结合于161p2f10b蛋白的抗体药物偶联物(adc)的制作方法

专利名称：结合于161p2f10b蛋白的抗体药物偶联物(adc)的制作方法
技术领域：
在此所述的发明涉及结合称为161P2F10B蛋白的其抗体药物偶联物(ADC)。本发明进一步涉及用于治疗癌症的预测、预防和治疗方法以及组合物。
背景技术：
癌症是在冠状动脉疾病之后的人类死亡的第二主要原因。全世界每年有数百万人死于癌症。仅在美国，如美国癌症协会报告的，每年癌症造成超过50万人死亡，每年有超过120万新诊断的病例。虽然源于心脏病的死亡正在显著地降低，总体上癌症引起的死亡不断升高。在下个世纪的早期，癌症被预测为死亡的主要原因。在世界范围内，几种癌症显著地成为主要杀手。很少例外地，源于癌的转移性疾病是致命的。此外，甚至对于最初从他们原发癌症幸存的那些癌症病人，通常的经验显示他们的生活被显著地改变。许多癌症病人经受由知晓复发可能性或治疗失败驱使的严重焦虑。许多癌症病人在治疗之后经历身体虚弱。此外，许多癌症病人经历复发。当前面鉴定的标志物例如PSA、PSM、PCTA以及161P2F10B有助于诊断和治疗前列腺癌的努力时，对于鉴别前列腺和相关癌症另外的标志物以及治疗目标从而进一步改善诊断和治疗存在需要。目前在美国肾细胞癌(RCC)是排在第10位癌症死亡的主要原因。在美国估计每年可以诊断出51，190人患有肾细胞癌并且在2007年约12，890人死于该疾病(美国癌症协会)。历史地看，治疗主要集中在肾切除术，紧接着是非特异性免疫疗法，以及有时放射疗法(Hauke, 2006)。非特异性免疫疗法包括用细胞因子白介素_2或干扰素-α作为单剂亦或联合地进行治疗。在手术切除之后，在1-3年内20-30%的病人将发展出转移性疾病，通常在肺部(Motzer等人，2006)。患有转移性疾病病人的生存中值是约13个月(Cohen andMcGovern, 2005)。从2005年以来，FDA已经批准六(6)种试剂用于治疗晚期肾细胞癌。这些进步包括靶向暗含在肾细胞癌中特定途径的几种试剂。这些试剂包括索拉非尼(Nexavart),于2005年12月获FDA批准)、舒尼替尼(Sutent ,于2006年I月获FDA批准)、temsir。Iimus(Torisel ,于2007年5月获FDA批准)、依维莫司(Affinitor ,于2009年3月获FDA批准)、贝伐单抗(Avastin 与干扰素α联合，于2009年8月获FDA批准)以及帕唑帕尼(Votrient 于2009年10月或FDA批准)。然而，虽然在治疗方面有了进步，转移性肾细胞癌仍然是不可治愈的并且基于总存活率的优点仅temsirolimus获得批准。另外地，肝细胞癌(即，癌的癌症)占全部肝癌的80_90%。与女人相比较，这种类型的肝癌更常见地出现在男人体内。它通常见于50-60岁年龄人体内。通常地，肝癌的治疗 是大胆的手术或可以成功地治疗小型或慢速生长肿瘤(如果它们被早期诊断的话)的肝移植。然而，很少有病人被早期诊断。化学治疗和放射治疗通常不是有效的。然而，使用这些治疗来使肿瘤收缩使得手术具有更大的成功可能性。现在甲苯磺酸索拉非尼(Nexavar )可用于患有肝癌的病人。肝癌病人的预后通常是较差的，因为仅10-20%肝细胞癌可以使用手术去除。因此，对于开发用于治疗肝癌的试剂存在需要。单克隆抗体(mAb)的治疗实用性得以实现(G. Kohler and C. Milstein, Nature256:495-497 (1975))。现在单克隆抗体已经批准作为移植、癌、传染病、心血管疾病以及炎症中的治疗。不同的同种型具有不同的效应子功能。功能上的这类差异反映在不同免疫球蛋白同种型截然不同的3维结构中(P. M. Alzari, et al.，Annual Rev.Tmmunol.,6:555-580 (1988))。因为小鼠可方便地用于免疫并且将大多数人类抗原识别为外来物，抗具有治疗潜力的人类靶物质的mAb典型地具有鼠类起源。然而，作为人类治疗剂鼠类HlAb具有固有的缺点。因为与人类抗体相比较，在人体中mAb具有更短的循环半衰期，它们需要更频繁地给药。更关键地，将鼠类抗体反复施用到人类免疫系统中通过将小鼠蛋白识别为外来物并且产生人抗小鼠抗体(HAMA)应答引起人类免疫系统产生应答。这类HAMA应答可以导致变态反应以及从系统中快速清除鼠类抗体由此通过无用的鼠类抗体给予治疗。为了避免这类影响，已经尝试了在小鼠体内产生人免疫系统的多种尝试。最初的尝试希望产生能够用具有人序列的抗体对抗原进行应答的转基因小鼠(参见 Bruggemann, et al.，Proc. Nat’ I. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)),但是受通过可用于克隆载体可以稳定地维持的DNA数量限制。酵母人工染色体(YAC)克隆载体的使用引导了将人Ig基因座较大种系片段引入到转基因哺乳动物体内的途径。基本上地，使用YAC将在人类基因组和人类恒定区中找到的以相同间隔安排的大部分人类V、D、和J区基因弓I入到小鼠体内。一种这样的转基因小鼠品系称为XenoMouse 小鼠，并且可从AmgenFremont 公司(Fremont CA)商购。

发明内容
本发明提供了结合到161P2F10B蛋白上的抗体药物偶联物(ADC)。在一些实施方案中，本发明包括与治疗剂偶联的完全人类抗体。本发明进一步提供了不同的免疫原性或治疗性组合物，例如抗体药物偶联物，以及用于治疗癌症(例如在表I中列出的组织癌症)的策略。本发明涉及[I]包括特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其抗原结合片段的一种抗体药物偶联物，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列=SEQID NO:7的VHg，从20至142，以及SEQ ID NO:8的Vl区，从20至127并且其中所述抗体偶联到单甲基auristatin F上(MMAF)。[2] [I]的抗体药物偶联物，其中该抗原结合片段是一种Fab、F(ab' )2*Fv片段。[3] [I]的抗体药物偶联物，其中该抗体是一种完全人类抗体。
[4] [I]的抗体药物偶联物，它是重组地生产的。[5]处于人类单位剂量形式的包括[I]的抗体药物偶联物的一种药物组合物。[6] [5]的药物组合物，其中该组合物是用于癌症治疗。[7] [6]的药物组合物，其中该癌症是肾癌或肝癌。[8]抑制受试者体内癌细胞生长的一种方法，包括将[I]的抗体药物偶联物施用到所述受试者体内。[9]将细胞毒性剂或诊断剂递送到细胞中的一种方法，包括提供偶联到特异性地结合于包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其抗原结合片段上的MMAF，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID勵:7的￥11区，从20至142，以及SEQ ID NO: 8的'区，从20至127，从而形成一种抗体药物偶联物；以及将该细胞暴露于该抗体药物或片段药物偶联物。[10] 一种用于治疗哺乳动物体内肿瘤的方法，包括用有效数量的[I]的抗体药物偶联物来治疗该哺乳动物。[11] 一种用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的方法，包括用有效数量的[I]的抗体药物偶联物与辐射的组合来治疗该哺乳动物。[12]用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的一种方法，包括用有效数量的[I]的抗体药物偶联物与一种化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。[13]用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的一种方法，包括用有效数量的[I]的一种抗体药物偶联物和一种药物或生物活性治疗的组合来治疗该哺乳动物。[14]用于治疗哺乳动物体内癌症的一种方法，包括用有效数量的[I]的一种抗体药物偶联物和一种化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。[15] 一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有式L-(LU-D) p，其中(a)L是包括特异性地结合到包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体或其抗原结合片段的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID N0:7的％区，从20至142，以及SEQ ID NO:8的Vl区，从20至127 ;(b)LU是一种接头；(c)D是要求药物部分，其中该药物是单甲基 auristatin F(MMAF) ; (d)p 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。[16] 一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有下式，其中Ab-S是包括特异性地结合到包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体或其抗原结合片段的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID N0:7的VHg，从20至142以及SEQ ID N0:8 的 Vl 区，从 20 至 127 ;p 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。
Ab-S 义 ο
O。八 O、。 O、O 0人〇“:...」J
P[17]包括特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体的一种抗体药物偶联物，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID N0:7的重链，从20至468，以及SEQ ID NO:8的轻链，从20至233，并且其中所述抗体偶联到单甲基auristatin F(MMAF)上。 [18] 一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有式L-(LU-D) p，其中(a)L是包括特异性地结合到包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体的抗 体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID NO: 7的重链，从20至468以及SEQ IDNO:8的轻链，从20至233 ;(b) LU是一种接头；(c)D是一种药物部分，其中该药物是单甲基auristatin F(MMAF) ; (d)p 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。[19] 一种抗体药物偶联物(ADC)，其中该ADC具有下式，其中Ab-S是包括特异性地结合到包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白上的一种抗体的抗体，并且其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID NO:7的重链，从20至468以及SEQ ID NO:8的轻链，从 20 至 233 ；p 是 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。
Ab-Sx/
)p


图I. 161P2F10B的cDNA和氨基酸序列示于图I中。开放阅读框从核酸44-271延伸，包括终止密码子。图2. 161P2F10B抗体的核酸和氨基酸序列。图2A. H16-7. 8重链的cDNA和氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是重链可变区。虚下划线显示人IgG2恒定区。图2B. H16-7. 8轻链的cDNA和氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是轻链可变区。虚线下划线显示人IgK恒定区。图3. 161P2F10B杭体的氡某酸序歹1丨。图3A. H16-7. 8重链的氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是重链可变区。虚线下划线显示人IgG2恒定区。图3B. H16-7. 8轻链的氨基酸序列。加下划线的是前导序列并且加双下划线的是轻链可变区。虚线下划线显示人IgK恒定区。图4.H16-7. 8杭体与人类种系的比对。
图4A. H16-7. 8重链与人类种系VH4-31/D5-12/JH6的比对图4B. H16-7. 8轻链与人类种系A26/JK1的比对图5.在CHO细朐中H16-7. 8的重纟目表汰。将H16-7. 8重链和轻链序列克隆到表达载体中。将这些载体转染到CHO细胞中。用来自杂交瘤亦或来自CHO细胞的H16-7. 8将3T3-对照和3T3-161P2F10B细胞染色。通过流式细胞术来检测结合。结果显示在CHO细胞中重组地表达的H16-7. 8被分泌并且特异性地结合到细胞表面161P2F10B上。图6. H16-7. 8和H16-7. 8mcMMAF的细朐结合和亲合件。针对与在Ku812细朐h内源性地表达的161P2F10B的结合亲合性对H16-7. 8和H16-7. 8mcMMAF进行测试。简言之，在4° C 下在 160nM 至 O. OOOlnM 的终浓度下使 H16-7. 8 或 H16-7. 8mcMMAF 的^^一(11)个稀释 物与Ku812细胞(50，000个细胞/孔)一起孵化过夜。在孵化结束时，在4° C将细胞洗涤并且与抗-hlgG-PE检测抗体一起孵化45分钟。在洗涤未结合的检测抗体之后，通过FACS对这些细胞进行分析。获得平均荧光强度(MFI)值(参见表IV)。将MFI值输入到GraphpadPrisim软件中并且使用Y=Bmax*X/ (Kd+X)的单位点结合(双曲线)等式进行分析从而产生H16-7. 8 或 H16-7. 8mcMMAF 饱和曲线(示于图 6 中)。Bmax 是 H16-7. 8 或 H16-7. 8mcMMAF 最大地结合到161P2F10B上的MFI值；Kd是H16-7. 8或H16-7. 8mcMMAF结合亲合性，它是达到半最大结合所需要的H16-7. 8或H16-7. 8mcMMAF的浓度。在Ku812细胞表面上内源性地表达的161P2F10B上H16-7. 8和H16-7. 8mcMMAF计算的亲和性(Kd)对应地是O. 06nM和O. 19nMo图 7.将 H16-7. 8 和 H16-7. 8mcMAF 结合到肾癌细胞上。用 10 μ g/ml 天然 H16-7. 8、H16-7. 8mcMMAF、或同种型对照人IgG2对人UGK-3细胞(病人衍生的透明细胞肾癌)和RXF-393细胞(透明细胞肾癌)进行染色，并且通过FACS进行评估。图7中(左图)的结果证明用H16-7. 8对两种不同肾肿瘤细胞的强染色(灰色线)，但是使用对照MAb则没有(填充的直方图)。右侧图证明用H16-7.8mcMMAF对相同肾肿瘤细胞类似的强染色(灰色线)(图7，右图)。这些结果显示H16-7. 8和H16-7. 8mcMMAF两者结合在人癌细胞表面上表达的天然161P2F10B抗原。偶联天然H16-7. 8从而产生H16-7. 8mcMMAF不改变它细胞表面结合到在人癌细胞上表达的天然161P2F10B抗原上。图8.通过H16-7. 8mcMMAF得到的细胞毒件。在第O天将2000个有活力的KU812细胞一式三份地铺板并且允许恢复过夜。第二天，添加H16-7. 8mcMMAF或与mcMMAF结合的对照MAb的不同批次的1:4连续稀释物从而产生终浓度。这些细胞允许孵化六(6)天，这时将20μ I阿尔玛蓝添加到各孔中。将这些孔板孵化另外四(4)小时并且使用540ηΜ激发波长和620ηΜ发射波长在荧光酶标仪上读取荧光强度。这些结果显示Η16-7. 8mcMMAF的两个批次都有效地抑制KU812细胞的增殖。针对批次(I)和批次(2)确定IC 50对应地是O. 2nM和O. InM。未结合KU812细胞的完全人类对照MAb与mcMMAF相偶联从而产生3. 9 (+/-0. 2)的DAR。对照ADC (对照mcF)未抑制KU812细胞增殖，进一步证明细胞毒性的特异性。因此，这些结果表明H16-7. 8mcMMAF可以选择性地将细胞毒性药物递送到表达161P2F10B的细胞中，导致将它们杀死。图9.在SCID小鼠体内皮下津立的人肾癌异种移棺物UG-K3中H16-7. 8mcMMAF的疗效。在这个实验中，通过在SCID小鼠体内连续地传代来维持病人衍生的人肾癌异种移植物UG-K3。无菌地收获大块肿瘤并且切碎成小块。使用Liberase Blendzyme (Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)将这些肿瘤块酶消化成单细胞悬浮液。将I. 5X IO6个细胞注射到个体SCID小鼠的侧腹中并且允许肿瘤未处理地生长直至它们达到IOOmm3的大致体积。将动物随机地分配到下面同龄组中H16-7. 8mcMMAF治疗组、H16-7. 8对照以及5%右旋糖对照。通过静脉推注在第O天以10mg/kg剂量将H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8给药一次。所施用的H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150 μ L的剂量施用5%右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约IOOOmm3时，将对照组动物人道地安乐处死。在处死之前对Η16-7. 8mcMMAF治疗组动物进行监测持续另外两周。当两个对照组的数据可供使用时在最后时间点使用具有α =0.05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析。结果证明在所检查的所有剂量和方案下用Η16-7. 8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞异种移植肿瘤导致对SCID小鼠体内肿瘤生长的显著抑制。图10.通讨H16-7. 8mcMMAF实现律立的if位UG-K3异种移棺物的牛长抑制。俥用 病人衍生的UG-K3肿瘤异种移植物对H16-7. 8mcMMAF抑制建立的正位生长的肾肿瘤生长的能力进行评估。简言之，的第O天对大块的UG-K3肿瘤进行酶消化并且以手术方式将150万活细胞植入到雄性SCID小鼠的肾中。这些肿瘤允许生长7天，这时将动物随机分成4个不同治疗组(n=10/组)。随机分到组A的动物接受5mpk的对照ADC。组B接受3mg/kg的H16-7. 8mcMMAF并且组C接受5mg/kg的H16-7. 8mcMMAF,每4天进行给药持续共4个剂量。组D接受10mg/kg的H16-7. 8mcMMAF 一次。在研究结束时(第41天)，将动物处死并且在电子天平上对右肾和左肾进行称重。通过从携带肿瘤的右肾重量中减去无肿瘤对侧肾的重量来确定在图上绘制的肿瘤重量。这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7.8mcMMAF治疗UG-K3肾透明细胞异种移植肿瘤导致肿瘤生长的显著抑制。在所有H16-7. 8mcMMAF治疗组中肿瘤重量(B、C、以及D)比对照治疗组中肿瘤重量少1%。这些差异是高度统计显著的(p〈0. 0001, AN0VA)。图11·在SCID小鼠体内皮下津立的人肾癌异种移棺物RXF-393中Η16-7. 8mcMMAF的疗效。在这个实验中，将人肾癌细胞RXF-393 (O. 5X IO6个细胞/小鼠)注入个体小鼠的侧腹中并且这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到IOOmm3的大致体积。然后将动物随机地分配到下面同龄组中H16-7. 8mcMMAF治疗组、H16-7. 8治疗组以及5%右旋糖对照。通过静脉推注以10mg/kg的剂量每周一次地施用H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8持续共两个剂量。所施用的H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150 μ L的剂量施用5%右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测直至研究结束。将肿瘤体积计算为宽度X长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。当肿瘤达到约IOOOmm3时，将对照组动物人道地安乐处死。在处死之前对Η16-7. 8mcMMAF治疗组动物进行监测持续另外两周。这些结果证明在所检查的所有剂量和方案下用H16-7. 8mcMMAF治疗RFX-393人肾癌异种移植肿瘤导致SCID小鼠体内肿瘤生长的显著抑制。当两个对照组中的数据可供使用时在最后时间点使用具有α =0. 05的克鲁斯凯-沃利斯检验进行统计分析图12.在SCID小鼠体内皮下津立的人肾癌SKRC-01中与Η16-7. 8mcMMAF相比较H16-7. 8的疗效研究。将人肾癌细胞SKRC-Ol (O. 8X IO6个细胞/小鼠)注射到个体小鼠的侧腹中。这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到IOOmm3的大致体积。在第O天当肿瘤达到IOOmm3时，将动物随机地分配到下面同龄组中H16-7. 8mcMMAF治疗组、H16-7. 8治疗组以及5%右旋糖对照。通过静脉推注每四天以4mg/kg的剂量施用H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8持续共四个剂量。所施用的H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150 μ L的剂量施用5%右旋糖对照。每3至4天使用测径器测量来监测肿瘤生长。将肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小的尺寸并且长度是最大的。这些结果显示ADC Η16-7. 8mcMMAF显著地抑制了 SKRC-Ol肿瘤形成的生长而裸MAb H16-7. 8没有影响。因此，与裸抗体H16-7. 8相比较，ADC H16-7. 8mcMMAF具有显著地更突出的影响。图13.在SCID小鼠体内皮下律立的UG-K3中与其他161P2F10B杭体药物偶联物(ADC)相比较H16-7. 8mcMMAF的疗效研究。在另一个实骀中，将人肾癌细朐UG-K3 (I. 5 X IO6·个细胞/小鼠)注射到个体小鼠的侧腹中。这些肿瘤允许未处理地生长直至它们达到IOOmm3的大致体积。在第O天当肿瘤达到IOOmm3时，将动物随机地分配到下面同龄组中H16-7. 8mcMMAF、H16-7. 8vcMMAE、以及 H16-1· I ImcMMAF,以及 H16-1· llvcMMAE.PBS 对照、以及对照MAb-vcMMAE治疗组中。在第O天以10mg/kg剂量将所有抗体药物偶联物(ADC)施用一次。所施用的每种ADC的数量是基于在给药之前立即获得的每个动物的个体体重。以每个动物150 μ /L的剂量施用PBS对照。每3至4天使用测径器测量对肿瘤生长进行监测。将肿瘤体积计算为宽度2X长度/2，其中宽度是最小尺寸并且长度是最大的。这些结果显示这些ADC Η16-7. 8vcMMAE和H16_l. IIvcMMAE未抑制肿瘤形成生长。另外地，在第一个三十(30)天期间H16-7. 8mcMMAF和H16-1. IImcMMAF两者都显著地抑制UG-K3肿瘤形成的生长。在第三十(30)天之后，当与H16-1. IlmcMMAF相比较时，H16-7. 8mcMMAF具有显著地更突出的影响。图14. H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8的肽图。用二硫苏糖醇对得到的H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8进行处理用来还原二硫键，紧接着将得到的游离半胱氨酸烷基化。在这个步骤中使用胍来确保该蛋白完全变性。在透析以便去除胍之后，用特异性蛋白内切酶Lys-C对样品进行消化。Lys-C切割赖氨酸残基C端侧上的肽键。通过结合质谱法的反相层析法对得到的肽进行分析。在H16-7. 8mcMMAF与H16-7. 8之间对峰的反相保留时间和观察到的质核比进行比较。使用偶联到WATERS Q-TOFp质谱仪上的WATERS AcquityUPLC进行LC-MS (液相层析法-质谱法)分析。将消化的样品应用到YMC C18柱上并且用包含三氟乙酸的乙腈梯度进行洗脱。这些结果显示与天然抗体相比较在偶联的抗体中通过星号指示的峰强度是减少的。用箭头标记的峰表示在偶联的抗体肽图上出现的新峰。尤其地，用星号亦或用箭头标记的峰被认为对应地是指定用于偶联的肽以及得到的偶联肽。图15. (*)峰的质谱图。这#结果显示在图14中用星号标记的峰的质谱图的一部分。在偶联期间改变的信号的质量值是通过“加号”符号指示的。具有大致m/z 970. 4的这种肽(+3电荷状态)被鉴定为C225-K250，它是源于重链的铰链区并且包含预期的结合位图16.在619. 4m/z下在H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8的肽图上MSE的提取离子层析图(XIC)。为了鉴别这些新出现的峰(这些峰被认为是上面图14中的偶联肽)，使用升高能量(MSE)数据采集技术来进行LC-MS分析。该图显示使用m/z 619. 4针对H16-7. 8mcMMAF和H16-7. 8肽图的提取离子层析图(XIC)。该离子相应于药物部分的碎片离子。对于在图14中用箭头标记的峰而言在619. 4下在XIC中观察到的峰几乎是完全相同的。此外，在天然抗体的层析图中未检测出这类峰。这些观察结果表明在m/z619.4下在XIC中检测的峰明显地是药物偶联肽并且是通过它完整的质量值来鉴别的。该结果汇总于表V中。这些结果表明在偶联物的情况下，主要的肽是在重链的铰链区上结合到2种药物上的那些。这些数据与通过其他正交例如DAR分析获得的数据相一致。图17.示出了脱糖某化的H16-7. 8mcMMAF ADC的质量图谱的实例谱图。通讨电啼射离子化作用飞行时间(ESI-TOF)质谱术来确定脱糖基化的H16-7.8mcMMAF的完全质量。测试样品通过250mM磷酸钠缓冲液，pH7. 5进行稀释，并且然后在37° C下与糖肽酶F —起孵化过夜。将样品注射到PLRPTM柱(Varian Technology)上，在90° C下平衡，并且用乙腈/水梯度进行洗脱。通过偶联到WATERS Synapt质谱仪(Waters)上的Acquity UPLC系统对样品峰进行分析，并且通过MaxEntl软件从原始数据对质量进行重构。显示了针对脱·糖基化的H16-7. 8mcMMAF的一个实例的质谱谱图。主要的药物偶联的抗体是一种加载4-药物种类。包括在H16-7. 8mcMMAF中富集未结合抗体的这种观察是与通过其他正交方法(例如，通过RP-HPLC得到DAR，肽谱、以及HIC测定法)获得的结果相一致的。图18. H16-7. 8mcMMAF的药物杭体比率(DAR)谱图。讲行DAR分析用于定量HPLC确定每个轻链和重链中药物负荷的相对数量。使用PLRP-S分析柱，2. ImmX 50mm，使用由2. 0%甲酸组成的流动相A以及由2. 0%甲酸加上90%乙腈组成的流动相B来进行DAR分析。显示了针对H16-7. 8mcMMAF的代表性的DAR谱图。DAR值是4. O。使用本方法的相同HPLC条件对样品进行LC-MS分析用来鉴别观察到的峰。结果汇总于表VI中。通过LC-MS正交地证实了在该方法鉴定期间获得的DAR结果的峰识别。
具体实施例方式章节概要I.)定义II. )161P2F10B 抗体III.)通常的抗体药物偶联物III (A) · Auristatin 和 DolostatinIV.)结合161P2F10B的抗体药物偶联物V.)接头单元VI.)延伸物单元VII.)氨基酸单元VIII.)间隔物单元IX.)药物单元X.)药物加载XI.)确定ADC的细胞毒性作用的方法XII.) —种或多种癌症的治疗
XIII.)作为基于抗体治疗靶的161P2F10BXIV. )161P2F10B ADC 混合物XV.)联合治疗XVI.)制造试剂盒/物品I.)定义:除非另外定义，在此使用的所有技术术语、注释以及其他科学术语或科学术语是旨在具有本发明涉及领域普通技术人员所通常理解的含义。在一些情况中，为了清楚和/或为了便于引用在此定义了具有通常理解含义的术语，并且在此包括这类定义不必解释成表示与本领域通常理解的具有显著差异。在此说明或引用的许多技术和步骤被本领域普通技术人员良好地理解并且使用常规方法(例如在Sambrook, et al. , Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor，N. Y中说明的广泛使用的分子克隆方法)一般性地使用。当适当时，除非另外说明，通常地根据制造商限定的实验方案和/或参数来执行涉及使用可商购的试剂盒和试剂的步骤。当在此使用商品名称时，除非上下文另外指出，对商品名称的引用还涉及该商品名称产品的产品配方、属类药物、以及一种或多种活性药物成分。术语“晚期癌症”、“局部晚期癌症”、“晚期疾病”以及“局部晚期疾病”是指延伸穿过相关组织被膜的癌症，并且是指包括在美国泌尿学会(AUA)系统下的阶段C疾病，在Whitmore-Jewett系统下的阶段C1-C2疾病，以及在 Μ(肿瘤、结节、转移)系统下的阶段Τ3-Τ4和N+疾病。通常地，对于患有疾病晚期疾病的病人不推荐手术治疗，并且与具有临床局部化(器官限制)癌的病人相比较这些病人具有显著地更少有利的结果。缩写“AFP”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸-多拉脯氨酸-苯丙氨酸-对苯二胺(参见下文式XVI)。缩写“ΜΜΑΕ”是指单甲基auristatin E (参见下文式XI)。缩写“AEB”是指通过使auristatin E与对乙酰基苯甲酸进行反应所生产的一种酯(参见下文式XX)。缩写“AEVB”是指通过使auristatin E与苯甲酰基缬草酸进行反应所生产的一种酯(参见下文式XXI)。缩写“MMAF”是指多拉缬氨酸-缬氨酸-多拉异亮氨酸_多拉脯氨酸_苯丙氨酸(参见下文式XVIV)。除外另外说明，术语“烷基”是指具有从约I至约20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的一种饱和的直链或支链烃，其中从约I至约8个碳原子是优选的。烷基基团的实例是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2- 丁基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、3_甲基_2_ 丁基、3_甲基_1- 丁基、2_甲基_1- 丁基、1_己基、2_己基、3_己基、2_甲基_2_戍基、3_甲基_2_戍基、4_甲基_2_戍基、3_甲基-3-戍基、2-甲基-3-戍基、2，3- 二甲基-2- 丁基、以及3，3- 二甲基-2- 丁基。烷基基团，无论单独地或作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地I至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，包括但不限于-卤素、_0_(C「C8 烧基)、-O-(C2-C8 稀基)、-O-(C2-C8 块基)、_ 芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(O)OR，、-C(O) NH2, -C(0)NHR，、_C(0)N(R，)2、-NHC (O) R，、-SR，、-SO3Rj > _S(0)2R，、-S(O)R，、-OH、=0、-N3、-NH2、-NH (R，)、_N(R，)2 以及 _CN，其中每个 R，是独立地选自 _H、-C1-C8烧基、-C2-C8烯基、-C2-C8块基、或_芳基，并且其中所述的-(^-(C1-C8烧基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个基团可选地进一步取代，这些基团包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、_ 齒素、-O-(C1-C8 烧基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 块基)、-芳基、-C (O) R”、-OC(O)R，，、-C (O) OR”、-C (O)NH2'-C (0)NHR”、_C (0)N(R”)2、-NHC (0) R ”、-SR”、-SO3R ”、-S (0) 2R”、_S (0)R”、-OH、-N3, -NH2, -NH (R” )、_N(R”)2 以及 _CN，其中每个 R” 是独立地选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。除非另外说明，术语“烯基”和“炔基”是指具有从约2至约20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的直链或支链的碳链，其中从约2至约8个碳原子是优选的。烯基链在该链中具有至少一个双键并且炔基链在该链中具有至少一个三 键。烯基基团的实例包括但不限于亚乙基或乙烯基、烯丙基、-I- 丁烯基、-2- 丁烯基、-异丁稀基、_1_戍稀基、_2_戍稀基、-3-甲基_1- 丁稀基、-2-甲基-2- 丁稀基、以及_2，3~ 二甲基-2-丁烯基。炔基基团的实例包括但不限于炔性的、炔丙基、乙炔基、丙炔基、-I-丁炔基、~2~ 丁炔基、-I-戍炔基、-2-戍炔基、以及-3-甲基-I 丁炔基。烯基和炔基基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地I至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，这些基团包括但不限于-齒素、_0_ (C1-C8烧基)、-O- (C2-C8烯基)、-O- (C2-C8块基)、_芳基、-C(0)R，、-OC (0)R，、-C(O) OR，、-C(O)NH2' _C(0)NHR，、_C(0)N(R，)2、-NHC(O)R’、-SR’、-SO3Rj、-S (0) 2R’、-S (0) R’、-OH、=0、-N3, -NH2、-NH (R，)、-N (R，)2 以及 _CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基，并且其中所述的 _0_ (C1-C8 烧基)、-O- (C2-C8 烯基)、-O- (C2-C8 块基)、_ 芳基、-C1-C8 烧基、-C2-C8 烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个取代基可选地进一步取代，这些基团包括但不限于-C1-C8 烧基、-C2-C8 稀基、-C2-C8 块基、-齒素、-O- (C1-C8 烧基)、-O- (C2-C8 稀基)、-O- (C2-C8炔基)、-芳基、-C (0) R”、-OC (0) R”、-C (0) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N(R”)2、-NHC (0)R”、-SR”、-S03R，，、-S (0) 2R”、-S (0) R”、-OH、-N3、-NH2、-NH (R”)、_N(R”)2 以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。除非另外说明，术语“亚烷基”是指具有从约I至约20个碳原子的(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)一种饱和的支链或直链烃基，其中从I至约8个碳原子在优选的并且具有通过从母体烷的同一个或两个不同碳原子中去除两个氢原子而得到的两个单价基团中心。典型的亚烷基包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、1，4-环亚己基等。亚烷基基团，无论单独地还是作为另一个基团的一部分，可以用一个或多个基团，优选地I至3个基团(以及选自卤素的任何另外的取代基)可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、_0_(C「C8 烧基)、-O-(C2-C8 稀基)、-O-(C2-C8 块基)、-芳基、-C(O)R’、-OC(O)R’、-C(0)OR，、-C(O) NH2, -C(0)NHR，、_C(0)N(R，)2、-NHC(O) R \ -SR，、-SO3Rj > _S(0)2R，、-S(O)R，、-OH、=0、-N3、-NH2、-NH (R，)、_N(R，)2 以及 _CN，其中每个 R，是独立地选自 _H、-C1-C8烧基、-C2-C8烯基、-C2-C8块基、或_芳基，并且其中所述的-(^-(C1-C8烧基)、-O-(C2-C8烯基)、-O-(C2-C8炔基)、-芳基、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、以及-C2-C8炔基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8块基、-齒素、-O-(C1-C8 烧基)>-0- (C2-C8 烯基)>-O- (C2-C8 块基)、-芳基、-C (O) R”、-OC (O)R，，、-C (O) OR”、-C (O)NH2'-C (O) NHR ”、-C (0)N(R”)2、-NHC (O) R ”、-SR”、-SO3R ”、-S (O) 2R”、_S (O)R”、-OH、-N3> -NH2, -NH (R” )、_N(R”)2 以及-CN，其中每个 R” 是独立地选自-H、-C1-C8 烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。除非另外说明，术语“亚烯基”是指包括至少一个碳-碳双键的一种任选取代的亚烷基基团。示例性的亚烯基基团包括例如亚乙烯基(-CH=CH-)和亚丙烯基(-CH=CHCH2-)。除非另外说明，术语“亚炔基”是指包含至少一个碳-碳三键的一种任选取代的亚烷基基团。示例性的亚炔基基团包括例如亚乙炔(-C ^ C-)、炔丙基(-CH2C ^ C-)、以及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C = CH-)。
除非另外说明，术语“芳基”是指通过从母体芳环系统的一个单个碳原子中去除一个氢原子而得到的具有6-20个碳原子(以及其中碳原子的范围和具体数字的所有组合和亚组合)的一种单价芳香族烃基。在示例性结构中一些芳基基团表示为“Ar”。典型的芳基基团包括但不限于从苯、取代的苯、苯基、萘、蒽、联苯等衍生的基团。芳基基团，无论单独地还是作为另一个具体的一部分，可以用一个或多个，优选地I至5个，或甚至I至2个基团可选地取代，这些基团包括但不限于-卤素、-C1-C8烷基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 块基、-O-(C1-C8 烧基)、-O-(C2-C8 烯基)、-O-(C2-C8 块基)、-芳基、-C (O) R，、-OC (O) R，、-C (O) OR，、-C(O)NH2' _C(0)NHR，、_C(0)N(R，)2、-NHC(O)R，、-SR，、-SO3Rj、-S(0)2R，、-S (O)Rj、-OH、-NO2, -N3、-NH2、-NH (R，)、_N(R，)2 以及 _CN，其中每个R’是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基并且其中所述的 _C「C8 烧基、-C2-C8 烯基、-C2-C8 块基、O-(C1-C8 烧基)、-O-(C2-C8 烯基)、-O-(C2-C8 块基)、以及-芳基基团可以用一个或多个取代基进一步可选地取代，这些取代基包括但不限于-C1-C8 烧基、-C2-C8 稀基、-C2-C8 块基、-齒素、-O- (C1-C8 烧基)、-O- (C2-C8 稀基)、-O- (C2-C8炔基)、-芳基、-C (O) R”、-OC (O) R”、-C (O) OR”、-C (0) NH2、-C (0) NHR”、-C (0) N(R”)2、-NHC (0)R”、-SR”、-S03R，，、-S (0) 2R”、-S (0) R”、-OH、-N3、-NH2、-NH (R”)、_N(R”)2 以及-CN，其中每个R”是独立地选自-H、-C1-C8烷基、-C2-C8烯基、-C2-C8炔基、或-芳基。除非另外说明，术语“亚芳基”是指一种任选取代的芳基基团，该芳基基团是二价的(即，通过从母体芳环系统的同一个或两个不同碳原子中去除两个氢原子而衍生的)并且可以处于如下面结构中所示的邻、间、或对构象(使用苯基作为示例性芳基基团)。
权利要求
1.一种抗体药物偶联物，包括特异性地结合于包括SEQ ID N0:2的氨基酸序列的一种161P2F10B蛋白上的一种抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ IDNO: 7的VHg，从20至142，以及SEQ ID NO:8的Vl区，从20至127，并且其中所述抗体偶联到单甲基auristatin F(MMAF)上。
2.如权利要求I所述的抗体药物偶联物，其中该抗原结合片段是一种Fab、F(ab')2或Fv片段。
3.如权利要求I所述的抗体药物偶联物，其中该抗体是一种完全人类抗体。
4.如权利要求I所述的抗体药物偶联物，该偶联物是以重组方式生产的。
5.一种药物组合物，包括人类单位剂量形式的如权利要求I所述的抗体药物偶联物。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中该组合物是用于癌症治疗。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其中该癌症是肾癌或肝癌。
8.一种抑制受试者体内癌细胞生长的方法，包括向所述受试者给予如权利要求I所述的抗体药物偶联物。
9.一种将细胞毒性剂或诊断剂递送至细胞的方法，包括 提供偶联于特异性地结合于包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的161P2F10B蛋白的抗体或其片段的一种或多种MMAF，其中该抗体包括以下氨基酸序列SEQ ID NO:7的VHg，从20至142，以及SEQ ID NO: 8的Vl区，从20至127，从而形成一种抗体药物或片段药物偶联物；并且 将所述细胞暴露于该抗体药物偶联物或片段药物偶联物。
10.一种用于治疗哺乳动物体内肿瘤的方法，包括用有效量的如权利要求I所述的抗体药物偶联物来治疗该哺乳动物。
11.一种用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的方法，包括用有效量的如权利要求I所述的抗体药物偶联物与辐射的组合来治疗该哺乳动物。
12.一种用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的方法，包括用有效量的如权利要求I所述的抗体药物偶联物与化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。
13.一种用于降低哺乳动物体内肿瘤生长的方法，包括用有效量的如权利要求I所述的抗体药物偶联物与药物或生物活性治疗的组合来治疗该哺乳动物
14.一种用于治疗哺乳动物体内癌症的方法，包括用有效量的如权利要求I所述的抗体药物偶联物与化学治疗剂的组合来治疗该哺乳动物。
全文摘要
在此说明了结合到161P2F10B蛋白上的抗体药物偶联物(ADC)。161P2F10B在正常成年人组织中显示组织特异性表达并且在表I中列出的癌症中在异常表达的。因此，本发明的ADC提供了用于治疗癌症的一种治疗性组合物。
文档编号A61K39/00GK102844045SQ201180008612
公开日2012年12月26日 申请日期2011年2月8日 优先权日2010年2月8日
发明者M·托尔戈夫, R·K·莫里森, A·雅各波维茨, J·古达斯, Z·安 申请人:艾更斯司股份有限公司