专利名称：用于哮喘预防和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗Hsp70/CD80的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种哮喘预防和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗Hsp70/CD80。
背景技术：
支气管哮喘(哮喘)是全球范围内严重威胁公众健康的一种慢性疾病。目前，全球已有约3亿哮喘患者，而我国有约2千万哮喘患者。哮喘患者随着疾病的进展，其肺功能进行性恶化，治疗难度增加，亦影响疾病的转归。当前认为，这主要在于气道持续性损伤和结构改变，即气道重塑，因而引起广泛的重视。上皮腺体增生和黏液性化生，导致黏液分泌过多，黏液栓阻塞气道，促使支气管狭窄，甚至闭塞，以及基底膜的增厚和气道平滑肌的增生与肥大，促使气道壁的增厚是慢性哮喘和重症难治性哮喘的重要特征，在致死性哮喘中尤为关出。目前治疗哮喘的常用药物对气道重塑的治疗作用有限，早期使用糖皮质激素可能对网状基底膜增厚有一定作用，且长期使用可产生副作用。过敏原特异性防治可以使病人症状达到较长期的缓解，但对适应症有一定要求(如高IgE病人)，需长期使用并有一定的危险(甚至造成病人死亡)。一般认为气道重塑一旦发生即难以逆转，所以深刻理解哮喘气道重塑的发病学以及寻求更安全、有效的防治方法对其控制和治愈是当前迫切需要解决的重要问题。哮喘的气道重塑的发生机制复杂，但免疫反应异常在其发病过程中起重要作用。调节哮喘机体的免疫平衡是重要的防治策略，也是国内外研究热点。Mosmann等提出的Thl/Th2细胞平衡理论一直作为哮喘发病机制的核心。然而，进一步研究发现，Thl细胞是前炎症细胞，其促炎症作用超过了抗炎症作用，与Thl细胞相关的炎症反应并不下调哮喘，而在Th2细胞免疫介导的疾病中哮喘的发病率也并未增高。因此，单纯的Thl/Th2细胞平衡理论不足以解释哮喘全部的发生发展过程。有研究证明哮喘患者肺泡灌洗液中CD4T细胞增加，说明CD4细胞在哮喘发病中也起到了作用。实际上，CD4T细胞至少包括了 4个亚群。辅助作用是CD4T细胞的重要功能，CD4T细胞的各个亚群主要通过辅助功能调节着机体的免疫反应。近年来研究表明，除Thl和Th2效应细胞外，其它一些⑶4T细胞亚群在哮喘发病中也起了重要作用。如CD17与嗜中性细胞炎症有关；与免疫耐受有关的调节性T细胞在控制哮喘的发病中起重要作用。这些细胞亚群可由于接受信号的差异、信号传导途径的不同、转录因子的特点、分泌不同细胞因子等加以区别，这些CD4T细胞亚群的分析探讨也是近年来哮喘研究中逐步开始的热点。调节哮喘机体的免疫平衡的方法大体分为过敏原特异性的防治和过敏原非特异性防治两类，过敏原非特异性防治方法能从各种变应原所致免疫反应的共同途径着手进行干预，是支气管哮喘免疫 防治的重要策略。DNA疫苗是近年来研究的一种新型疫苗，具有成分清楚、制备简单等优点，而成为免疫调节剂的较好选择，其独特的免疫方式和良好的免疫效果而倍受关注。
热休克蛋白是一类具有重要生物和免疫功能的高度保守的蛋白质，存在于原核和真核细胞中。分支杆菌HSP70包含多个T细胞和B细胞表位，具有免疫优势抗原的特点，能诱导出明显的Thl型细胞反应，调节机体的免疫平衡。CD80是重要的具有免疫活化功能的共刺激分子之一。⑶80与其共刺激受体⑶28和/或CTLA-4间相互作用可提供T细胞活化所必需的协同刺激信号，对体液免疫和细胞免疫具有全面的活化作用。在之前公开的专利CN1562362A中，将结核杆菌HSP70基因与人CD80基因拼接构成结核菌HSP70/人CD80嵌合DNA真核表达质粒，即HSP70/CD80嵌合DNA疫苗。其中具体使用的质粒载体为pcDNA3.1 (+)结果发现该嵌合DNA质粒，对结核菌有很强的抑制作用，显示出明显免疫预防及治疗作用。基于上述实验结果和分析，我们认为HSP70/CD80嵌合DNA疫苗可能从干预各种变应原所致免疫反应的共同途径着手，形成防治哮喘的另一方法。也在实验中证明了其功效，并发表于《中华结核和呼吸病杂志》2009年第9期。PVAXI是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种真核表达载体，大小为3.0kb。该质粒用卡那霉素抗性筛选基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性筛选基因，能最大程度地减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性。PVAXl含有多个克隆酶切位点允许同时克隆多个大片段的目的基因，强含一段KozaK的翻译起始序列和一个起始密码子(ATG)以引导正确的翻译，典型的KozaK共有序列为“ANNATGG”，其-3位中的A启动子pCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白。pVAXI又是一种非融合载体，在插入序列中还需包括一个终止密码子以正确终止基因表达。PVAXl是由美国食品和药品管理委员会(FDA)推荐的可以应用于人体实验的载体质粒。但是，由于该先前报道的HSP70/CD80嵌合DNA疫苗中使用的载体均是pcDNA3.1，但是该载体具有氨苄青霉素的抗性，进行药品的制备时，会导致对氨苄青霉素敏感的生产者过敏反应，另外，该疫苗的应用效果也还不够理想。但pVAXI能否适用于装载HSP70/⑶80嵌合蛋白的编码基因，转载之后会有何效果，均无报道，也难以推断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有的pcDNA3.1-HSP70/⑶80嵌合疫苗药效还不够理想以及安全性不够好。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种新的嵌合型DNA疫苗。该嵌合型DNA疫苗为含有如下蛋白质(a)或(b)的编码基因并能在体内将其表达的的pVAXI质粒:(a) SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列所组成的蛋白质；(b)在SEQ ID N0.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有与(a)所述的蛋白质具有相同或相似功能的蛋白质。其中，上述蛋白质的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所述。其中，上述的编码基因连接在pVAXI质粒上，由pVAXI质粒的CMV启动子控制其表达。具体可以连接在连接在pVAXI质粒的多克隆位点上，由CMV启动子操纵其表达；如使用Xbal和Hind III双酶切的方式连入。其中，上述嵌合型DNA疫苗中所述pVAXI质粒的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。本发明还提供了上述的嵌合型DNA疫苗在制备预防或免疫治疗哮喘的药物中的用途。
本发明同时也提供了以上述的嵌合型DNA疫苗为主要活性成分制备成的预防或免疫治疗哮喘的药物。上述嵌合型DNA疫苗中的蛋白质编码基因序列是可操作地连于pVAXI质粒中，以使其能启动该蛋白质编码基因序列的转录。在以前于结核病及哮喘的防治研究中使用的载体是pcDNA3.1(+)，但是由于该载体具有氨苄青霉素的抗性，在大规模制备该载体以用于药品生产的过程中会导致对氨苄青霉素敏感的生产者过敏反应，所以考虑转用其他的载体进行嵌合型DNA疫苗的制备。在研发过程中意外的发现，并经过后继的实验证明使用PVAXI载体替换pcDNA3.1 (+)载体装载结核菌HSP70/人CD80嵌合蛋白的编码基因所制备成的嵌合型DNA疫苗，在用于哮踹的预防和治疗具有明显更好的效果，尤其是能诱导出更强的Thl型反应，也使实验对象的IFN-Y明显增高。在提高了嵌合疫苗的安全性的同时，还出人意料的大幅度地提高了药效，具有更好应用前景。
图1、pVAX1-Hsp70/CD80经内切酶Hind III和Xba I双酶切前后的琼脂糖电泳图。图2、Western blot 检测 pVAXl_Hsp70/CD80 转染 293T 细胞的蛋白质 24、46、72 小
时真核表达结果。图3、pVAX1-Hsp70/CD80mRNA各时段体内表达分布的RT-PCR结果。分别表示接种7天、接种15天、30天、180天后在体内体内表达分布的情况。图4、Rear time PCR检测IFN- Y和IL-4基因表达的结果。图5、预防性免疫+短期模型实验小鼠肺组织切片HEX400。A对照组气道周围少量炎细胞浸润哮喘组气管周围炎细胞浸润，其中有大量的嗜酸性粒细胞，气道上皮有损伤、断裂；C载体组气管周围炎细胞浸润，其中有大量的嗜酸性粒细胞；D疫苗组气管周围有炎细胞浸润明显减少。图6、不同浓度乙酰甲胆碱(mg/ml)刺激后各组气道阻力的变化图7、预防性免疫+短期模型实验各组小鼠BALF中IFN- Y和PGE2 (前列腺素2)水平。A:与哮喘组比较，HSP70/⑶80嵌合质粒组和对照组小鼠BALF中IFN-Y水平明显增高，差异有统计学意义/P < 0.05，η = 10 ；B:与哮喘组小鼠比较，HSP70/⑶80嵌合质粒组PGE2水平降低，差异无统计学意义.*P > 0.05，η = 10。图8、预防性免疫+长期模型实验各组小鼠BALF中IFN-Y和IL_4水平。A 与哮喘组比较，疫苗组和对照组小鼠BALF中IFN-Y水平明显增高，差异有统计学意义。*P
<0.050，η = 5 ；B:与哮喘组小鼠比较，疫苗组IL-4水平降低，差异无统计学意义。*P >
0.050，η = 5。图9、预防性免疫+长期模型实验各组小鼠T-bet、GATA_3基因的表达水平。与哮喘组相比，疫苗组GATA-3降低，T-bet/GATA-3升高差异有统计学意义(P < 0.050);各组T-bet差异无统计学意义(P > 0.050)。图10、治疗性免疫+短期模型实验小鼠肺组织切片X400。图11、治疗性免疫+短期模型实验各组小鼠CCR3和CCR5在脾脏组织的表达水平。疫苗组和哮喘组比较，CCR5/CCR3的比值升高，差异有统计学意义。图12、治疗性免疫+长期模型实验AB-PAS染色肺组织杯状细胞切片X400。图13、治疗性免疫+长期模型实验各组小鼠T-bet及GATA-3在脾脏组织的表达水平。疫苗组和哮喘组比较，T-bet/GATA-3的比值升高，差异有统计学意义。
具体实施例方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如 Sambrook J, Russell D.W., 2001,Molecular Cloning:A laboratory manual (3rded), Spring Harbor Laboratory Press中所述的条件。或按照制造厂商所建议的条件。实施例一本发明pVAX1-Hsp70/⑶80载体的构建和鉴定(一 )材料及试剂:pVAXI 质粒(invitrogen 公司)，LIP0FECTAMINE 2000 脂质体转染试齐[J(invitrogen 公司)内切酶 Hind II1、Xba I 和 T4 连接酶(NEB 公司)。PcDNA3.rHsp70/0)80质粒根据背景技术的记载构建。Hsp70单抗(Lifespan Biosciences公司)，0)80单抗(abeam公司)，Western blot试剂(上海碧云天生物公司)。( 二)构建过程将PcDNA3—Hsp70/CD80质粒、载体pVAXI经过内切酶Hind III和Xba I双酶切后，用T4连接酶将 目的基因Hsp70/⑶80连接到pVAXI上，构建成pVAX1-Hsp70/⑶80。将构建成的质粒送上海生工生物公司测序验证。(三)pVAXI_Hsp70/CD80鉴定:pVAX1-Hsp70/CD80经内切酶Hind III和Xba I双酶切前后的琼脂糖电泳图见图1。电泳结果符合预期，表明其建立成功。送上海生工生物公司测序后证实该质粒构建成功，其核苷酸序列见SEQ ID N0.3。实施例二本发明pVAX1-Hsp70/⑶80表达及生物分布检测(一 )真核表达验证将pVAX1-Hsp70/CD80 质粒 4 μ g (2 μ I)用 LIP0FECTAMINE 2000 脂质体转染试剂10 μ I包裹后转染到293Τ细胞，分别于24小时、48小时、72小时收获细胞，加入裂解液释放蛋白质，离心取上清与5χ上样缓冲液混勻并煮沸使蛋白质变性。SDS-page电泳、转膜。分别加入Hsp70、⑶80 —抗4°C孵育过夜，洗膜后二抗孵育一小时。洗膜后用化学发光法见70kD(Hsp70)和32KD(CD80)有单一条带(结果见图2)，说明该载体能同时表达Hsp70和CD80蛋白。(二)体内表达及分布检测实验动物:近交系BALB/c小鼠20只(第三军医大学)，6 8周龄，体重18 20g，实验动物均在独立通风换气笼(individually ventilated IVC)中饲养。纯化的pVAXI_Hsp70/0)80质粒DNA根据EndoFree质粒提取说明书(Qiagen公司，英国)获得，260/280nm的比例为=1.80。分装成IOOy g/ΙΟΟμ I存储于_80°C保存。实验分组:实验动物按接种时间分为5组(每组3只)-J天组、15天组、30天组和180天组；阴性对照小鼠为生理盐水组。布比卡因(Bbupivacaine)与质粒DNA结合后形成复合体保护并能够释放DNA,同时是一种麻醉剂，可刺激肌细胞再生，从而提高肌肉组织细胞吸入DNA和表达的能力，所以在此实验中作为佐剂。分别给每组小鼠股四头肌注射嵌合疫苗100 μ I和7.5g/L步比卡因混悬液25 μ 1，即(4: I)，共125 μ 1，含质粒100 μ g。对照组注射的是注射用水100 μ I。RNA的分离:pVAXl-Hsp70/CD80嵌合疫苗接种小鼠后分别于7、15、30、180天取眼球血以及肌肉、淋巴节、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织，冻存-80°C。总RNA的提取按照北京天根生物技术有限公司动物组织总RNA提取试剂盒进行，RT-PCR细胞总RNA反转录oligodT引物，按大连宝生物公司RT-PCR试剂盒说明书进行。RT-PCR结果(参见图3):接种7天组和接种15天组肌肉、淋巴结、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织均有Hsp70和⑶80表达。接种30天组在肌肉、肺和肝有Hsp70表达，未见CD80表达。180天组Hsp70/CD80天未检测出表达。Real-time-PCR(实时PCR)结果(参见图4):取7天和15天和30天和180天组小鼠脾脏cDNA用Real-time-PCR检测IFN-Y (y干扰素)和IL_4(白介素_4).其结果为七天和15天IFN- Y有高水平表达。pVAXl-Hsp70/CD80在小鼠体内分布检测结果:提取接种pVAXl_Hsp70/CD80的小鼠在7、15、30、180天的肌肉、淋巴节、骨髓、脾、肝、肺、肾、胸腺组织DNA，用Hsp70、CD80引物进行PCR扩增，均能扩增出Hsp70、⑶80基因。Hsp70 引物:上游(SEQ ID N0.4) AAT CgT gCg TgA CAT CAA AgA ；下游(SEQID N0.5):CCA AgaA Agg AAg get ggA AAA。CD80 引物:上游(SEQ ID N0.6) AgA ATg ATT ATC AAT CAC ；下游(SEQID N0.7):TTA gAT ATg CTg CAg AAg。说明Hsp70、⑶80质粒直到180天仍然分布在小鼠体内肌肉、淋巴节、骨髓、脾、肝、
肺、肾、胸腺组织。实施例三pVAX1-Hsp70/⑶80嵌合DNA疫苗对哮喘免疫保护作用及机制研究(一)试验方法。1、实验材料:兔抗小鼠PCNA(增殖细胞核抗原)单克隆抗体(mAb，北京博奥森公司)。去内毒素级质粒纯化系统(Qiagen 公司)。IFN- y , IL-4、IL-5，IL-9，IL-10，IL-13，IL-17，IL-23，TGF- β，OVA-sIgE ELISA检测试剂盒(ADL公司)，⑶4+⑶25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司)。SPF级雌性BALB/c小鼠。鸡卵清蛋白(OVA, Sigma产品)。402A雾化器(江苏鱼跃医疗设备有限公司)。DNA质粒的制备:用去内毒素级质粒纯化系统制备pVAX1-Hsp70/⑶80和PcDNA3.「HspTO/CDSO 质粒。⑶4+CD25+调节性T细胞制备:乙醚麻醉小鼠后，(5-1agen公司)制备超螺旋质粒DNA,以1000 μ g/ml浓度溶于生理盐水，分装后储_70°C，。雌性BALB/c小鼠分别于两侧大腿内侧肌肉共注射7.5g/L布比卡因混和100μ g(0.1ml)质粒pVAXl，pVAXl/HSP70/CD80125 μ I混悬物(4: I)三次，隔周一次。6周后处死小鼠，用⑶4+⑶25+调节性T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec公司)从脾脏组织中分离⑶4+CD25+调节性T细胞。2、实验分组造模及处理:
动物分组:雌性BALB/c小鼠按照随机数字表随机分组，空白对照组(简称对照组)、哮喘实验模型组(简称哮喘组)、pcDNA3.1-Hsp70/CD80嵌合DNA载体组(简称载体组)和pVAXl-Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗组(简称疫苗组)，每组10-20只。(1)预防性免疫+短期模型实验:免疫:乙醚麻醉小鼠后，分别于致敏前第42天，第28和第14天在载体组、疫苗组小鼠两侧大腿内侧肌肉共三次，每次)注射7.5g/L布比卡因混和100 μ g (0.1ml)pcDNA3.1-Hsp70/CD80，为小鼠股四头肌注射嵌合疫苗和7.5g/L疫苗100 μ I，步比卡因25 μ 1 (4: 1)，共125 μ 1，含质粒100 μ g。pVAXl-Hsp70/CD80和步比卡因混悬物(4:1)共125 μ 1 ;对照组和哮喘组注射生理盐水和7.5g/L布比卡因混悬物(4:1)(是pVAXl-Hsp70/CD80 (4)和步比卡因混悬物(1)比。共125μ1。免疫:乙醚麻醉小鼠后，分别于致敏前第42天，第28和第14天分别在载体组、疫苗组小鼠两侧大腿内侧肌肉各注射7.5g/L布比卡因混和100μ g(0.lml)pcDNA3.l_Hsp70/CD80的混悬物(4: 1) 125μ 1,7.5g/L布比卡因混和pVAXl_Hsp70/CD80的混悬物(4: 1) 125μ 1 ;对照组和哮喘组分别注射生理盐水和7.5g/L布比卡因的混悬物(4: 1)125 μ 1。致敏(开始致敏时为O天):小鼠于第O天，14天用新鲜配制的OVA和铝佐剂混悬物腹腔注射致敏。腹腔注射含鸡卵清蛋白(OVA) 100 μ g，氢氧化铝(Al (OH) 3) Img混合的生理盐水混悬液200 μ 1。对照组用生理盐水200 μ I腹腔注射。激发(开始激发为28天):第28天开始以500 μ g/ml OVA液雾化吸入激发，隔天I次，每次30分钟，共吸入7次。对照组则以生理盐水代替OVA液雾化吸入。(2)预防性免疫+长期模型实验免疫方法同上。致敏(开始致敏为O天):方法同上。激发(开始激发为28天):第28天开始以500 μ g/ml OVA液雾化吸入激发。于第28-32天，每天一次，每次30分钟。于35-70天，每周3次，连续6周。对照组则以生理盐水代替OVA液雾化吸入。(3)治疗性免疫+短期模型实验致敏(开始致敏为O天)方法同上。激发(开始激发为28天):第28天开始以500 μ g/ml OVA液雾化吸入激发，隔天I次，每次30分钟，共吸入7次。对照组则以生理盐水代替OVA液雾化吸入。治疗(开始治疗为第27天):第27天、第34天在载体组、疫苗组小鼠两侧大腿内侧肌肉注射 7.5g/L 布比卡因(25 μ 1)和 100μ g(100μ l)pcDNA3.l_Hsp70/CD80 共125 μ 1 的混悬物、7.5g/L(25 μ 1布比卡因和 100 μ g(100 μ l)pVAXl/Hsp70/CD80 的混悬物125 μ 1 ;对照组和哮喘组分别注射生理盐水(100 μ I)和7.5g/L(25y 1)布比卡因的混悬物共 125 μ 1。(4)治疗性免疫+长期模型实验致敏(开始致敏为O天):方法同上。激发(开始激发为28天):第28开始以500 μ g/ml OVA液雾化吸入激发。于第28-32天，每天一次，每次30分钟。于35-77天，每周3次，连续6周。对照组则以生理盐水代替OVA液雾化吸入。治疗(开始治疗为第56天):第56天，第63天和第70天，方法同上。3、指标检测方法(I)吸入乙酰甲胆碱(methacholine)后气道反应:末次激发后24h后，通过全身体积描记仪检测吸入乙酰甲胆碱后小鼠气道反应性，乙酰甲胆碱依次由低浓度开始激发，观察小鼠反应，BUXCO无创肺功能检测仪记录小鼠气道反应性监测指标Penh (enhancedpause)。在吸入乙酰甲胆碱检测气道反应后处死动物进行有关研究。(2)血清中OVA特异性IgE的测定:各组在戊巴比妥钠麻醉下小鼠眼球取血，离心取血清，转移到EP管中，保存于-80°C。采取血清标本后I个月内用ELISA法按操作说明测定。
(3)支气管肺泡灌洗液(BALF)收集:各组小鼠末次致敏24h后用戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，在环状软骨上用止血钳固定，其下方作横切口，置入连接注射器的硅胶管，注入37°C生理盐水400 μ 1，反复抽吸3次，回收BALF置于冰上，并记录回收量。BALF离心，取上清转移到EP管中，保存于_80°C。(4) IFN- Y、PGE2、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10，IL-13，IL-17，IL-23 浓度测定:将 BALF以1200rpm/min，离心lOmin，取上清液贮存于_80°C冰箱，在I个月内用ELISA法按操作说明测定各细胞因子的浓度。(5)支气管肺泡灌洗液(BALF)中WBC的计数与分类:用PBS重悬BALF中沉淀细胞作总细胞计数。另取细胞悬液涂于载玻片上，经姬母莎染液染色后对BALF中的WBC进行分类、计数。取重悬液50 μ 1，按1: 5比例加嗜酸性粒细胞(EOS)稀释液，用计数板直接计EOS 数。(6)组织学检查:处死小鼠后将肺组织置于4%多聚甲醛固定24h，常规制备病理切片，HE染色后，观察切片气道重塑形态学改变情况。用过碘雪夫酸(PAS)染色检测杯状细胞分泌黏液情况。Masson三色染色观察上皮下胶原沉积情况。采用免疫组化，检测支气管平滑肌PCNA的表达。检测支气管平滑肌凋亡情况。(7)脾脏，胸腺和肺组织的处理及检测指标取血后处死小鼠，打开腹腔和胸腔，分别摘取脾脏组织，胸腺组织和肺组织，将部分组织在低温下匀浆，离心后取上清。通过ELISA检测脾脏、胸腺和肺组织中IL-17，IL-23等表达水平。部分标本置于冻存管中，立即置于液氮中保存。通过Real-time PCR分别检测脾脏，胸腺和肺组织中T-bet、GATA-3、R0Ryt、Foxp3、IL-17A、IL-23等基因的表达水平。二、实验结果:1.预防性免疫+短期模型实验实验结果表明，用OVA诱发建立的哮喘小鼠模型，其气道炎症、气道反应性增高，BALF中IFN-Y降低等变化均为急性哮喘的典型改变。本研究在OVA致敏前用HSP70/CD80嵌合DNA疫苗连续三次免疫小鼠，结果发现，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明显抑制小鼠气道、肺泡和血管周围的炎症细胞浸润(P < 0.05)(见图5)，而且表现为气道阻力降低(P
<0.05)(见图6)，BALF上清液中IFN1、PGE2明显升高(P < 0.05)(见图7)。说明HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗能上调Thl反应，抑制Th2反应，促使IFN- Y分泌增多，不仅抑制了哮喘小鼠炎症反应，而且还降低哮喘小鼠的气道阻力。2.预防性免疫+长期模型实验用鸡卵清蛋白诱发建立慢性哮喘小鼠模型，慢性哮喘组小鼠气道反应性明显增高(P < 0.050);气道壁增厚，外径/内径(Po/Pi)等明显增加(P < 0.050);支气管上皮中PAS染色阳性的杯状细胞明显增多(P < 0.050);小支气管上皮下呈蓝色的胶原纤维明显增厚；支气管上皮下肌层增生明显，总平滑肌细胞和PCNA阳性的平滑肌细胞明显增多(P
<0.050)。这些变化均为哮喘气道重建的典型改变。在鸡卵清蛋白致敏前用HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗连续三次免疫小鼠，结果发现，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明显减轻慢性哮喘小鼠气道高反应性(P < 0.050)，降低外径/内径(Po/Pi)等气道重建相关的半定量参数水平(P < 0.050)，降低气道黏液分泌(P < 0.050)，阻止气道上皮下纤维化，减轻气道平滑肌增生(P < 0.050)，对慢性哮喘气道重建表现出了显著的抑制作用。且BALF上清液中IFN- Y ,IFN- Y /IL-4明显升高(P < 0.050)(参见图8);脾脏组织T-bet/GATA-3基因表达比率升高(参见图9)，可能说明高表达T-bet能通过调节IFN-Y的生成上调Thl反应，低表达GATA-3则抑制IL-4的生成抑制Th2反应。
3.治疗性免疫+短期模型实验实验结果表明，用OVA诱发建立的哮喘小鼠模型，其外周血中IgE水平明显增高，气道炎症、气道反应性增高，BALF中IFN-Y降低等变化均为急性哮喘的典型改变。OVA致敏后用HSP70/CD80嵌合DNA疫苗连续二次干预小鼠，结果发现，HSP70/CD80嵌合DNA疫苗能明显抑制小鼠气道炎症细胞浸润(参见图10)，且气道阻力降低。脾脏组织CCR5/CCR3基因表达比率升高(参见图11)，可能说明肥 70/^80嵌合DNA疫苗能上调Thl反应，抑制Th2反应，不仅抑制了哮喘小鼠炎症反应，而且还降低哮喘小鼠的气道阻力。4.治疗性免疫+长期模型实验慢性哮喘小鼠模型，炎性细胞浸润明显增多(P < 0.05);外周眼球血血清中IgE水平明显增高(P < 0.05);气道壁外径/内径(Po/Pi)增加，(P < 0.05);支气管上皮中AB-PAS染色阳性的杯状细胞数目增多明显(P<0.05);小支气管上皮下蓝色的胶原纤维增厚明显；支气管上皮下肌层增生明显，总平滑肌细胞和PCNA阳性的平滑肌细胞数目明显增多(P < 0.05)。在鸡卵清蛋白致敏小鼠后用HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗连续二次干预小鼠后，发现HSP70/⑶80嵌合DNA疫苗能明显减轻小气道炎症作用(P < 0.05)，降低慢性哮喘小鼠血清中IgE的水平(表2)，降低气道外径/内径(Po/Pi)的比值(P < 0.05)，减少杯状细胞的增生(P < 0.05)，减轻气道平滑肌增生(P < 0.05)，对慢性哮喘气道重塑表现出了明显的抑制作用(图12)。且HSP70/CD80嵌合DNA疫苗使BALF上清液中IL-5明显升高(P < 0.050)(表I) ；T-bet/GATA-3比率升高(图13)。本实验从特异性调控ThO细胞分化的转录因子T-bet和GATA-3入手，上调T-bet/GATA-3，进而去掉Th2的优势地位，增加Thl的生成。表I各组小鼠BALF中细胞因子IL-5含量的比较(pg/ml，)
权利要求
1.嵌合型DNA疫苗，其特征在于:为含有如下蛋白质(a)或(b)的编码基因的PVAXI质粒: (a)SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列所组成的蛋白质； (b)在SEQID N0.2限定的氨基酸序列中经过取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有与(a)所述的蛋白质具有相同或相似功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0.1所述。
3.根据权利要求1所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述的编码基因由pVAXI质粒上的CMV启动子控制其表达。
4.根据权利要求3所述的嵌合型DNA疫苗，其特征在于:所述pVAXI质粒的核苷酸序列为SEQ ID N0.3所示。
5.权利要求1 4任一项所述的嵌合型DNA疫苗在制备预防或免疫治疗哮喘的药物中的用途。
6.由权利要求1 4任一项所述的嵌合型DNA疫苗为主要活性成分制备成的预防或免疫治疗哮喘的药物。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于哮喘预防和免疫治疗的嵌合型DNA疫苗。本发明要解决的技术问题是现有的pcDNA3.1-HSP70/CD80嵌合疫苗药效还不够理想以及安全性不好。本发明的技术方案是提供一种新的嵌合型DNA疫苗。该嵌合型DNA疫苗为含有HSP70/CD80嵌合蛋白的编码基因并能在体内将其表达的的pVAXI质粒。使用pVAXI载体替换现有技术的pcDNA3.1(+)载体后，在哮踹的预防和治疗上具有更好的效果。尤其是能诱导出更强的Th1型反应，也使实验对象的IFN-γ明显增高。另外该载体具有的是卡纳霉素的抗性，不会导致任何过敏反应，能更好哮喘预防和免疫治疗。
文档编号A61K48/00GK103157113SQ20111040657
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者钟森, 史小玲, 钟林 申请人:钟森, 史小玲