专利名称：载药羟基磷灰石/plga/壳聚糖分层微球的制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学材料的制备技术领域，涉及载药微球材料的制备技术，具体涉及载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的制备方法。
背景技术：
骨组织是由无机矿物和有机成分组成的复合物，无机矿物相约占干骨重量的 6(Γ70%，主要成分为羟基磷灰石的纳米晶体，其余的有机组分则主要是胶原纤维。随着医学、药学以及生物学等学科的不断发展，针对骨组织疾病的新药层出不穷，但全身性的给药往往造成骨组织“病灶”部位的有效药物含量不足，而药物在其它组织的分布则易于引发毒副作用；此外，还存在药物在体内持续稳定的释放的问题无论是口服给药还是静脉注射， 血药浓度的变化都会出现“峰谷”现象，药物浓度太低达不到治疗效果，太高则会导致较大的毒副作用。将药物溶解或分散在聚合物材料中，所形成的基质型微小球体称为微球，是当前应用最广泛的聚合物包载药物的方式。药物经过微球包载后根据微球粒径和表面性质等因素可以采用口服、注射或植入给药等方式，更重要的是，通过调节聚合物的分子量、微球粒径、药物分布、形态以及制备过程等，能够控制药物的释放速度，在某些情况下，还能控制药物的释放位置。目前应用于药物载体的材料主要分为无机材料、天然高分子材料及合成的高分子材料。按降解性能又可分为生物降解性材料及非生物降解性材料。其中可生物降解的合成高分子材料可以通过改变化学组成、材料结构及表面性质等因素，来设计药物释放的性能。聚酯类是目前研究最多、应用最广泛的可生物降解的合成高分子材料，如聚乳酸 (简称PLA)、聚乙醇酸(简称PGA)、聚ε —己内酯(简称PCL)、聚β —羟基丁酸(简称 ΡΗΒ)、聚β —羟基戊酸(简称PHV)以及它们的共聚物。乳酸一乙醇酸的共聚物(简称 PLGA)是被美国食品药品管理局批准应用于临床的高分子材料，具有良好的生物相容性。 PLGA作为药物释放的载体，其优势在于良好的生物降解性能，体外降解为水解过程，速率较快。壳聚糖(简称CS)作为天然高分子材料，具有良好的生物相容性，有利于细胞的粘附、 增殖和分化，具有一定的生物活性，可生物降解，降解产物无毒。羟基磷灰石(简称HA)是生物骨骼和牙齿的主要无机成分，与硬组织有良好的生物相容性、亲和性和骨传导性；对很多分子具有一定的吸附性。中国专利02137781. 2公开了一种水溶性抗癌药物微球的制备方法；中国专利 02121391. 7公开了纳米微粒、微球及其生物荧光探针的制备和应用；中国专利02134526. O 公开了一种环丙沙星聚乳酸微球的制备方法；中国专利01807440. 5公开了含有司他夫定的持续释放微球的制备方法；李湘南等[李湘南，陈晓明，彭志明，李世普.纳米羟基磷灰石 /壳聚糖载药微球的制备及性能，中南大学学报(自然科学版)，2011. 5. 1232-1237]报道了制备的羟基磷灰石/壳聚糖载药微球；王津等[王津，李柱来，陈莉敏，许秀枝.壳聚糖-海藻酸钠布洛芬缓释微球的制备工艺及性能，福建医科大学学报，200. I. 56-59]对制备的壳聚糖-海藻酸钠载药微球进行研究；陆荣等[陆荣，张峰，丁翠翠，李苏亚.聚乳酸/ 羟基磷灰石微球的合成与性能，化工技术与开发，2010. 9. 4-7]制备了聚乳酸/羟基磷灰石微球。但上述现有技术制得的微球普遍存在药物释放快、球体结构不规整的问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺点，提供一种载药轻基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的制备方法。本发明首先在内核层采用抽真空改良的水包油包固体乳化-溶剂挥发法制备载药的羟基磷灰石/PLGA微球，然后再包覆上壳聚糖，制得载药羟基磷灰石/ PLGA/壳聚糖分层微球。本发明采用两种聚合物制成两层“核-壳”结构的微球，能有效地调节微球释放，大大减弱了突释效应；并且由于使用抽真空制备载药微球，有效提高了微球的包封率。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的制备方法，包括以下步骤
(1)将异烟肼溶于去离子水中，加入羟基磷灰石粉末，避光条件下搅拌得到乳液，冷冻干燥得到粉体；
(2)将PLGA溶于二氯甲烷中，得到PLGA溶液，将上述PLGA溶液和步骤(I)得到的粉体混合均匀得到含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液；
(3)将去离子水加热至9(Γ100 ，将聚乙烯醇1788溶于其中，降温至30 55°C，得到聚乙烯醇水溶液；将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液与聚乙烯醇水溶液混合，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；
(4)将步骤(2)得到的含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液加入步骤(3)得到的壳聚糖 /聚乙烯醇溶液中，真空状态下搅拌，之后用去离子水洗涤，冷冻干燥，得到载药羟基磷灰石 /PLGA/壳聚糖分层微球。本发明步骤(I)中，所述异烟肼与去离子水的质量体积比为(0.02、.1):1 g/mL； 所述异烟肼与羟基磷灰石的质量比为(O. 2^1) :1。本发明步骤(2)中，所述粉体与PLGA溶液的质量体积比为(O. Γ2) :10g/ml。本发明步骤(3)中，所述壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比为(O. 4、. 6) :10 g/ HiL ;所述壳聚糖溶液与聚乙烯醇水溶液的体积比为I :(1(Γ20)。本发明步骤(2)中，所述PLGA与二氯甲烷的质量体积比为(O. 5 I. 5) : 10 g/mL。本发明步骤(3)中，所述聚乙烯醇与去离子水的质量体积比为(广2) :100 g/mL ； 所述醋酸水溶液中醋酸与去离子水的体积比为(广3) :100。本发明步骤(I)中，所述搅拌的转速为100 200 r/min，时间为15 20min ;所述冷冻干燥的时间为36 72h。本发明步骤(4)中，所述真空状态的真空度为O. 07、. 09Mpa ;所述搅拌的转速为 15(T600r/min，时间为8 12h ;所述冷冻干燥的时间为18 36h。本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果
(1)本发明的制备方法中在真空状态下将壳聚糖包覆在羟基磷灰石/PLGA上，得到的载药微球药物包封率大大提高；
(2)本发明的制备方法使用了两种不同聚合物，制成两层“核-壳”结构的微球，缓释时间长，同时大大减弱了突释效应；
(3)本发明的的制备方法工艺简单，对设备没有过高要求，原料易得，成本低廉，易于实现产业化。
图I为本发明实施例I制备的载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的扫描电镜(简称SEM)图。图2为本发明实施例I制备的载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的体外释药曲线。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不仅限于此。实施例I
(1)将O.2g异烟肼溶于IOmL去离子水中，加入I. Og羟基磷灰石粉末，避光条件下以 200r/min的转速搅拌15 min得到呈半透明状的乳液，然后冷冻干燥54h得到粉体；
(2)将O.5g PLGA溶于IOmL 二氯甲烷中，得到5. 0% (wt. )PLGA溶液；将IOmL PLGA溶液和I. 5g粉体混和均匀得到IOmL含异烟肼的HA/PLGA共混液；
(3)将IOOmL去离子水加热至90°C，将2g聚乙烯醇1788溶于其中，降温至40°C，得到
2.0% (wt.)聚乙烯醇水溶液；将O. 4g壳聚糖溶于IOmL 1% (wt.)的醋酸水溶液中，得到40% (wt.)壳聚糖溶液；将IOmL壳聚糖溶液与IOOmL聚乙烯醇水溶液混合，得IlOmL到壳聚糖/ 聚乙烯醇溶液；
(4)将IOmL步骤(2)得到的含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液加入步骤(3)得到的 IlOmL壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，真空度为O. 08Mpa时以150r/min的转速持续搅拌8h，之后用去离子水洗涤5次，冷冻干燥24h，得到载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球。将实施例I制备的载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球冷冻干燥后喷金，用 Quanta 200型扫描电镜(荷兰FEI公司，荷兰)观察，加速电压为20 kV。图I为SEM图谱。 由图I可知，实施例I制得的微球规整、粒径分布均匀，粒径分布在18(Γ200μπι之间。复合微球体外释药曲线实验将2mg载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球加入 PBS缓冲液至总体积为5mL，密封后，保持温度在37 土 1°C，IOOrpm下置于Forma 481型摇床 (Forma公司，美国)中振摇，每隔一段时间，利用紫外分光光度法测定上清液中的药物浓度， 根据投入的药物量及上清液的体积可计算出此时药物释放的百分比；每次取液后往沉淀中加入新鲜PBS缓冲液至总体积为5mL，继续振摇；释放总时间为20天，根据时间和累积释放百分比得到药物释放曲线。结果如图2所示，可以看出，异烟肼的突释效应小，缓释时间长； 到第20天时，累积释放量为34. 56%。总体缓释效果好。实施例2
(1)将I.Og异烟肼溶于IOmL去离子水中，加入I. Og羟基磷灰石粉末，避光条件下以 100r/min的转速搅拌20 min得到呈半透明状的乳液，然后冷冻干燥72h得到粉体；
(2)将I.5g PLGA溶于IOmL 二氯甲烷中，得到15% (wt. ) PLGA溶液；将IOmL PLGA溶液和2. Og粉体混和均匀得到IOmL含异烟肼的HA/PLGA共混液；
(3)将200mL去离子水加热至100°C，将2g聚乙烯醇1788溶于其中，降温至45°C，得到I. 0% (wt.)聚乙烯醇水溶液；将O. 6g壳聚糖溶于IOmL 3% (wt.)的醋酸水溶液中，得到
6.0% (wt.)壳聚糖溶液；将IOmL壳聚糖溶液与200mL聚乙烯醇水溶液混合，得到210mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液；
(4)将IOmL步骤(2)得到的含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液加入步骤(3)得到的 21OmL壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，真空度为O. 07Mpa时以600r/min的转速持续搅拌12h，之后用去离子水洗涤5次，冷冻干燥18h，得到载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球。实施例3
(1)将O.3g异烟肼溶于IOmL去离子水中，加入O. 6g羟基磷灰石粉末，避光条件下以 160r/min的转速搅拌16 min得到呈半透明状的乳液，然后冷冻干燥36h得到粉体；
(2)将O.8g PLGA溶于IOmL 二氯甲烷中，得到8. 0% (wt. )PLGA溶液；将IOmL PLGA溶液和O. 9g粉体混和均匀得到IOmL含异烟肼的HA/PLGA共混液；
(3)将150mL去离子水加热至95°C，将2.25g聚乙烯醇1788溶于其中，降温至40°C，得到I. 5% (wt.)聚乙烯醇水溶液；将O. 5g壳聚糖溶于IOmL 2% (wt.)的醋酸水溶液中，得到 5. 0% (wt.)壳聚糖溶液；将IOmL壳聚糖溶液与150mL聚乙烯醇水溶液混合，得到160mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液；
(4)将IOmL步骤(2)得到的含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液加入步骤(3)得到的 160mL壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，真空度为O. 09Mpa时以320r/min的转速持续搅拌8. 5h， 之后用去离子水洗涤5次，冷冻干燥36h，得到载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球。分别将实施例广3制备的载药微球溶于二氯甲烷中，完全溶解后，加入去离子水， 漂洗萃取乙胺丁醇及异烟肼，重复操作三次，将药物完全萃取出来，再用紫外分光光度计分别测量浓度，按下式计算载药量及包封率，结果如表I所示。载药量(DL)
————Kim
mmmm (%》
初始S葯:ft (Hg)
Dim
包封率(EE) (%)
理论载药量(％)
表I实施例f 3制备的载药微球的载药量及包封率
权利要求
1.载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将异烟肼溶于去离子水中，加入羟基磷灰石粉末，避光条件下搅拌得到乳液，冷冻干燥得到粉体；(2)将PLGA溶于二氯甲烷中，得到PLGA溶液，将上述PLGA溶液和步骤(I)得到的粉体混合均匀得到含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液；(3)将去离子水加热至9(Γ100 ，将聚乙烯醇1788溶于其中，降温至30 55°C，得到聚乙烯醇水溶液；将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液与聚乙烯醇水溶液混合，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；(4)将步骤(2)得到的含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液加入步骤(3)得到的壳聚糖 /聚乙烯醇溶液中，真空状态下搅拌，之后用去离子水洗涤，冷冻干燥，得到载药羟基磷灰石 /PLGA/壳聚糖分层微球。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述异烟肼与去离子水的质量体积比为(O. 02、. I) :1 g/mL;所述异烟肼与羟基磷灰石的质量比为(0.2 1) :1。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述粉体与PLGA溶液的质量体积比为(O. 4 2) :10g/ml。
4.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述壳聚糖与醋酸水溶液的质量体积比为(O. 0.6) :10g/mL;所述壳聚糖溶液与聚乙烯醇水溶液的体积比为I : (10 20)。
5.根据权利要求广4之一所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PLGA与二氯甲烷的质量体积比为(O. 5^1. 5) : 10 g/mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述聚乙烯醇与去离子水的质量体积比为(f 2) : 100 g/mL ;所述醋酸水溶液中醋酸与去离子水的体积比为(f 3): 100。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述搅拌的转速为 100^200 r/min，时间为15 20min ;所述冷冻干燥的时间为36 72h。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述真空状态的真空度为O. 07、. 09Mpa ;所述搅拌的转速为15(T600r/min，时间为8 12h ;所述冷冻干燥的时间为 18 36h。
全文摘要
本发明公开了载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球的制备方法，包括以下步骤将异烟肼溶于去离子水中，加入羟基磷灰石粉末，避光搅拌，冷冻干燥得到粉体；将PLGA溶液和粉体混匀得到含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液；将壳聚糖溶于醋酸水溶液中，得到壳聚糖溶液；将壳聚糖溶液与聚乙烯醇水溶液混合，得到壳聚糖/聚乙烯醇溶液；将含异烟肼的羟基磷灰石/PLGA共混液倒入壳聚糖/聚乙烯醇溶液中，真空搅拌，水洗，冷冻干燥即得载药羟基磷灰石/PLGA/壳聚糖分层微球。本发明制备的载药复合微球球型规整、粒径分布均匀，药物包封率高，体外释药时间长，突释小；制备工艺简单，原料易得，成本低廉，易于实现产业化。
文档编号A61K47/36GK102579361SQ20121003476
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月16日 优先权日2012年2月16日
发明者许为康, 魏坤 申请人:华南理工大学