专利名称：针对硬骨素蛋白质的高亲和力核酸适配体的制作方法
技术领域：
本文描述的是针对硬骨素的新核酸配体(适配体)，硬骨素是骨生长的细胞外负调节物。公开的适配体有希望直接刺激骨形成且用作治疗骨疾病例如骨质疏松症的疗法。
背景技术：
核酸适配体是能够结合且抑制蛋白质功能的体外演化的核酸。在过去20年已开发核酸适配体，以开发针对多种靶的治疗适配体用于许多疾病，尤其包括黄斑变性、HIV、癌症、心血管疾病。由Gilead Sciences发现，授权给EyetechPharmaceuticals且通过Pfizer在美国外销售的一种适配体,培加尼布(MACUGEN)在临床上用于治疗黄斑变性。其他基于适配体的药物在针对凝血因子、生长因子、炎症标记及其他靶的临床试验中。就我们所知，仍未开发与骨质疏松症有关的适配体。骨质疏松症在全世界具有显著的医学和经济影响。在发达国家，约4%的人口具有骨质疏松症，并且单独对于美国的经济负荷已估计在每年$140亿。目前，目前在临床中使用的大多数药物试剂是基于二膦酸盐的抗吸收剂，包括阿屈膦酸盐(alendronate，F0SAMAX)、利塞勝酸盐(risedronate, ACT0NEL)或伊班勝酸盐(ibandronate, B0NIVA)。已确立的药物试剂可以在控制骨量中略微有效，但它们具有许多缺点，包括弱口腔吸收、食管炎和颚的骨坏死。因此，存在朝向刺激骨形成的促合成剂(anabolic agents)的进展，所述骨形成会潜在地加速骨生长。近来，特立帕肽(重组甲状旁腺激素，F0RTE0)被批准作为进入临床的第一种促合成剂，但存在关于FORTEO仅在前12个月治疗过程中有效重塑骨并且随后功效下降的一些关注。硬骨素是骨形成的骨细胞特异性负调节物，这使得其成为用于骨质疏松症治疗的有吸引力的药物靶。Amgen在开发用于骨质疏松症治疗的针对硬骨素的基于蛋白质的抗体(人临床2期)。Novartis和Eli Lily也在开发硬骨素阻断抗体(临床前)。OsteogeneX在开发针对硬骨素的小分子抑制剂，其目前在临床前和先导优化中。抗体一般具有许多局限性，包括免疫应答的危险，分批间变异和有限的保存期限。小分子具有结合亲和力和特异性的明显问题。概述
本发明提供了在本文中称为“硬骨素适配体”，与蛋白质硬骨素结合的适配体，包括其制剂和/或组合物，和关于使用此类硬骨素适配体用于治疗和预防骨质疏松症及其他相关骨疾病的方法。本发明提供了可替代的分子方法，其通过抑制硬骨素功能来刺激骨生长，并且对于骨质疏松症及其他相关疾病具有更少的副作用。这随着特异性且有效地靶向且抑制硬骨素的核酸适配体的开发得到解决。本发明具体涉及能够与硬骨素结合且抑制硬骨素功能的适配体，所述硬骨素是骨生长的重要负调节物且牵涉骨疾病例如骨质疏松症。本发明请求保护作为独特的新物质组分的适配体，其抑制硬骨素功能且具有作为用于骨质疏松症和相关疾病的疗法的明确牵涉。本发明涉及使用抗硬骨素适配体作为疗法用于刺激骨形成的方法。该方法包括给人施用有效引起骨形成速率增加的抗硬骨素适配体的量。本文描述的制剂包含硬骨素适配体或其药学可接受的盐。制剂可以包含与硬骨素或其变体或片段结合的任何适配体。优选地，适配体与硬骨素结合且抑制其活性。本发明还提供了使用抗硬骨素适配体用于治疗其中硬骨素的存在引起不希望的病理学效应的骨相关疾病、病症或状况的方法。此类疾病、病症和状况包括但不限于骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、骨软化、骨营养不良、骨骨髓瘤(osteomyeloma)、骨折、Paget’ s病、成骨不全、骨硬化、发育不全型骨病症、体液血钙过高性骨髓瘤、多发性骨髓瘤和在引起或诱导骨变薄的病症后的骨变薄。此类骨变薄(hinning)疾病、病症和状况包括但不限于转移、血钙过多、慢性肾疾病、肾透析、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性甲状旁腺功能亢进、炎性肠病、克罗恩病、皮质类固醇的长期使用或促性腺素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂 的长期使用。受试者可以是任何年龄的男性或女性。本发明可以给人受试者施用单独或与其他药物组合的一定量的抗硬骨素适配体。本发明还提供了定量硬骨素表达的诊断方法。抗硬骨素适配体可以通过可检测物质进行标记，所述可检测物质包括但不限于荧光材料、酶、发光材料和放射性材料。本发明的此类实施方案可以用于检测生物学样品中的硬骨素水平。附图
简述
图I是显示用于硬骨素适配体选择的方法的图。图2是显示在针对硬骨素的15轮选择后从ssDNA库中分离且在本发明中请求保护的适配体序列的表。保守核苷酸由星号标记。图3是显示使用适配体酶联测定来测定适配体针对硬骨素的相对结合强度的图表。就其结合活性和交叉反应性估计硬骨素适配体、凝血酶结合适配体、GST-硬骨素和GST蛋白质的组合(通过在图表下的加号指示)。数据由一式三份样品求平均值。图4是显示修饰的适配体的稳定性的图在补充有5% FBS的MC3T3-E1细胞中估计的A.)未修饰的Scl 2适配体和B. ) 3’反向胸苷修饰的Scl 2适配体。图5是显示Wnt报道分子测定的原理和硬骨素适配体在细胞培养物中的效应的图。A.)示意性显示在报道分子萤光素酶活性测定后的原理。B. )3’反向胸苷修饰的硬骨素适配体对MC3T3-E1细胞中Wnt3a介导的活性的作用。所示数据代表独立测定的一式三份的值。***代表通过具有95%置信度的不配对t检验分析的彼此统计学显著的值。C.)不同浓度的3’反向胸苷修饰的Scl 2适配体针对硬骨素功能的效应。图6是测定Scl 2适配体的二级结构的图表。A. ) Scl 2适配体的⑶光谱。B.)Scl 2适配体的⑶解链光谱。图7是显示通过等温滴定量热法以测量在硬骨素和硬骨素适配体之间的结合的数据的图表。用硬骨素的系列注射滴定Scl 2适配体(上)。在就适配体稀释度的热校正后，起因于原始量热法数据整合的结合等温线(下)。详述
本发明现在就下述实验程序和结果而言进一步描述。下述实验细节预期是本发明的实践的例示，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。使用图I中的方案，伴随图2中的细节，在本发明中鉴定且请求保护DNA适配体的七个不同序列。值得注意的是，适配体Scl I和Scl 2是占优势序列，其占库中的总共79%。此外，观察到高水平的序列同源性，其中在几乎所有克隆中在随机区域中的大致相同位置上存在保守基序(5’-GGXGGXXGGXTGGG-3’)(SEQ ID NO :1 )，其中X是任何核苷酸碱基。酶联结合测定显示硬骨素适配体与硬骨素的特异性结合。结果暗示其对于硬骨素的相对结合强度以下述次序Scl4> Scl I=Scl 2 > Scl 3(图3)。适配体显示与GST可忽略不计的结合，暗示适配体与硬骨素特异性结合。此外，具有真正的G-四链体结构的凝血酶结合适配体不与硬骨素蛋白质交叉反应。硬骨素适配体通过用3’反向胸苷(3’ -InT)给3’末端戴帽得到稳定，且在补充有5% FBS的MC3T3-E1细胞中进行估计(图4)。如果没有任何修饰，适配体通过血清中的核酸酶快速降解，如通过涂片注意到的。在3’反向胸苷适配体的情况下，该寡核苷酸保持完整28小时，暗示适配体的稳定性可以得到极大增强。还可以对适配体作出几个不同种类的修饰，以减少外切核酸酶降解且增加在个体的血清中的寿命。降解可以伴随适配体的肌内、静脉内和口服施用出现。用反向胸苷、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇(PEG)修饰适配体的3’末端可以减少寡核苷酸适配体的降解，增加适配体的稳定性。在一个实施方案中，PEG具有约20 - 80 kDa的平均分子量。进一步地，还可以修饰适配体的脱氧核糖-磷酸主链的磷酸二酯键，以改善稳定性。如在本文件中使用的，术语“适配体”指具有式I中所示结构的重复单位的分子。波浪线区别一个核苷酸和/或重复单位与邻近的核苷酸和/或重复单位。
权利要求
1.一种组合物，其包含 包含具有序列5’ -GGXGGXXGGXTGGG-3’ (SEQ ID NO 1)的寡核苷酸的DNA适配体或其盐， 其中所述适配体抑制硬骨素， 优选地，所述适配体具有约14 -约50个核苷酸重复单位； 优选地，所述适配体与选自脱氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇的一种或多种缀合； 优选地，所述适配体是具有由脱氧核糖-磷酸键构成的主链的寡核苷酸； 优选地，所述适配体是具有通过选自硫酯键和酰胺键中的一种或多种稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸键的寡核苷酸； 优选地，所述适配体具有平行的G-四链体结构。
2.一种能够结合硬骨素的适配体，所述适配体选自包含下述序列之一的组 5'-frnTCCAAAGCCGOGOGGGTGGGATGGGTT-3, (SEO ID NO: 2) (Scl I); 5,_TTGCGCG^AA,^GGGGGGGTGGGTGGG1T^3< (-SEq ID 酿 3j (Sci 2j Si-Tgccttgttattgtggtgggcgggtgggac-J' (seq id no 4) (Sci 3); S1-GGGGGGGGTGGGGTGGGTCAATArrCTCGTC-Sf (S EQ ID NO: 5) (Scl 4); 5 _WOCOCGW^rTGGGGGGC}TGGGTGGGTT_31 (SEQ ID N0;玢 |Sd 5j； 5’-CCCTCCAAAG03GGGC]GCIGTGGGTG<3GCAG-3* (SEQ ID NO: 7) (Scl 6); Jl 5f^CTGTCACATGTGGGGGGGGGGGTGGG1T_3, {SEq lD ^i0: gj (Sd 或SEQ ID NOS 2-8之一的变体。
3.权利要求2的适配体，其中所述适配体与选自脱氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一种或多种缀合。
4.权利要求3的适配体，其中所述适配体在3’末端与选自脱氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一种或多种缀合。
5.权利要求2的适配体，其中所述适配体是具有由脱氧核糖-磷酸键构成的主链的寡核苷酸。
6.权利要求2的适配体，其中所述适配体是具有通过选自硫酯键和酰胺键中的一种或多种稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸键的寡核苷酸。
7.权利要求2的适配体，其中所述适配体具有平行的G-四链体结构。
8.用于治疗其中硬骨素引起不希望的病理学效应的骨相关疾病、病症或状况的权利要求I的组合物或根据权利要求2-7中任一项的适配体，所述治疗包括给个体施用权利要求I的组合物和或根据权利要求2-7中任一项的适配体，其中所述个体需要用于其中硬骨素引起不希望的病理学效应的骨相关疾病、病症或状况的治疗， 优选地，其中所述组合物进一步包含药学载体。
9.权利要求8的组合物或适配体，其中所述适配体选自具有下述序列之一的寡核苷酸
10.权利要求9的组合物或适配体，其中所述适配体在3’末端与选自脱氧胸苷核苷酸、反向胸苷和聚乙二醇中的一种或多种缀合； 优选地，所述适配体是具有由脱氧核糖-磷酸键构成的主链的寡核苷酸； 优选地，所述适配体是具有通过选自硫酯和酰胺键中的一种或多种稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸键的寡核苷酸； 优选地，所述骨相关疾病、病症或状况包含选自下述中的至少一种骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎、骨软化、骨营养不良、骨骨髓瘤、骨折、Paget’ s病、成骨不全、骨硬化、发育不全型骨病症、体液血钙过高性骨髓瘤、多发性骨髓瘤和骨变薄； 优选地,所述骨相关疾病、病症或状况包含骨质疏松症。
全文摘要
描述的是能够与硬骨素结合且抑制硬骨素功能的核酸适配体，所述硬骨素是骨生长的重要负调节物。适配体具有作为用于骨疾病的疗法的应用，所述骨疾病包括骨质疏松症、骨质减少、骨关节炎及其他骨质疏松症相关状况和并发症。
文档编号A61K31/7125GK102971424SQ201180025929
公开日2013年3月13日 申请日期2011年5月23日 优先权日2010年5月27日
发明者J.A.坦纳, 沈家滔, S.C.陈 申请人:香港大学