专利名称：依赖纳米粒子包裹gm-csf的缓释型肝癌细胞疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝癌细胞疫苗领域,具体涉及一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。
背景技术：
肿瘤免疫治疗是新兴的肿瘤治疗方法，在肿瘤综合治疗中具有较高的地位，而肿瘤疫苗是肿瘤免疫治疗的重要组成部分。肿瘤细胞疫苗在肿瘤疫苗中研究最早，应用也最为广泛，其临床应用前景及市场潜力相当之大。GVAX疫苗，即可分泌GM-CSF的灭活全肿瘤细胞疫苗，是目前应用较为广泛的肿瘤细胞疫苗。粒细胞-巨曬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colonystimulating factor, GM-CSF)是一种强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞增殖、分化和成熟的细胞因子(图I)。20世纪90年代初，Dranoff及Jaffee等比较了各类细胞因子在肿瘤细胞疫苗应用中免疫活性的差异。他们利用小鼠黑色素瘤细胞系B16构建出表达并分泌不同细胞因子或趋化因子的黑色素瘤细胞疫苗，照射之后免疫荷瘤小鼠，结果发现分泌GM-CSF的肿瘤疫苗抗肿瘤活性最强。GVAX疫苗经、射线灭活后通过局部注射到达体内，分泌产生的GM-CSF可募集大量巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cells，DC)，这些抗原递呈细胞能吞噬注射局部的肿瘤细胞，在GM-CSF作用下活化、成熟、迁移，并将肿瘤细胞携带的肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原进行处理、递呈，最终诱导产生杀伤肿瘤的特异性活化T淋巴细胞。众多临床研究者在上述研究的基础上开展了临床试验，进一步表明了 GVAX疫苗在临床应用中的积极意义。早期的研究者将GM-CSF基因直接导入自体肿瘤细胞，制成能够自分泌GM-CSF的肿瘤细胞，再将这些细胞经照射处理制成细胞疫苗接种人体。一项研究结果显示，在25例非小细胞肺癌患者中，18例肿瘤患者完成接种GVAX疫苗的全部疗程并产生阳性反应，其中2例患者治疗后以无肿瘤状态生存超过2年，另3例患者分别在治疗后4、8和15个月未发现肿瘤恶化的迹象，使疾病得以控制。另一项关于前列腺癌的研究显示，55例激素治疗失败的患者接种不同剂量的GM-CSF基因转染的异基因肿瘤疫苗后，高剂量组的中位生存期和骨转移病灶进展期均明显比低剂量组长。然而有研究者称，由于肿瘤细胞的自身缺陷，GM-CSF的表达水平可受到限制，只有当肿瘤部位在数天之内维持MOng/106/24h的GM-CSF分泌浓度，机体对肿瘤才能表现出较强的免疫反应，患者的生存时间才会得到明显的延长。在白血病相关研究中，Smith等使用K562 (慢性粒细胞白血病细胞系)制备旁分泌GM-CSF的bystander细胞，实验证明这种旁分泌途径产生的GM-CSF量明显高于自体肿瘤细胞。将其与自体白血病细胞混合成新型GVAX疫苗应用于AML(急性髓细胞性白血病)自体干细胞移植后的缓解治疗54例患者参与了该项研究,有46例患者经治疗后获得了完全缓解，3年无复发生存率(relapse free survival rate, RFS)为47. 4%,总体生存期(over — all survival, OS)为57. 4% ;而在预先接受GVAX免疫的28例患者中，RFS和OS分别为61. 8%和73. 4%。、
GVAX疫苗在美国对前列腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病的研究许多已进入III期临床试验，研究结果均证实这种新型GVAX疫苗安全性比早期肿瘤疫苗效果好，不良反应液较少,如注射部位瘙痒、红斑和水肿等局部反应以及一过性流感样症状,这点和其它疫苗的不良反应类似。GVAX疫苗国内尚未开展临床应用。目前我国对生物治疗的管理尚不完善，迄今为止明确的相关规定只有1993年卫生部颁布的“人的体细胞治疗申报临床试验指导原则”，但作为新兴的治疗肿瘤的方法，而且又是具有高科技含量的新兴产业，国家相关的相关政策一直是以积极扶持为主。虽然目前GVAX肿瘤疫苗技术显现出了较好的临床应用前景，但同时也存在着一些缺陷及隐患。I)以灭活的肿瘤细胞作为GM-CSF的载体，其分泌量较不稳定，我们研究发现B78H1-GM-CSF细胞系的GM-CSF分泌量从几十至数千ng/106/24h不等，且有文献报道称当、GM-CSF超过1000ng/106/24h时反而会募集骨髓抑制性细胞抑制免疫应答，故无法对病人进行标准化应用。2) 使用肿瘤细胞携带及分泌GM-CSF，其灭活照射剂量是一个关键问题照射剂量过低，则将产生致瘤性，尤其是不能充分灭活的K562细胞将给肿瘤病人体内带入新的肿瘤细胞；照射剂量过高，则影响GM-CSF的有效分泌。最近一项临床试验中发现，以灭活K562细胞作为GM-CSF的载体，可在个别患者体内检测出少数活K562细胞。所以，其安全性存在
着一定的隐患。3)以转基因技术为支撑的细胞治疗技术在我国尚未获得临床应用的许可，无法仿效国外进行临床试验研究。
发明内容
本发明针对上述问题，采用壳聚糖依赖的GM-CSF纳米缓释粒子联合灭活肝癌细胞制备新型肝癌GVAX疫苗，解决了现有GVAX肿瘤疫苗的安全性及GM-CSF分泌稳定性、时效性等问题。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，由载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，所述载GM-CSF壳聚糖纳米粒子大小为100±23. 68nm。所述依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，将由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液，搅拌2 3h小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，8000-12000 rpm离心10_15min，离心完成后以0. 9%氯化钠15_20KHz超声重悬30 45s，即可得到均匀的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，粒子大小为100±23. 68nm ;将载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制备得到依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。所述由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液是先将GM-CSF与三聚磷酸钠溶液混合后再滴加到壳聚糖溶液中，或者先将GM-CSF加入壳聚糖溶液后再滴加三聚磷酸钠溶液。所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在0. 5 1%体积分数的乙酸溶液中，质量浓度为 I 4mg/mL。
GM-CSF溶解在ddH20配置成质量浓度为120 180ug/mL的溶液、三聚磷酸钠溶解在ddH20中配置成质量浓度为0. 8 2. Omg/mL的溶液。所述三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2 4，所述GM-CSF与壳聚糖的质量比不超过29. 80mg/g,即每克壳聚糖最多包裹29. 8mg的GM-CSF。有益效果本发明提供的依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗与传统技术相比具有如下优势I)、GM-CSF的分泌稳定
壳聚糖GM-CSF缓释纳米粒子能持续分泌GM-CSF>40ng/106/24h的最低有效剂量并且能控制在有效范围，不会因为分泌量的不足或者过多(>1000ng/106/24h)而减弱甚至无法发挥抗肿瘤作用。GM-CSF的分泌时限得到延长，释放浓度也更为稳定，产生的杀伤性淋巴细胞数量随之增加，免疫应答维持的时间也得到延长，不但可以有效杀伤肿瘤发生部位的肿瘤细胞，也能高效清除迁移至外周循环中的肿瘤细胞。此外，重组细胞因子属商业制品，所以利用壳聚糖直接包裹重组GM-CSF就避免了转基因技术临床应用的困难。2)、使用安全
研究者曾通过不同的方法基因修饰肿瘤细胞，使其分泌GM-CSF，目前应用较多的是利用旁分泌细胞分泌GM-CSF，比如小鼠黑色素瘤细胞(B78H1)或者人慢性粒细胞白血病细胞(K562)，照射剂量的选择较为两难，既不能过度照射而影响GM-CSF的分泌，又不能剂量过低而引起旁分泌细胞在体内扩增，使得机体具有产生新的肿瘤的隐患。然而，以壳聚糖作为GM-CSF的载体则没有这种担忧，本方法弃用肿瘤细胞分泌GM-CSF，可将肝癌细胞充分照射灭活，仅保留其免疫原性，大大增加了疫苗的安全性。3)、无毒、易吸收
壳聚糖作为一种天然多糖，能被生物体内的溶菌酶降解生成天然的代谢物，具有无毒、能被生物体完全吸收的特点，因此用它作药物缓释剂具有较大的优越性。壳聚糖具有激活机体系统、介导机体系统的系列生物学效应，提高吞噬细胞的系统功能。巨噬细胞表面存在着细菌多糖的受体，壳聚糖作为细菌多糖的类似物，能刺激巨噬细胞活化，产生如下反应促进其吞噬功能，增强它在其它免疫应答中的协同效应，从而实现机体对T细胞、NK细胞和B细胞的调节，介导机体的细胞免疫应答和体液免疫应答。
图I :GM_CSF的免疫学活性作用示意 图2 :壳聚糖为基质的GM-CSF体外释放曲线；
图3 :载GM-CSF壳聚糖纳米粒子TEM照片；
图4 :载GM-CSF壳聚糖纳米粒子的激光粒径分析结果；
图5使用新型GVAX疫苗及传统GVAX疫苗免疫荷瘤小鼠后的肿瘤体积大小、无瘤生存期比较。
具体实施例方式实施例I :载GM-CSF壳聚糖纳米粒子的制备
材料壳聚糖(Chitosan，脱乙酰化程度75 85%，448877)、三聚磷酸钠(TPP，238503)均购自SIGMA-ALDRICH公司；重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM_CSF)购自PEPROTECH (315-03), Mouse GM-CSF Platinum ELISA 购自 eBioscience iBMS283\壳聚糖溶解在0. 8%体积分数的乙酸溶液中，配成质量浓度为lmg/mL的壳聚糖溶液，rmGM-CSF溶解在ddH20配置成质量浓度为150ug/mL的溶液、三聚磷酸钠溶解在ddH20中配置成质量浓度为I. 5mg/ml的溶液。反应过程1.8ml lmg/mL壳聚糖溶液加到3. 2ml ddH20中，并按100ul/min的速度将 Iml (400ul 150ug/mL 的 rmGM-CSF+600ul I. 5mg/ml 的 TPP)溶液滴入上述溶液中，继续磁力搅拌2. 5小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，IOOOOrpm离心12min，离心完成后
以0. 9%氯化钠超声重悬45s，即可得到均一的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，测得包封率达到87. 08%,并进行GM-CSF体外释放情况(图2)，以及TEM (透射电镜)(图3)和DLS (激光粒径分析仪)(图4)测试。如图2示，在前10小时中，由于吸附在壳聚糖纳米粒子表面的GM-CSF分子释放导致的突释现象，之后再由纳米微球内部的rmGM-CSF进入缓慢释放期。图3显示载GM-CSF纳米粒子的大小为100±23. 68nm，且通过图4可知该纳米溶液均一性良好，因DLS测量壳聚糖纳米粒子的粒径是在溶液中测定，壳聚糖纳米粒子遇水体积会变大。实施例2 :依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗对小鼠的抑瘤实验 I)动物和细胞系
6-8-周龄的雄性C57BL/ (H-2b)小鼠作为实验用鼠，小鼠肝癌细胞系Hepal_6用作小鼠肝癌模型及疫苗制备；小鼠黑色素瘤细胞系B78H1-GM-CSF购自礼来公司，该细胞MHC I类分子表达缺失，并可高效分泌GM-CSF。两种细胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37°C，5%C02条件下培养。2)疫苗构建
依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型小鼠肝癌细胞疫苗(以下简称新型GVAX小鼠疫苗)，由实施例I制备好的壳聚糖纳米粒子及灭活的小鼠肝细胞肝癌细胞系Hepal-6组成，传统GVAX小鼠疫苗由灭活的Hepal-6和B78H1-GM-CSF细胞构成。制备方法如下从DMEM培养基中收获H印al-6和B78H1-GM-CSF细胞后，使用PBS重悬，5000rads y照射器(ThermoScientific, EPD Irradiator IRR-1)照射细胞。照射后的细胞失去增殖能力，并重悬至2XlOVml ;将实施例I制备好的载GM-CSF的壳聚糖纳米悬液与灭活的Ifepal-6 (107/ml)等体积混合。同样方法制备空载壳聚糖纳米颗粒疫苗悬液。3)肿瘤免疫
6 8-周龄的雄性C57BL/ (H-2b)小鼠作为实验用鼠，小鼠均饲养于IVC笼中，22°恒温恒湿，标准饮食。实验共分五组，每组20只，将肿瘤大小，无瘤生存期作为观察肝癌疫苗效果的主要指标。C57BL/6 (H-2b)小鼠皮下注射0.1 mL 107/ml H印1_6活细胞。第三天给予疫苗处理，I周后强化免疫一次。每三天测量并记录肿瘤大小(1/2*长*宽2)。实验分组空白对照组、空白壳聚糖纳米组、空白壳聚糖纳米和肿瘤细胞混合组、传统GVAX疫苗组、新型纳米GVAX组，上述各组在相同的实验条件下，同步进行。通过上述分组可以分别研究GM-CSF、疫苗中混合的Hepal-6以及空白壳聚糖纳米颗粒等因素的抗肿瘤作用以及依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型小鼠肝癌细胞疫苗(新型纳米GVAX组)与传统GVAX的比较。实验结果如图5所示，从图5-a中可以看出新型纳米GVAX处理组的肿瘤体积在肿瘤接种后第36天平均体积为5mm3小于空白对照(35mm3)以及各实验组，且具有统计学意义(P〈0. 05)，从图5-b中可以看出80%的新型纳米GVAX处理组的C57BL/6小鼠在肿瘤接种后第100天仍然无瘤生长，高于其它各组，并具有统计学意义(P〈0. 05)。从图5-c中可以看出疫苗接种后第30天，处理组(5mm3)小鼠较未处理组(20mm3)小鼠的平均肿瘤体积明显减小，有统计学意义(P〈0. 05)。
以上实施例不是对本发明内容的限制，具体实施时也可以先将GM-CSF加入到壳聚糖溶液中，然后再滴加三聚磷酸钠，形成由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液。所用的壳聚糖溶液的质量浓度在f4mg/mL范围内，GM-CSF质量浓度为120 180ug/mL的溶液、三聚磷酸钠质量浓度为0. 8 2. Omg/mL的溶液。三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2 4，GM-CSF与壳聚糖的质量比不超过29. 80mg/g即可，应用时可以根据需要在最大限度范围内酌情添加。
权利要求
1.一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，其特征在于由载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，所述载GM-CSF壳聚糖纳米粒子大小为100土 23. 68nm。
2.权利要求I所述依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，其特征在于将由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液，搅拌2 3h小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，8000 12000 rpm离心10 15min,离心完成后以0. 9%氯化钠15 20KHz超声重悬30 45s，即可得到均匀的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，粒子大小为100±23. 68nm ;将载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制备得到依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。
3.根据权利要求2所述的依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液是先将GM-CSF与三聚磷酸钠溶液混合后再滴加到壳聚糖溶液中，或者先将GM-CSF加入壳聚糖溶液后再滴加三聚磷酸钠溶液。
4.根据权利要求2或3所述的依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖溶液是将壳聚糖溶解在0. 5 1%乙酸溶液中，质量浓度为4mg/mL，所述GM-CSF溶解在ddH20配置成质量浓度为12(Tl80ug/mL的溶液、所述三聚磷酸钠溶解在ddH20中配置成质量浓度为0. 8^2. Omg/mL的溶液。
5.根据权利要求2或3所述的依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗的制备方法，其特征在于所述三聚磷酸钠与壳聚糖的质量比为1:2 4，所述GM-CSF与壳聚糖的质量比不超过29. 80mg/g。
全文摘要
一种依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗，由载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制成，制备方法为将由GM-CSF、三聚磷酸钠、壳聚糖溶液组成的混合溶液，搅拌2～3h小时后收集反应液体，利用丙三醇离心，8000～12000rpm离心10～15min，离心完成后以0.9%氯化钠15～20KHz超声重悬30～45s，即可得到均匀的载GM-CSF的壳聚糖纳米粒子，测得包封率为87.08±2.32%，粒子大小为100±23.68nm；将载GM-CSF壳聚糖纳米粒子和灭活的肝癌细胞混悬制备得到依赖纳米粒子包裹GM-CSF的缓释型肝癌细胞疫苗。疫苗制备简单、安全性强、有效性高。
文档编号A61P35/00GK102743745SQ20121023654
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者侯嘉杰, 孙倍成, 王学浩, 陈晨 申请人:孙倍成, 王学浩