专利名称：一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物领域，具体涉及一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞治疗载体及其药物。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年增高，严重危害了身体健康。乳腺癌手术治疗主要针对早中期乳腺癌，术后和晚期一般需综合治疗。化放疗不能杀灭乳腺癌干细胞，导致复发转移。综合治疗后，预后仍不满意，中晚期患者5年生存率仅10% -30%。三阴乳腺癌预后更差。乳腺癌干细胞是乳腺癌复发、转移和耐药的主要原因。因此，迫切需要探索高效靶向杀灭乳腺癌的新药物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体。本发明克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的1 %，因此无法广泛应用，本发明首先将hTERT启动子控制fel4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；再将 Gal4-VP2融合蛋白与效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录；然后将WPRE位于目的基因的3-UTR，增强mRNA稳定性的作用，由此构建得到hTERT_VP16_GAL4-WPRE (VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier, VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA(整合性系统放大器)系统，最后，结合BiKDD基因(突变的Bik自杀基因，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致细胞凋亡)作为治疗基因，建立T-VISA-BiKDD治疗载体，该T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本发明的第二个目的是提供一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物 T-VISA-BikDD脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的脂质体可以使用按照常规方法制备的脂质体，优选是通过以下方法制备的脂质体按照1摩尔胆固醇对应1. 7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜； 然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5 %的葡萄糖溶液的体积，在 50°C的超声水浴箱中进行超声处理lmin，再在50°C下收集通过0. 1 μ m的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。通过该方法制备的脂质体粒径为ISOnm左右，容许其穿透肿瘤细胞中极细的毛细血管并被细胞摄取。所述的药物T-VISA-BikDD脂质体优选通过以下方法制备的，将上述脂质体加
3入到5%的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-BiKDD治疗载体加入到5% 的葡萄糖溶液中使T-VISA-BiKDD治疗载体的浓度为lyg/y 1，然后将脂质体溶液和 T-VISA-BiKDD治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-BikDD脂质体。利用该方法制备得到的药物T-VISA-BikDD脂质体的粒径200 300nm，稳定性好，在4 8°C，1_2
年无降解。本发明的药物T-VISA-BikDD脂质体在体外能高效杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系，而对正常细胞无杀灭作用，在动物模型中可抑制乳腺癌细胞的生长，延长小鼠的生存时间，对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，无肝肾毒性。由此可见，本发明的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡， 而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
图1是T-VISA-BikDD结构示意图，它是以pUK_21为基本骨架，kana抗性的可治疗性载体；图2是动态光散射测量实施例2制得的脂质体(Liposome)和实施例3的 T-VISA-BikDD 脂质体(Liposome+T-VISA-BikDD)的粒径及其分布；图3是T-VISA-BikDD脂质体在体外杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系的结果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照，T-VISA-BikDD表示 T-VISA-BikDD治疗载体的处理，Her-2，ER，EGFR分别是指人类表皮生长因子受体2，雌激素受体和表皮生长因子受体，-表示阴性，+、++、+++分别表示阳性，弱阳性和强阳性。士表示不确定。图4是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中抑制乳腺癌生长的示意图，其中Ctrl 表示没有做任何处理的空白对照；图5是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中的肝肾毒性，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。
具体实施例方式以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。一、T-VISA-BikDD 脂质体的制备实施例1 :T-VISA_BikDD治疗载体的构建(一)pCRII-TOPO-hTERT 质粒克隆1、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(R)rward)和下游(Reverse)弓丨物Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc age
3、以乳腺癌 MCF-7 细胞 DNA 为模板，hTERT PCR 引物(i^orward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc age gc_3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 禾口 PCR 反应液， 扩增获得hTERT启动子(-416 to+Ι)产物，其序列如SEQ ID NO. 2所示。其PCR反应体系 10XPCR buffer5 μ 1，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各 1μ 1，MCF_7 细胞 DNA 为模板 IOOng DN A, 25mM MgCl2 3 μ 1，IOmM dNTPs 1 μ 1，Pfu-Taq (IU/ μ 1)，最后补水至 50 μ 1。 PCR反应条件94°C热变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共进行30 次循环；最后72°C延伸IOmin。4、PCR产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂盒回收，回收约418bp大小片断。方法参考其说明书。5、将回收的 PCR 产物 2 μ 1，pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1 μ 1, DNA ligase bufferl μ 1，最后补水至 10μ 1，4°C连接反应 IOmin06、将2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ecoli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。7、取200μ1 LB培养基细菌液，涂布ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。8、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子(其序列如SEQ ID N0. 2所示)已经插入克隆载体pCRII-TOPO中，命名为pCRII-TOPO-hTERT。( 二 ) pGL3-hTERT_Luc 质粒克隆1、用 KpnI/Xhol 酶切 pCRII-TOPO-hTERT 质粒，用 KpnI/Xhol 酶切 pGL-3-basic 质粒(Promega公司，麦迪逊，WI)，该质粒中含有荧光素酶Luciferase基因。酶切体系 IOXBuffer A 2μ 1，KpnI/Xholl μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C 水浴 1 小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERI^418bp 大小)片断和pGL-3-BasisG792bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 hTERT 产物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 产物 2μ 1，DNA ligase 1 μ 1, buffer 1 μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、将2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200 μ 1 LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子已经插入载体pGL-3-basic 中，命名为pGL3-hTERT-Luc质粒。(三)pGL3-Luc_WPRE 质粒克隆1、用 Asp718/&ill 酶切 pGEM_3Z_WPRE 质粒(Promega 公司，麦迪逊，WI)，然后用 DNA polymerase 平端；用 Small 酶切 pGL_3_basic 质粒(Promega 公司，麦迪逊，WI)。酶切体系10X Buffer A 2 μ l,Asp7181y 1/SalI 1 μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 1 小
2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE (590bp大小)片断和pG-L3-Basis (约4800bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 WPRE 产物 6μ 1，回收的 pGL-3-basic 产物 2μ 1，DNA Iigase 1 μ 1, buffer 1 μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200 μ 1 LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实WPRE插入了 pGL-3-basic中，命名为 pGL3-Luc-WPRE 质粒。(四)pGL3-hTERT-TSTA_Luc 质粒克隆1、用 Hindlll/NotI 酶切 pCRII-TOPO-hTERT质粒(见上)，然后用 DNA polymerase 平端；用 MSCI/Nhel 酶切 pGL3_TSTA_Luc 质粒(Invitrogen，Carlsbad, CA)，然后用 DNA polymerase 平端。酶切体系10X Buffer A 2μ 1，HindIII/NotI or MSCI/Nhel 1μ 1，质粒5 μ g，补水至20 μ 1，37°C水浴1小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收hTERT (418bp 大小)片断和pGL3-TSTA-Luc(7300bp大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)PCRDNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 hTERT 产物 6μ 1，回收的 pGL33-TSTA-Luc 产物 2μ 1，DNA ligase 1 μ 1, buffer 1 μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200 μ 1 LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序分析，证实hTERT启动子插入了载体pGL33_TSTA-Luc 中，命名为 pGL3-hTERT-TSTA-Luc 质粒。(五)T-VISA-Luc质粒克隆1、用 Notl/Bglll 酶切 pGL3-Luc_WPRE 质粒(见上)；用 Notl/Bglll 酶切 pGL3-hTERT-TSTA-Luc 质粒(见上)。酶切体系10X Buffer A 2 μ 1, NotI 1 μ 1，BglII 1μ 1，质粒5yg，补水至20μ 1，37°C水浴1小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收WPRE (590bp大小)片断和 pGL3-hTERT-TSTA-Luc(7593bp 大小)片断。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 WPRE 产物 6 μ 1，回收的 pGL3-hTERT-TSTA_Luc 产物 2 μ 1，DNA ligase 1μ l，bufferly 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。
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5、2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200 μ 1 LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，命名为pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒，简称 pGL3-hTERT-VISA-Luc 质粒，即 T-VISA-Luc 质粒。(六)pGL3-T-VISA_BikDD 质粒1、用 BamHI/EcoRV 酶切 pUK21_CMV_BikDD 质粒(购自美国 MD. Anderson 癌症中心)平端，酶切体系IOX Buffer A 2 μ 1, BamHI 1 μ 1，EcoRV 1 μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴1小时。用Bglll/Nhel酶切pGL3_hTERT_VISA-Luc质粒平端，酶切体系 IOX Buffer A2 μ 1，BglII 1μ 1，NheI 1μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 1 小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收BikDD片段 (493bp)和pGL3-hTERT-VISA片断(1650bp)(酶切去除了荧光素酶基因)。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的BikDD产物6μ 1，回收的pGL3-hTERT-VISA产物2μ 1，DNA ligase 1 μ 1, bufferly 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200 μ 1 LB培养基细菌液，涂布Ampicillin LB培养板上，在37°C下培养16 小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，BikDD基因插入到pGL3_hTERT_VISA中，命名为 pGL3-T-VISA-BikDD 质粒。(七)pUK21-T-VISA_BikDD 治疗载体1、用 NotI/&ilI 酶切 pGL3-T-VISA-BikDD 质粒，酶切体系10X Buffer A 2μ 1, NotI 1μ l，SalI 1μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1，37°C水浴 1 小时。用 Notl/Sall 酶切 pUK21 质粒，酶切体系为10X Buffer A 2 μ 1, NotI 1μ 1, Sail 1 μ 1，质粒 5 μ g，补水至 20 μ 1， 37°C水浴1小时。2、酶切产物在IXTAE Agarose凝胶中电泳，120v电泳30分钟，回收T-VISA-BikDD 片段(5641bp)和 pUK21 片段(816bp)。3、酶切产物用Qiangen公司(美国)DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。4、回收的 T-VISA-BikDD 产物 6 μ 1，回收的 pUK21 产物 2 μ 1，DNA ligase 1 μ 1, buffer 1 μ 1，最后补水至10 μ 1，4°C连接反应4小时。5、2 μ 1连接产物与50 μ 1 Ε. coli DH5 α感受态细胞混合后，冰浴30min。42°C水浴热激动反应45sec，然后冰上放置;3min。加入预热的LB培养基500 μ 1，在37°C下250rpm 震摇30min。6、取200μ1 LB培养基细菌液，涂布Kanamycin LB培养板上，在37°C下培养16小时。挑取阳性单克隆，提取质粒。
7、酶切质粒鉴定，进行测序证实，T-VISA-BikDD片段插入到pUK21质粒的NotI/ SalI位点，命名为pM21-T-VISA-BikDD治疗载体，简称T-VISA-BikDD治疗载体，经测序其序列如SEQ ID NO. 1所示。pUK21-T-VISA-BikDD 治疗载体是 pUK21_CMV_BikDD 经 BamHI/EcoRV/ 酶切平端后，BikDD片段插入到pGL3-hTERT-TSTA-Luc-WPRE质粒的Bgl II/Nhel/平端位点，产生 pGL3-T-VISA-BikDD 质粒。pGL3-T_VISA_BikDD 质粒 Notl/Sall 酶切后，T-VISA-BikDD 片段插入到PUK21质粒的Notl/Sall位点，产生pUK21_T_VISA-BikDD治疗载体，简称为 T-VISA-BikDD治疗载体，其结构如图1所示。pUK21-T-VISA-BikDD治疗载体主要包括hTERT启动子(其序列如SEQ ID NO. 2所示)、WPRE (其序列如SEQ ID N0. 3所示)、G5E4T (其序列如SEQ ID N04所示)和Gal4_VP2基因(其序列如SEQ ID N0. 5所示)和BikDD基因(其序列如SEQ ID N0. 6所示)。hTERT启动子控制fel4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；Gal4-VP2 融合蛋白与&ι14效应元件G5E4T结合，启动BikDD基因的大量转录，BikDD基因与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致细胞凋亡。实施例2 脂质体的制备将脂质从冰箱中取出(D0TAP储存于_20°C、胆固醇储存于_4°C )，恢复至室温。水浴加热2个旋转蒸发仪分别至30°C，50°C。称取68. 75mg胆固醇，放入1000ml圆底烧瓶。向圆底烧瓶中加入IOOmg DOTAP和25mg Choroform0转动烧瓶，使其充分混合。在30°C的水浴箱中旋转圆底烧瓶2min，使其混合均勻，在烧瓶壁上形成一层薄膜。打开真空抽吸器，30°C 下30min。加入8. 9ml预热的5%葡萄糖溶液溶解已干燥的薄膜，50°C下以105转/min快速旋转45min。然后降低温度至35°C旋转lOmin。用保鲜膜(或石蜡)封口烧瓶，室温下过夜，避光。测量体积，加双蒸水至8. 9ml。在50°C的超声水浴箱中Q00W)对烧瓶进行超声处理 1 分钟。在 50°C下依次通过 1. O μ m，0. 45 μ m，0. 22 μ m，0. 1 μ m 的滤膜(1· O μ m，0· 45 μ m 为 Whatman 的 polysufone 滤膜，货号分别为 #6780-1310 和 #6780-1304 ；0. 22ym,0. Iym 为Whatman的Anotop滤膜，货号分别为#6808-1122和#6809-1112)，最后通过0. 1 μ m的脂质体放入洁净的玻璃瓶中。用氮气填充试管10秒，将脂质体保存于试管中置于4°C避光保存备用(同时防止空气进入)。实施例3 =T-VISA-BiKDD脂质体的制备T-VISA-BikDD治疗载体溶于5%葡萄糖溶液，使其终浓度为lug/ul，同时将存储浓度QOmM)的实施例2的脂质体用5%葡萄糖溶液稀释为工作浓度(8mM)。Iyg DNA/ ul的T-VISA-BikDD治疗载体缓慢加入SmM的脂质体中，在室温中静置20分钟，反应，形成 T-VISA-BikDD 脂质体。然后再检定、生物特性检测和内毒素等质控，无菌分装。成品检定，包装，4_8°C保存；使用前先放室温20分钟，可直接用于体外研究，也可用于体内研究，也可用5%葡萄糖溶液稀释后使用。二、效果实验1、T-VISA-BiKDD脂质体的生物特性对实施例3获得的T-VISA-BiKDD脂质体进行生物特性测定，其生物特性如下脂质体大小经动态光散射所测的脂质体粒径在ISOnm左右，包裹质粒后粒径约
8为 200nm-300nm(见图 2)。脂质体稳定性在4-8度1-2年无降解。浓度4mM。2、T-VISA-BiKDD脂质体的抗乳腺癌活性2.1体外实验将T-VISA-BiKDD脂质体共转染乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞、乳腺癌干细胞系和正常细胞系，48小时后，收集细胞、裂解，计算细胞存活率，以未做任何处理的癌细胞作为空白对照(即图中的ctrl)，结果如图3所示，由图3中可以看出，T-VISA-BikDD脂质体可高效杀灭乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞031和468细胞)和乳腺癌干细胞细胞系(BCSLC、BCSC1 和BCSC2)，对正常细胞没有明显杀伤作用。2. 2体内实验2. 2. IT-VISA-BikDD脂质体在动物模型中可抑制乳腺癌生长在Balb/c裸鼠中原位接种三阴乳腺癌细胞068-luc细胞系，稳定表达 Iuciferase蛋白)，三周后，通过尾静脉注射T-VISA-BikDD脂质体15ug/只，每周两次，连续三周，用fenogen IVIS活体成像仪动态观察靶基因Luciferase表达，动态观察肿瘤发生发展和生存时间。结果如图4所示，由图4(活体成像监测肿瘤生物信号强弱)表明， T-VISA-BikDD有效抑制肿瘤的生长，并延长小鼠生存时间。2. 2. 2T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中无肝肾毒性50 μ g/只T-VISA-BikDD脂质体通过尾静脉注射Balb/c鼠，观察小鼠行为和生存状况，并在注射后第二天和第四天采血，生化自动分析仪检测AST (谷草转氨酶)、ALT (谷丙转氨酶)和CRE (肌酐)等。结果如图5所示，由图5表明，T-VISA-BikDD脂质体与CMV-BikDD 脂质体(其制备方法同T-VISA-BikDD脂质体)相比较，T-VISA-BikDD脂质体对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，对肝功能和肾功能无影响，无肝肾毒性。
权利要求
1.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体，其特征在于，其序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
2.一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，其特征在于，包括脂质体，和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根据权利要求2所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体， 其特征在于，所述的脂质体是通过以下方法制备的按照1摩尔胆固醇对应1. 7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜；然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5 %的葡萄糖溶液的体积，在50°C的超声水浴箱中进行超声处理lmin，再在 50°C下收集通过0. 1 μ m的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。
4.根据权利要求3所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体， 其特征在于，所述的药物T-VISA-BikDD脂质体是通过以下方法制备的将脂质体加入到 5%的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM JfT-VISA-BiKDD治疗载体加入到5%的葡萄糖溶液中使T-VISA-BiKDD治疗载体的浓度为1 μ g/μ 1，然后将脂质体溶液和T-VISA-BiKDD 治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-BikDD脂质体。
全文摘要
本发明公开了一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物。可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体，其序列如SEQ ID NO.1所示。所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
文档编号A61K48/00GK102423493SQ20111037159
公开日2012年4月25日 申请日期2011年11月21日 优先权日2011年11月21日
发明者孔亚楠, 李来胜, 谢小明, 谢新华, 郭姣丽 申请人:中山大学肿瘤防治中心