专利名称：整合素阻断剂多肽ap25在制备治疗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制肿瘤血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的一种整合素阻断剂多肽AP25，此阻断剂是一种多肽，该整合素阻断剂多肽可用于实体肿瘤的治疗。
背景技术：
恶性肿瘤是人类健康的首要杀手。传统肿瘤治疗虽然具有一定疗效，但由于化学药物非特异的细胞毒性，对患者具有较大的毒副作用，同时还容易产生耐药性，给肿瘤患者带来巨大痛苦。从1972年R)lkman提出了肿瘤血管增生学说以来，通过抑制肿瘤血管增生来治疗肿瘤的报道大量涌现，并取得了巨大成功。肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巢癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。 新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤新生血管可以有效抑制肿瘤的发生、发展及转移。肿瘤新生血管受许多细胞因子调控，其中与肿瘤血管生成相关的重要肿瘤血管内皮细胞分子之一是整合素家族的部分成员。整合素是细胞表面一种重要的粘附分子，是多种细胞外基质成分的受体，广泛存在于细胞表面，是一个相当大的受体家族。整合素主要介导细胞与细胞及细胞与细胞外基质之间的相互粘附，对细胞的增殖、分化、迁移及凋亡起重要的调控作用，并在肿瘤诱导新生血管形成和肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用。整合素都是由一条α链和一条β链组成，两条链在与配体的结合中都起作用，不同的α链和β链的组合决定了配体的特异性。到目前为止，已发现15种α链和9种β链。在肿瘤细胞中，整合素的组分发生了复杂的变化，大体上讲，参与组织结构的整合素数量下降，而与细胞迁移有关的整合素数量上升。整合素α 5β 1、α ν β 5、α ν β 3等都与血管新生和细胞迁移有关，其中α ν β 3的作用尤为重要。α ν β3由α ν亚基(CD51，150kD)和β 3亚基(CD61， 105kD)形成的跨膜异二聚体糖蛋白，又名VN受体。α ν β 3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp，RGD)。这类配体包括FN、VN、TSP_1和vWF等。α ν β 3可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合，参与肿瘤的血管生成，侵袭转移、 炎症、伤口愈合和凝血等生理和病理过程。如α ν β 3能够与金属蛋白酶结合，降解细胞外基质，从而更有利于侵入。此外，两个受α ν β3影响的过程是细胞凋亡和血管新生，在参与血管新生的毛细血管内皮细胞上，α ν β3的表达量也升高。在肿瘤血管内皮细胞中，血管生长因子类与整合素的表达有着密切的关系，如VEGF、FGF都能够上调α ν β 3的表达。 整合素α ν β3在多种恶性肿瘤细胞表面和肿瘤组织新生血管内皮细胞膜高表达，而在成熟血管内皮细胞和绝大多数正常器官系统不表达，为设计含有RGD序列的α ν β3配体小分子拮抗肽和α ν β3的单克隆抗体来治疗肿瘤提供理论基础。目前，国际上开发出的针对整合素的抑制剂主要是特异性抗体，如Vitaxine;或小分子配体抑制剂，如西仑吉肽等。还有一些整合素阻断剂已进入II期临床，而我国尚未有相似或同类产品进入市场。因此，非常有必要开发我国自主知识产权的此类药物。ZL200510040378. 5高效抑制血管生成多肽及其制备方法和应用，介绍几种整合素抑制剂， 其一为整合素阻断剂多肽序列为=Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2_3)(命名为AP25，1 kq. NO. 1)，该序列包含了整合素配体序列(Ala-Cys-As p-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly)(见 kq. NO. 2)和新生血管抑制序列 (Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro)(见 kq. NO. 3)，其中整合素配体序列中含有 RGD-4C序列(Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly)(见 kq. NO. 4)，使该多肽序列可以有效地结合于肿瘤特异性表达的整合素亚型，并且该序列中含有新生血管抑制序列，能够抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。先前专利中只是对黑色素瘤做了研究，本发明针对该序列做了进一步研究，发现其对多种肿瘤有治疗作用，增加了其适用症，拓展了其社会价值和经济价值。
发明内容
发明目的本发明针对序列Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gl y-IIe-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有两对二硫键，配对方式为 1-4,2-3)做了进一步研究，发现其对多种实体肿瘤有治疗作用，增加了其适应症。技术方案整合素阻断剂多肽AP25在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中所述的整合素阻断剂的序列为 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg -Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (序列中含有两对二硫键，配对方式为1_4、2_3)(命名为AP25，见kq. NO. 1)，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。有益效果研究发现，序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro 是内皮抑素的第60-70个氨基酸，在体外具有很好的抑制肿瘤新生血管生成的活性，其活性甚至高于内皮抑素本身。RGD-4C序列是整合素的一个重要配体。因此，含有RGD-4C序列的多肽Ala-C ys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly 能够特异性的识别整合素。本发明的整合素阻断剂多肽是在具有抑制血管生成作用的序列Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg -Ala-Ala-Val-Pro的N端连接上与整合素家族具有亲和性和结合能力的RGD-4C序列Ala -Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly,构建了一种与整合素有高亲和性和结合能力的多肽。该整合素阻断剂多肽序列为Ala-CyS-ASp-CyS-Arg-Gly-ASp-CyS -Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro，其含有 25 个氨基酸，分子中RGD-4C序列具有整合素亲和性和结合能力。研究表明此整合素阻断剂多肽主要作用靶点为整合素α ν、α 5亚基，并且该序列中含有新生血管抑制序列，从而抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。虽然在先前的专利ZL200510040378. 5公开了该序列对黑色瘤有治疗效果，但并未公开对其他肿瘤有治疗效果。国内外大量的研究表明即使是同一组织类型、分化程度相同的肿瘤，对同一药物的敏感性也有可能不同，因此，药物开发中对某一分子需要进行抗肿瘤谱的筛选。因为有些药物只对特定肿瘤细胞有效，对其他肿瘤是无效或低效，因此需要实验去摸索和验证其治疗效果。发明人经过大量实验获知该整合素阻断剂靶点明确，在体外能够明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移、增殖及管状结构的形成，对人的某些肿瘤细胞的增殖也有抑制作用。体内实验具有明显的抗肿瘤效果，且副作用小、用量少、成本低。说明本发明设计的整合素阻断剂多肽科学、合理、可行有效，能作为制备治疗人类实体肿瘤的治疗药物，极大拓展了该整合素阻断剂的治疗谱，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。以下所述的整合素阻断剂多肽指的是整合素阻断剂多肽AP25。
附图1人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞粘附实验确定多肽的作用靶点；附图2整合素阻断剂多肽抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖作用；附图3整合素阻断剂多肽抑制人胃癌MGC-803细胞的增殖作用；附图4整合素阻断剂多肽抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖作用；附图5整合素阻断剂多肽抑制人结肠癌HCT 116细胞的增殖作用；附图6整合素阻断剂多肽抑制人脑胶质瘤U87细胞的增殖作用；附图7整合素阻断剂多肽抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖作用；附图8整合素阻断剂多肽抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移作用；附图9整合素阻断剂多肽抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的管状结构形成作用；附图10整合素阻断剂多肽对人鼻咽癌CNE裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图11整合素阻断剂多肽对人脑胶质瘤U87裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图12整合素阻断剂多肽对人甲状腺癌SW-579裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图13整合素阻断剂多肽对人胰腺癌SW-1990裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图14整合素阻断剂多肽对人肺癌H460裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图15整合素阻断剂多肽对人肝癌Bel-7402裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图16整合素阻断剂多肽对人食管癌Ecl09裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图17整合素阻断剂多肽对人胃癌MGC-803裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图18整合素阻断剂多肽对人乳腺癌MDA-MB-231裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图19整合素阻断剂多肽对人肾癌A498裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图20整合素阻断剂多肽对人胆囊癌GBC-SD裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图21整合素阻断剂多肽对人结肠癌HT-四裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图22整合素阻断剂多肽对人卵巢癌SK-0V-3裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图23整合素阻断剂多肽对人子宫内膜癌HHUA裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；
附图M整合素阻断剂多肽对人宫颈癌HeLa裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图25整合素阻断剂多肽对人前列腺癌DU-145裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图沈整合素阻断剂多肽对人膀胱癌HT1376裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图27整合素阻断剂多肽对人睾丸癌5637裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；附图观整合素阻断剂多肽对肉瘤HT-1080裸鼠异种移植肿瘤生长抑制作用；
具体实施例方式实施例1整合素阻断剂多肽靶点分析采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)粘附实验确定整合素阻断剂多肽的作用靶点。即先用一定浓度的多肽铺96孔板，HUVEC细胞分别用不同的整合素亚基抗体孵育后进行粘附实验。与未用抗体孵育的细胞相比，如果用某种抗体孵育过的细胞对多肽的粘附明显减少，则说明此多肽通过该整合素亚基与HUVEC作用。具体操作如下将多肽用PBS配制为 150μ g/ml的溶液，按每孔100μ 1铺96孔板，4°C放置16小时后BSA于22°C水浴中封闭4 5小时。HUVEC细胞(只用第2 5代)在37°C、5% CO2的培养箱中培养至90% 以上的汇合度时用无血清内皮细胞培养液孵育4小时。胰蛋白酶消化收集细胞，用无血清内皮细胞培养液重悬并计数，将细胞浓度调整为5X105个/ml。将细胞分别用α ν、β 3、 α ν + β3、α5、β 1、α5+β 1整合素亚基抗体于4°C孵育2小时，并每隔一段时间震荡细胞悬液，使细胞与抗体充分接触。弃去96孔板中的BSA，铺入细胞，每孔100 μ 1细胞悬液(每组设5个复孔)，于37°C粘附90分钟。用PBS轻轻洗去未粘附的细胞后用甲醇-考马斯亮蓝混合液染色并固定40分钟。用脱色液润洗96孔板，除去考马斯亮蓝背景。向96孔板中加入1 % SDS,每孔100 μ 1，混和均勻于620nm处测吸光值。结果见图1，用α ν、α ν + β 3、α 5、α 5+β 1整合素亚基抗体孵育组的细胞粘附数量与未用整合素亚基抗体孵育组相比具有极显著性差异；用β3整合素亚基抗体孵育组的细胞粘附数量与未用整合素亚基抗体孵育组相比具有显著性差异；用β 1整合素亚基抗体孵育组的细胞粘附数量与未用整合素亚基抗体孵育组相比具无显著性差异。由此可以判断，此整合素抑制剂多肽主要通过α ν、α 5两种整合素亚基与HUVEC细胞相互作用。实施例2整合素阻断剂多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖抑制试验采用MTT法检测整合素阻断剂多肽抑制内皮细胞生长的活性，内皮细胞只用第 2-6代。HUVEC细胞在37°C、5% CO2的培养箱中培养至90%以上的汇合度时用胰蛋白酶消化收集，用培养液重悬细胞并在显微镜下计数，将细胞浓度调整为3 X IO4个/ml，将细胞悬液接种到96孔板中，100 μ 1/孔，并于37°C，5% CO2培养箱中培养过夜。整合素阻断剂多肽用培养液稀释到各个预定浓度。恩度用培养液稀释到终浓度。待细胞完全贴壁后，将各个稀释液分别加入96孔板中(ΙΟΟμΙ/孔)。以加入整合素阻断剂多肽稀释液的作为给药组， 以加入恩度、紫杉醇作为阳性对照组，以不加任何药物的培养液作为阴性对照组。在37°C， 5% CO2培养箱孵育72h。向96孔板中加入5mg/ml的MTT，每孔20 μ 1，继续培养4h。吸掉培养基，每孔加入100 μ 1DMS0溶解，摇床10分钟轻轻混勻。用酶标仪在测定波长为570nm，参比波长为630nm处测定吸光值，并计算生长抑制率(proliferation inhibition，PI)，公式如下PI(% ) =1-给药组/阴性组试验得到的结果以mean士SD表示，并进行统计T检验，*P < 0. 05为显著性差异， "P <0.01为极显著性差异。表1.整合素阻断剂多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖抑制作用
权利要求
1.整合素阻断剂多肽AP25在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中所述的整合素阻断剂的序列为 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-A rg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro,其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠、直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发、继发的癌以及肉瘤。
全文摘要
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制肿瘤血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的一种整合素阻断剂，此阻断剂是一种多肽，该整合素阻断剂多肽可用于实体肿瘤的治疗。该整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中所述的整合素阻断剂的序列为Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(序列中含有两对二硫键，配对方式为1-4、2-3)，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑、甲状腺、胰腺、肺脏、肝脏、食管、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫、子宫颈、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌以及肉瘤。本发明其极大拓展了该整合素阻断剂的治疗谱，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。
文档编号A61K38/16GK102488890SQ20111044303
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者徐寒梅, 杨永晶, 胡加亮 申请人:中国药科大学