，无法特异性地作用于待治疗的肿瘤部位，且注射有效剂量不易掌握，a 1，3GT定位表达范围和水平的不确定性，决定了其难以发挥有效治疗作用。因此，有必要用适当的载体对a 1，3GT基因进行装载，并对载体材料加以修饰，使其具备针对肿瘤细胞的靶向性。
发明内容
本发明要解决的技术问题在干，针对现有含有a 1，3GT基因质粒的材料不具备靶向性，无法特异性地作用于待治疗的肿瘤部位的缺陷，提供ー种对新生血管内皮细胞具有良好的靶向性的α I，3GT基因转染材料及其制备方法和应用。本发明的目的是提供ー种α 1，3GT基因转染材料。本发明的另一目的是提供所述a 1，3GT基因转染材料的制备方法。本发明所述a 1，3GT基因转染材料包括α I，3GT基因质粒、用于装载该质粒的PEG偶联的纳米脂质体、以及通过所述PEG偶联在所述纳米脂质体上的Endoglin抗体分子；所述α I，3GT基因转染材料中，各组份的质量比为a 1，3GT基因质粒PEG偶联的纳米脂质体Endoglin抗体分子=(O. I O. 3) (8. 8 13. 2) (O. 8 I. 2)，优选地，该比例为(O. I O. 15) (12. I 13. 2) (I. I I. 2)。 优选地，所述α 1，3GT基因质粒为5. 75kb真核表达质粒。
优选地,所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体微粒的粒径可为40 200nm。更优选地，所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体微粒的粒径可为40 45nm,由于肿瘤部位新生血管相对较少且管径较细，粒径较小的脂质体微粒能够更有效地到达靶细胞，从而实现更好的治疗效果。优选地,所述Endoglin抗体分子可为单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)或单链抗体(single-chain variable fragment (scFv) antibody, scFv Ab),分子量可为 20 180k道尔顿。
优选地，本发明采用的偶联剂为聚こニ醇衍生物等，所述聚こニ醇衍生物可选自ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇(DSPE-PEG)或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-maleimide)等PEG衍生物，偶联剂的PEG的分子量可为1000 4000。本发明所述Endoglin抗体偶联的脂质体的制备方法包括以下步骤I)制备PEG修饰的磷脂薄层；2)重悬所述磷脂薄层，加入a 1，3GT基因质粒，制得装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒；3)对所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒进行均一化和纯化；4)巯基化Endoglin抗体分子；5)将所述巯基化的Endoglin抗体分子偶联在所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒上，得所述a 1，3GT基因转染材料。优选地，在步骤I中，所述制备PEG修饰的磷脂薄层的具体方法包括用三氯甲烷将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、双十二烷基ニ甲基溴化铵、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000和ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-马来酰亚胺分别配制成20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和10mg/mL的相应浓度，并按摩尔比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在样品瓶中进行混合；充分混匀后，通氮气流(时间应不少于IOmin)除去有机溶剂，并不断旋转样品瓶，直至形成磷脂薄层(该磷脂薄层将在后续操作步骤中形成PEG偶联的纳米脂质体载体)；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。其中，双十二烷基ニ甲基溴化铵为阴离子表面活性剤，将在清洗过程中除去。优选地，在步骤2中，所述装入a 1，3GT基因质粒，制备纳米脂质体颗粒的具体方法包括往步骤I所述样品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl缓冲液，该缓冲液与所述步骤I所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(10 250) 1，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬步骤I获得的PEG修饰的磷脂薄层，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入a 1，3GT基因质粒、浓度为35% 75%的こ醇和200mM的CaCl2溶液，并使al，3GT基因质粒与所述步骤I所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(0. I O. 3) (8.8- 13. 2)，并使得こ醇的终浓度达到35 40% (V/V) 'CaCl2的终浓度达到4mM ；将瓶盖旋紧并密封，进行7 12个循环的反复冻融，得到脂质体颗粒，其中，每ー个冻融循环包括5 IOmin液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室温静置。优选地，在步骤3中，所述纳米脂质体颗粒的均一化和纯化的具体方法包括将步骤2)得到的脂质体颗粒依次通过膜挤出器中的400nm、100nm和50nm双层微孔滤膜各15 25次；在HEPES缓冲液中透析2 4h回收得到的质粒脂质体，期间更换透析液一次。优选地,在步骤4中，所述巯基化Endoglin抗体的具体方法包括；将Endoglin抗体与IOmM的Traut’ s试剂(Traut’ s Reagent)在避光室温巯基化反应I 2h,其中所述Endoglin抗体与所述Traut’s Reagent质量比为I : (100 160),随后超滤2 4次，除去Traut’s Reagent的同时,将缓冲液置换成HEPES缓冲液；所述Endoglin抗体可为单克隆抗体或单链抗体，分子量可为20 180k道尔顿。优选地,在步骤5中，所述将Endoglin抗体分子偶联在PEG修饰的纳米脂质体上的具体方法包括将步骤4得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤3得到的脂质体颗粒中，室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反应过夜，其中所述巯基化Endoglin抗体分子与所述步骤I所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(O. 8 I. 2) (8. 8 13. 2)。本发明还提供了ー种如上所述的α 1，3GT基因转染材料的应用，该 基因转染材料用于制备治疗实体肿瘤的药物。本发明所述a 1，3GT基因转染材料由于修饰有Endoglin抗体分子，因此对新生血管内皮细胞具有良好的靶向性，故而可广泛运用于各类实体肿瘤的早期治疗。在临床使用中，当该复合脂质体特异性作用于肿瘤组织新生血管内皮细胞的时候，其装载的a 1，3GT基因能够得到释放和表达，能够有效地在肿瘤部位引发HAR反应，导致补体依赖细胞毒作用毁坏癌细胞或/和引起局部血栓形成，切断肿瘤组织的养分供给，实现治疗肿瘤的目的。
下面将结合附图及实施例对本发明作进ー步说明，附图中图I为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的结构示意图；图2为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法流程图；图3为本发明实施例中的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料透射电镜图像(Χ10000)；图4为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在Endoglin稳定表达的293Τ细胞株中的表达(Χ40倍)；图5为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠体内Ih的代谢情况；图6为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠体内2. 5h的代谢情况；图7为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠体内4h的代谢情况；图8为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠各组织器官的代谢分布情况；图9为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料及对照组材料治疗荷瘤小鼠的结果图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进ー步详细说明。Pegylated immunoliposomes (PILs)是经聚乙ニ酉享(PEG)修饰的、粒径控制在 100纳米左右的纳米免疫脂质体，是ー种新的非病毒基因转移载体系统。在现有研究中，人们已经将多种抗体结合在脂质体上，制备出各种不同用途的免疫脂质体材料。Endoglin是20世纪80年代发现的一个和肿瘤新生血管相关的膜表面同型ニ聚体糖蛋白分子(分子量约为180kDa),是转化生长因子-β I (transforming growthfactor- β 1，TGF-β I)和细胞表面受体结合时的辅助分子。Endoglin和TGF-β I结合后，可调节TGF-β I和其受体结合后下游的信号传导途径，从而促进肿瘤新生血管生成。现已有许多研究表明=Endoglin主要分布于新生血管的内皮细胞和肿瘤周围组织的细胞表面，其它正常组织几乎均不表达。因此，Endoglin和肿瘤血管生成密切相关，是肿瘤血管生成的标志性分子之一。由于不同组织来源的肿瘤新生血管均起源于内皮细胞，各种肿瘤的新生血管具有均质性，所表达的特异抗原物质具有共性，这样就可避免不同肿瘤由于遗传物质在不断突变所导致的不同组织起源的肿瘤抗原的异质 性，因此针对肿瘤新生血管的治疗手段有可能应用于各种肿瘤。因此，Endoglin是肿瘤抗血管治疗和靶向治疗的理想靶点，具有诱人的临床应用前景。因此，如果用PILs对a 1,3GT进行装载，并在载体表面修饰的Endoglin抗体，则能够制备出ー种a 1，3GT基因转染材料，使得该基因转染材料具有对Endoglin分子的特异性结合能力。Endoglin抗体能够使该α I, 3GT基因转染材料特异性作用于肿瘤组织的新生血管内皮细胞，使得装载的α半乳糖基转移酶基因在肿瘤组织处得到表达，从而引发HAR反应，达到摧毁肿瘤的目的。从理论上推測，该材料对各类肿瘤均具有良好的靶向性，可以广泛运用于各类实体肿瘤的早期治疗。目前，尚未见针对肿瘤新生血管内皮细胞的a 1，3GT基因靶向转染材料的相关报道。下面将结合附图和实施例对本发明作进ー步说明，这些附图和实施例应当被理解为是说明性的，而非对本发明的限制。图I所示为本发明所述a 1，3GT基因转染材料的结构示意图。101为所述α 1，3GT基因质粒，该质粒优选为5. 75kb真核表达质粒。102为纳米脂质体微粒，其粒径范围为40 200nm，具有以下特殊性质I)能够提高纳米脂质体颗粒的水溶性和避免体内网状内皮系统的非特异性吞噬，以及延长纳米脂质体颗粒在体内的循环时间而达到提高靶组织和靶细胞对纳米颗粒摄取的目的；2)増加此类抗肿瘤药物的溶解度和稳定性，减弱或消除免疫原性、抗原性和毒性，提高药物的治疗指数，扩大临床用药范围；3)改善药物的体内药动学性质，延长药物在体内的半衰期等。103为偶联剂，具体为聚こニ醇衍生物，包括ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇(DSPE-PEG)或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-maleimide)等PEG衍生物，用作本发明偶联剂的PEG的分子量为1000 4000。104为Endoglin抗体分子,该抗体为单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)或单链抗体(single-chain variable fragment (scFv) antibody, scFv Ab),分子量为约 20 180k道尔顿。图2所示为所述α 1，3GT基因转染材料的制备方法流程图。201为制备PEG修饰的磷脂薄层的步骤，具体包括用三氯甲烷将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-maleimide)分别配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和 10mg/mL 的相应浓度，并按摩尔比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在样品瓶中进行混合；充分混匀后，通氮气流(时间应不少于IOmin)除去有机溶剂，并不断旋转样品瓶，直至形成磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。202为装入a I，3GT基因质粒，制备纳米脂质体颗粒的步骤，具体包括往步骤201所述样品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl缓冲液，该缓冲液与所述步骤201所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(10 250) 1，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3 5min，充分重悬所述步骤I)获得的PEG修饰的磷脂薄层，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入a 1，3GT基因质粒、浓度为35% 75%的乙醇和200mM的CaCl2溶液，并使α 1，3GT基因质粒与所述步骤201所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(O. I O. 3) (8. 8 13. 2)、乙醇的终浓度达到体积分数为35 40%、CaCl2的终浓度达到4mM ;将瓶盖旋紧并密封，进行7 12个循环的反复冻融，得到脂质体颗粒，其中，每一个冻融循环包括5 IOmin 液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室温静置。203为脂质体颗粒的均一化和纯化步骤，具体包括将步骤202得到的脂质体颗粒依次通过膜挤出器中的400nm、100nm和50nm双层微孔滤膜各15 25次，以完成脂质体的均一化；在HEPES缓冲液(25mM HEPES, HOmMNaCl, pH7. O)中透析2 4h回收得到的脂质体颗粒，期间更换透析液一次，以完成脂质体的纯化。204为巯基化Endoglin抗体的步骤，具体包括；将Endoglin抗体与IOmM的Trauf s试剂(2-亚氨氢氯化硫醇经50mM四硼酸钠，pH9. 4配制而成)在避光室温巯基化反应I 2h,其中所述Endoglin抗体与所述Traut’ s试剂质量比为I : (100 160),随后超滤2 4次，除去Traut’ s试剂的同时，将缓冲液置换成HEPES缓冲液。205为将步骤204得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤203得到的脂质体颗粒中，室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反应过夜(10 18h)，其中所述巯基化Endoglin抗体分子与所述步骤201所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(O. 8 1.2) (8. 8 13. 2)。实施例I :制备粒径为IOOnm的α 1，3GT基因转染材料，并对产物进行表征，具体制备步骤如下I)用三氯甲烷将 POPC、DDAB、DSPE-PEG2000 和 DSPE-PEG2000_maleimide 分别配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL 和 10mg/mL 的相应浓度，并按 18. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I和0. 2 μ mo I的量混合于Agilent色谱样品瓶中；充分混勻后，通氮气流15min除去有机溶齐U，并不断旋转样品瓶，直至形成磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。2)取出样品瓶，加入0. 2mL TRIS-HCl缓冲液(50mM，pH7. 0)，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬磷脂混合物，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒DNA (350 μ g)、60%乙醇(终浓度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(终浓度4mM);将瓶盖旋紧并密封，进行5个循环(每一个循环包括5min液氮-2min 37°C水浴_4min室温静置)的反复冻融，得到质粒脂质体。3)将步骤2)得到的质粒脂质体依次通过膜挤出器中的400nm(20次)、100nm(20次)和50nm(21次)双层微孔滤膜，完成脂质体的均一化；在HEPES缓冲液(25mM HEPES,140mM NaCl, pH7. O)中透析2h回收得到的质粒脂质体,期间更换透析液一次,完成脂质体的纯化。4)将 Endoglin 抗体 I. 6mg 与 200 μ L IOmM 的 Traut’ s Reagent (2_ 亚氨氢氯化硫醇经50mM四硼酸钠，pH9. 4配制而成)，避光室温巯基化反应Ih,随后采用MicroconUltracel YM-30超滤离心管超滤3次，除去Traut’ s Reagent的同时，将缓冲液置换成HEPES缓冲液。5)将步骤2-4得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤2_3得到的脂质体颗粒中，室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反 应过夜。图3所示为所制备α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的透射电镜图像，可以看到脂质体颗粒粒径约为lOOnm，且粒径分布均匀。粒径测定采用动态光散射法进行，测得所制备Endoglin抗体偶联的质粒DNA脂质体的粒径为100. 78 ± I. 94nm，与图3中透射电镜观
察结果一致。实施例2 :制备粒径为40nm的α 1，3GT基因转染材料，具体制备步骤如下I)用三氯甲烷将 POPC、DDAB、DSPE-PEG2000 和 DSPE-PEG2000_maleimide 分别配制成 20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL 和 10mg/mL 的相应浓度，并按 18. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I、O. 6 μ mo I和0. 2 μ mo I的量混合于Agilent色谱样品瓶中；充分混勻后，通氮气流15min除去有机溶齐U，并不断旋转样品瓶，直至形成磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。2)取出样品瓶，加入4mL TRIS-HCl缓冲液(50mM，pH7. O)，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬磷脂混合物，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒0嫩(14(^8)、60%乙醇(终浓度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(终浓度4mM);将瓶盖旋紧并密封，进行7个循环(每一个循环包括5min液氮-2min 37°C水浴_4min室温静置)的反复冻融，得到质粒脂质体。3)将步骤2)得到的质粒脂质体依次通过膜挤出器中的400nm(25次)、IOOnm(25次)和50nm(25次)双层微孔滤膜，完成脂质体的均一化；在HEPES缓冲液(25mM HEPES,140mM NaCl, pH7. O)中透析2h回收得到的质粒脂质体,期间更换透析液一次,完成脂质体的纯化。4)将 Endoglin 抗体 I. 6mg 与 200 μ L IOmM 的 Traut’ s Reagent (2_ 亚氨氢氯化硫醇经50mM四硼酸钠，pH9. 4配制而成)，避光室温巯基化反应Ih,随后采用MicroconUltracel YM-30超滤离心管超滤3次，除去Traut’ s Reagent的同时，将缓冲液置换成HEPES缓冲液。5)将步骤2-4得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤2_3得到的脂质体颗粒中，室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反应过夜。实施例3 :制备α 1，3GT/EGFP融合基因转染材料，并用于细胞内表达实验研究。该融合基因转染材料具体制备步骤基本同实施例I所述步骤，不同处为步骤2中的水浴超声波仪处理后，依次逐滴加入α 1，3GT/EGFP融合基因质粒DNA(350 μ g)、60%乙醇(终浓度35%, V/V)、200mM CaCl2溶液(终浓度4mM)，再进行5个循环的反复冻融。步骤1、3、4和5均与实施例I相同。图4所示为所制备α l，3GT/EGFP融合基因转染材料在Endoglin稳定表达的 293Τ细胞株中的表达。该图结果表明，本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料能够与Endoglin蛋白特异性结合，其装载的基因质粒可以得到良好表达，该基因转染材料具备临床应用前景。实施例4 :制备α 1，3GT基因/LSS670复合转染/成像材料，并用于小鼠体内代谢实验研究。该复合转染/成像材料具体制备步骤基本同实施例I所述步骤，不同处为步骤2中的水浴超声波仪处理后，依次逐滴加入a 1，3GT基因质粒DNA(200y g)、LSS670染料(150 μ g)、60%乙醇(终浓度35%，V/V)、200mM CaCl2溶液(终浓度4mM)，再进行5个循环的反复冻融。步骤1、3、4和5均与实施例I相同。同时,制备Endoglin抗体偶联的载LSS670成像材料脂质体,用作该实验研究的对照组。该成像材料具体制备步骤基本同实施例I所述步骤，不同处为步骤2中的水浴超声波仪处理后，依次逐滴加入LSS670染料(150 μ g)、60%乙醇(终浓度35%，V/V)、200mMCaCl2溶液(终浓度4mM)，再进行5个循环的反复冻融。步骤1、3、4和5均与实施例I相 同。图5-图7为本发明所述αI，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠体内的代谢情况。其中，每张图片所示小鼠从左到右所给的药物依次为柯达专利染料LSS670的游离染料对照组、Endoglin抗体偶联的载LSS670成像材料脂质体对照组和本实施例所述α 1，3GT基因/LSS670复合转染/成像材料实验组。药物通过尾静脉注射给入小鼠体内，由于小鼠没有荷瘤，因此没有明显靶向的位点。由于游离的LSS670有代谢非常快的特点，从I小时的结果已经可以看到，对照组代谢速度明显大于实验组。到了 2. 5小时和4小时的数据，可以明显看到，对照组基本只剩下膀胱附近的信号，而实验组在整个身体，尤其是脏器都还有明显的信号。图8为本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料在小鼠各组织器官的代谢分布情况。从上向下依次为脑、心、肺、肠、肝、脾、肾、膀胱，从左到右所给的药物依次为柯达专利染料LSS670的游离染料对照组、Endoglin抗体偶联的载LSS670成像材料脂质体对照组和本实施例所述a 1，3GT基因/LSS670复合转染/成像材料实验组。将各组实验用小鼠于注射4小时后进行解剖，并取出脑、心、肺、肠、肝、脾、肾、膀胱等器官，进行新鲜器官组织中转染材料代谢分布情况的直接成像。检测结果表明，实验组信号明显高于对照组。综合图7和图8所示的结果，可以得出，本发明所述α I，3GT基因转染材料在机体内代谢缓慢，有充分时间随血液循环到达病灶部位。因此，本发明所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料具备较好的临床应用前景。同时本实施例的研究表明，利用本发明所述的方法，还可以制备a 1，3GT基因/成像材料复合转染/成像材料，能够同时用于肿瘤的治疗和病灶部位成像。图9为采用本发明所述a 1，3GT基因转染材料及对照组材料治疗荷瘤小鼠的结果图。图9中ENG+GT为本发明制备的用Endoglin抗体偶联的装载有al，3GT基因的纳米脂质体微粒；GT为a 1，3GT基因；ENG为Endoglin抗体；GT为a 1，3GT基因；VECT0R为空载体。横轴D为导入荷瘤体内的天数。竖轴为荷瘤小鼠的存活率。在该实验中，ENG、GT、VECTOR均为对照组，将上述4中材料分别于荷人免疫系统SCID鼠人肺癌动物模型建立后的第I天(Dl)，即第I次接种/D1，第2次接种/D12，观察其疗效直至D50。图9示出了用Endoglin抗体偶联在纳米脂质体微粒将该基因导入重构人免疫系统荷人肺腺癌SCID鼠体内，产生的抗肿瘤效果图。从图9中可以看到，运载al，3GT基因的靶向转染材料具有较理想的抗肿瘤作用。因此采用该基因转染材料制备的药物也具有较理想的抗肿瘤作用。应说明的是，以上实施例仅用以对本发明的技术方案进行说明，而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以在不背离 本发明的精神和范围的情况下对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1.ー种α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在于包括α 1，3半乳糖基转移酶基因质粒、用于装载该质粒的PEG偶联的纳米脂质体、以及通过所述PEG偶联在所述纳米脂质体上的Endoglin抗体分子；所述α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料中，各组份的质量比为α ，3半乳糖基转移酶基因质粒PEG偶联的纳米脂质体Endoglin抗体分子=(O. I O. 3) (8. 8 13. 2) (O. 8 I. 2)。
2.根据权利要求I所述的α ，3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在干所述α 1，3半乳糖基转移酶基因质粒为5. 75kb真核表达质粒。
3.根据权利要求I所述的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，其特征在于 所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体微粒的粒径为40 200nm ； 所述Endoglin抗体分子为单克隆抗体或单链抗体,分子量为20 180k道尔顿； 所述PEG由下述聚こニ醇衍生物提供ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇或ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇-马来酰亚胺PEG衍生物，PEG的分子量为1000 4000。
4.ー种根据权利要求1-3中任意一项所述的α I, 3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)制备PEG修饰的磷脂薄层； 2)重悬所述磷脂薄层，加入α1，3半乳糖基转移酶基因质粒，制得装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒； 3)对所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒进行均一化和纯化； 4)巯基化Endoglin抗体分子； 5)将所述巯基化的Endoglin抗体分子偶联在所述装载有质粒的PEG偶联的纳米脂质体颗粒上，得所述α ，3半乳糖基转移酶基因转染材料。
5.根据权利要求4所述的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤I)的具体步骤包括用三氯甲烷将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、双十二烷基ニ甲基溴化铵、ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000和ニ硬脂酰磷脂酰こ醇胺-聚こニ醇2000-马来酰亚胺分别配制成20mg/mL、5mg/mL、20mg/mL和10mg/mL的相应浓度，并按摩尔比(90 100) (2 4) (2 4) I的比例在样品瓶中进行混合；充分混匀后，通以时间不少于IOmin的氮气流除去有机溶剂，并不断旋转样品瓶，直至形成PEG修饰的磷脂薄层；而后置于旋转蒸发仪中真空蒸发2h。
6.根据权利要求4所述的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于所述步骤2)的具体步骤包括往步骤I)所述样品瓶中加入50mM、pH = 7. O的TRIS-HCl缓冲液，该缓冲液与所述步骤I)所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(10 250) 1，轻微旋转和震荡后，置水浴超声波仪处理3min，充分重悬所述步骤I)获得的PEG修饰的磷脂薄层，同时应尽量避免气泡的产生；依次逐滴加入a 1，3GT基因质粒、浓度为35% 75%的こ醇和200mM的CaCl2溶液，并使α 1，3GT基因质粒与所述步骤I)所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(O. I O. 3) (8. 8 13. 2)、こ醇的终浓度达到体积分数为35 40%、CaCl2的终浓度达到4mM ;将瓶盖旋紧并密封，进行7 12个循环的反复冻融，得到脂质体颗粒，其中，每ー个冻融循环包括5 IOmin液氮-2 5min 37°C水浴_4 7min室温静置。
7.根据权利要求4所述的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)的具体步骤包括将步骤2)得到的脂质体颗粒依次通过膜挤出器中的400nm、IOOnm和50nm双层微孔滤膜各15 25次；在HEPES缓冲液中透析2 4h回收得到的脂质体颗粒，期间更换透析液一次。
8.根据权利要求4所述的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的具体步骤包括将Endoglin抗体与IOmM的Traut’ s试剂在避光室温巯基化反应I 2h,其中所述Endoglin抗体与所述Traut’s试剂质量比为I : (100 160),随后超滤2 4次，除去Traut’ s试剂的同吋，将缓冲液置換成HEPES缓冲液。
9.根据权利要求4所述的al，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法，其特征在于，所述步骤5)的具体步骤包括将步骤4)得到的巯基化Endoglin抗体迅速加入步骤3)得到的脂质体颗粒中，室温下氮气保护环境中，摇晃偶联反应过夜，其中所述巯基化Endoglin抗体分子与所述步骤I)所得PEG修饰的磷脂薄层的质量比为(O. 8 I. 2) (8. 8 13. 2)。
10.ー种根据权利要求I 3中任意一项所述的α 1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的应用，其特征在于，该基因转染材料用于制备治疗实体肿瘤的药物。
全文摘要
本发明涉及一种α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料，包括α1，3半乳糖基转移酶基因质粒、用于装载该质粒的PEG偶联的纳米脂质体、以及通过所述PEG偶联在所述纳米脂质体上的Endoglin抗体分子。本发明的α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料对肿瘤组织的新生血管内皮细胞具有良好的靶向性，当其特异性作用于肿瘤组织的新生血管内皮细胞的时候，装载的α1，3半乳糖基转移酶基因能够得到表达，在肿瘤组织局部引发超急性排斥反应，从而实现治疗肿瘤的目的。本发明还涉及该α1，3半乳糖基转移酶基因转染材料的制备方法及应用。
文档编号A61K47/34GK102716497SQ201110189239
公开日2012年10月10日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者卢小玲, 彭宜, 赵永祥 申请人:卢小玲, 赵永祥