专利名称：对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，尤其是中药有效部位及其应用领域，尤其是涉及一种对炎症因子表达具有抑制作用的中药有效部位的组合物。
背景技术：
炎症损伤是脏器，如心脏、脑等在发生损伤时，由免疫系统广泛参与的复杂反应，炎症过程中会释放出大量炎症因子，包括细胞因子、粘附分子等，促使损伤的进一步发生。炎症反应的发生会导致脏器局部二次损伤的发生，例如脑 缺血、心肌缺血，均是与炎症反应具有密切联系的临床常见病。例如，急性冠脉综合征(ACS)是一组由急性心肌缺血引起的临床综合征，凝血功能激活和易损斑块炎症反应在ACS的发生中起着重要作用，是两个核心病理环节。又如在中风过程中，脑缺血和再灌注之后，脑组织中均出现明显的炎症反应，造成脑缺血后的二次损伤。中医药治疗心脑缺血性病变上，显示了巨大潜力，但是，理想的药物还没有开发出来。“四妙勇安汤”由“金银花、玄参、当归、生甘草”组成，具有显著解毒活血定痛的作用，传统用于下肢动脉闭塞症和脉管炎的治疗。近年来，医家基于对脏器，例如心、脑，缺血性炎症反应病理机制的认识，将该方开始用于冠心病、脑缺血等治疗，取得了满意临床疗效。“四妙勇安汤”配伍精当，药专力宏，是最具中医配伍和用量特色的传统名方之一，具有很好的成药开发前景，其配伍规律和量效关系也值得深入研究，但因为原方用药量过大，给新药开发带来难度。因此，需要发现传统名方的药效学物质基础，发现其活性部位所在，研制出药效物质清楚、作用环节明确、安全高效、质量可控、配伍精当的对炎症因子具有抑制作用的现代药物组合物。
发明内容
为了达到上述至少一个发明目的，本发明提供了一种对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物，该组合物的组成部分均为中医传统名方“四妙勇安汤”的有效部位。本发明所提供的对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物组成，所述提取物的制备方法如下a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比2. 5 4 2. 5 4 I. 5 2. 5 O. 5 I. 5的比例混匀；b)将所述原料药中加入水或40 60%的乙醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为
I 5 10，提取2次以上，每次I. 5 4. 5小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到30%乙醇淋洗物即为所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即为所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即为所述第3提取物；d)将所述第1、2、3提取物混合，得到所述药物组合物。
根据本发明的实施方式之一，原料药中金银花、玄参、当归、甘草的优选重量比为3 : 3 : 2 : I。这既是临床经验的总结，同时又是经过实验验证的有效配比。根据本发明的另一实施方式，提取的步骤b)中乙醇的浓度为55%。根据本发明的实施方式之一，步骤b)中固液比为优选为I : 6 8。根据本发明的实施方式之一，步骤b)中的提取次数为4次，每次提取时间为2 4小时。根据本发明的实施方式之一，本制备方法中所采用的大孔树脂为AB-8大孔树脂。优选地，本发明所提供的一种对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物组成，所述提取物的制备方法如下a)将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比3 3 2 I的比例混匀；b)将所述原料药中加入55%的乙 醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为I : 8，提取4次，每次2小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣；c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上AB-8大孔树脂，采用水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇作为洗脱液进行连续淋洗，得到30%乙醇淋洗物即为所述第I提取物，60%乙醇淋洗物即为所述第2提取物、95%乙醇淋洗物即为所述第3提取物；d)将所述第I 3提取物混合，得到所述药物组合物。以上所述本发明所提供的药物组合物及其优选方案，是发明人在多年医疗实践的基础上摸索而成，并经过实验验证的、针对传统名方四妙勇安汤的改进剂型。本发明所提供的提取物I 3，经实验验证对炎症因子表达均具有抑制作用。经发明人在实验中，采用NF-κ B反应原件结合抑制剂筛选模型和过氧化物酶增殖剂受体(PPAR Y )激动剂筛选模型，对这些提取物的抑制炎症反应的作用进行验证，证实它们均有不同程度的抑制动脉粥样斑块炎症反应的作用。NF-κ B过度活化可引起多种病理反应，特别是和多种炎症反应相关，其中激活动脉粥样斑块炎症反应也是其中之一。NF- K B多以p50或p52结合p65亚基的形式存在，活化后P65亚基与I K B解离，由胞浆转位进入胞核，与靶基因上的反应原件(RE)结合，调节目的基因的表达。因此，NF-K B转位后早期基因表达的阻断策略为抑制其病理信号通路的关键靶点。发明人利用分子克隆技术，以人脐静脉内皮细胞cDNA为模板，扩增NF-K B-RE基因，克隆至pGL4. 32真核表达载体中，经转染，导入293A细胞内，经Hygromycin筛选、传代，建立了稳定表达NF- K B-RE的细胞系(pGL4. 32 [luc2P/NF_kappaB-RE] 293A)。该模型可直接通过荧光素酶检测试剂检测荧光素酶光化学值的变化，用于进行NF-κ B抑制剂的高通量筛选。经验证，确定第1、2提取物对NF-kB通路具有阻断作用，能够通过抑制早期基因表达而抑制该病理信号通路，IC50分别为31. 61 μ g/ml和32. 49 μ g/ml。过氧化物酶增殖剂受体(PPAR)是配体激活的转录因子核受体超家族成员之一。目前已知其三个亚型PPAR α，-β/δ和-γ。过氧化物酶增殖剂受体Y (PPAR Y )能影响NF-κ B、信号转录子、激活蛋白-I介导的信号通路，通过抑制这些途径的激活达到抑制靶基因启动子激活和转录的目的。PPARy的N端功能区含有一个能被有丝分裂原激活的蛋白激酶磷酸化位点，若该区域突变或在磷蛋白磷酸酶共同作用下则不能产生磷酸化而使其活化。配体与PPAR Y结合并使之激活后，与视黄醒X受体a (retinoid Xreceptor α，RXR α )形成异二聚体，再结合于特异性DNA序列而使靶基因活化，此序列称为PPAR特异性反应兀件(peroxisome proliferator responsiveelement,PPRE)。含有PPRE结构的基因包括已酰辅酶A合成酶、脂蛋白脂肪酶(LPL)、胰岛素受体底物-2 (IRS-2)、瘦素以及肿瘤坏死因子-α (TNF-α)等。PPARy通过调节相关基因的表达，在脂肪形成、糖脂代谢，以及在免疫系统中发挥重要作用，并与多种疾病如糖尿病、肥胖、高血压、癌症等的发生、发展有关。尤其是PPARy是脂肪细胞分化过程中的关键因子，近年来备受关注。PPARy成为了肥胖，高血压，动脉粥样硬化的治疗靶点。发明人以PPAR Y为靶位筛选其激动剂，发现第1-3提取物均有不同程度的PPARy激动剂效果。以第3提取物作用最明显的，其在O. Olmg/ml时的有效率为 90%，EC5tlO. 004mg/ml ;第 2 提取物在 O. lmg/ml 时的有效率为 100%，EC5tlO. Olmg/ml ;第I提取物的有效率不足60%。根据实验结果，可见本发明所提供药物组合物中所含有的第I 3提取物，均有不同程度的促进活化的过氧化物酶体增殖物激活受体Y (PPAR-γ)表达和/或抑制核转录因子kB(NF-kB)表达。其中，以促进PPAR-Y表达的作用最为显著。因而，根据临床实际的用药需要，将这些提取物进行有选择地、任意比例的组合，即可以得到药效物质清楚、作用 环节明确、安全高效、质量可控、配伍精当的对炎症因子具有抑制作用的现代药物组合物。为了进一步提高本药物组合物的抑制炎症因子的作用，发明人对三种有效部位的配伍规律进行了进一步地研究，发现了一些更佳的配伍比例。根据本发明的实施方式之一，上述药物组合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 3 5. 4 O. 2 4. 2 I的比例进行混合。根据本发明的另一实施方式，上述药物组合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比O. 6 3 O. 5 2. I I的比例进行混合。根据本发明的再一实施方式，上述药物组合物中，所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比1.34 1.05 I的比例进行混合。发明人经过3种提取物不同用药浓度的正交试验验证，按照上述比例范围配合而成的药物组合物，在抑制炎症因子方面表现稳定，效果更加突出。本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。实验例一单一提取物对NF- K B反应原件的结合抑制作用I、实验步骤(I)实验材料NF-k B-RE 细胞(pGL4. 32[luc2P/NF_kappaB-RE]293A，中国医学科学院药物研究所)，MEM-α培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，96孔培养板(Costar,3599), Bright-Glo Luciferase突光素酶检测试剂(Promaga),水套式CO2细胞培养箱(Sanyo,日本)，Safire2高速多通道连续波长酶标仪(TECAN，奥地利)。(2)检测样品采用实施例I所述方法所得提取物I 3，由北京中医药大学提供。(3)实验步骤将培养瓶内对数生长的NF- K B-RE细胞消化并计数，以100 μ I体系、5Χ 103/well的密度接种于96孔白色培养板中，孵育18-24h。对照组换以无血清MEM-α培养基；待筛样品于 18h后以 100 μ g/ml>50 μ g/ml、25 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml 的浓度同时加入,然后与细胞共同孵育12h。样品作用结束后，于室温放置30min,吸弃原培养基,每孔加入50 μ IBright-GloLuciferase突光素酶检测试剂,室温避光震荡5min,置于光化学检测仪中，选择ONE-Glo程序进行检测。该模型以荧光素酶光化学值的变化直接指示样品对NF-K B-RE是否有阻断作用。因此，通过计算抑制率，可确定样品在NF-K B信号通路中对早期基因表达阻断作用的强弱。
权利要求
1.ー种对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物，由第I提取物、第2提取物和第3提取物组成，所述提取物的制备方法如下 a)将原料药金银花、玄參、当归、甘草按照重量比2.5 4 2. 5 4 I. 5 2.5 0. 5 I. 5的比例混匀； b)将所述原料药中加入水或40 60%的こ醇作为提取溶剂，所述原料药与所述提取溶剂的固液比为I : 5 10，提取2次以上，毎次I. 5 4. 5小时，过滤后合并滤液，得到提取液和残渣； c)将所述提取液浓缩至干，后加水混悬，上大孔树脂，采用水、30%こ醇、60 %こ醇和95%こ醇作为洗脱液进行连续淋洗，分别得到30%こ醇淋洗物即为所述第I提取物，60%こ醇淋洗物即为所述第2提取物、95%こ醇淋洗物即为所述第3提取物； d)将所述第1、2、3提取物混合，得到所述药物组合物。
2.如权利要求I所述的制备方法，其中所述原料药中金银花、玄參、当归、甘草的重量比为 3 : 3 : 2 : I。
3.如权利要求I所述的制备方法，其中所述步骤b)中こ醇的浓度为55%。
4.如权利要求I所述的制备方法，其中所述步骤b)中固液比为I: 6 8。
5.如权利要求I所述的制备方法，其中所述步骤b)中的提取次数为4次，毎次提取时间为2 4小时。
6.如权利要求I所述的制备方法，其中所述大孔树脂为AB-8大孔树脂。
7.如权利要求I所述的药物组合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 3 5. 4 0. 2 4. 2 I的比例进行混合。
8.如权利要求I所述的药物组合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比0. 6 3 0. 5 2. I I的比例进行混合。
9.如权利要求I所述的药物组合物，其中所述第I提取物、第2提取物、第3提取物按照重量比I. 34 1.05 I的比例进行混合。
全文摘要
本发明提供了一种对炎症因子表达具有抑制作用的药物组合物，由第1提取物、第2提取物和第3提取物组成，所述提取物的制备方法如下将原料药金银花、玄参、当归、甘草按照重量比2.5～4∶2.5～4∶1.5～2.5∶0.5～1.5的比例混匀后乙醇提取，得到提取液；所得提取液浓缩后上大孔树脂，分别30％乙醇、60％乙醇和95％乙醇洗脱，分别得到第1～3提取物；混合后得到药物组合物。本发明的药物组合物能够有效地抑制炎症因子表达。
文档编号A61P29/00GK102727654SQ20121009653
公开日2012年10月17日 申请日期2012年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者吴圣贤, 聂波, 陈立新 申请人:北京中医药大学