专利名称：聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及高分子化合物的新用途，特别涉及聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用。
背景技术：
脓毒血症(sepsis)是指由感染引 起的全身炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome, SIRS),临床上证实有细菌存在或有高度可疑感染灶。虽然脓毒血症是由感染引起，但是一旦发生后，其发生发展遵循其自身的病理过程和规律，故从本质上讲脓毒血症是机体对感染性因素的反应。脓毒血症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒血症病例，美国每年有75万例脓毒血症患者，并且这一数字还以每年I. 5% 8. 0%的速度上升。脓毒血症的病情凶险，病死率高，全球每天约14，000人死于其并发症，美 国每年约21. 5万人死亡。据国外流行病学调查显示，脓毒血症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒血症的病死率仍高达30% 70%。另外，脓毒血症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。脓毒血症的根本发病机制尚未明了，涉及到复杂的全身炎症网络效应、基因多态性、免疫功能障碍、凝血功能异常、组织损伤以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面，与机体多系统、多器官病理生理改变密切相关。目前对脓毒血症的治疗还没有根本性突破，原因在于脓毒血症的发病根本机制仍未能阐明。因此针对脓毒血症的治疗仍然更多集中于纠正脓毒血症引起的病理生理后果上。脓毒血症发病机制的复杂性在于感染导致释放的炎症介质通过神经-内分泌-免疫系统动员了全身多种细胞和多个脏器系统，构成了复杂的网络机制，这一系统具有级联放大、相互制约的特点，寻找在这个网络结构中的关键平衡点进行免疫调理可能会对脓毒血症的治疗带来新的突破。聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)是ー种人工合成的纳米级大分子化合物，由于具有单分散性、内部空腔及表面丰富的可修饰基团等独特结构优势，PAMAM在生物医药领域，如基因药物载体、助溶剂、高效催化剂及纳米材料等方面，有非常广泛的应用和研究。PAMAM-NH2合成方法成熟，目前市售有Gl. 0-G10. 0等数十种，随着代数的增加，PAMAM纳米尺寸、末端氨基数目、形状和结构特征也会随之变化。目前，现有技术没有关于聚酰胺胺型树枝状大分子预防或治疗脓毒血症的文献报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于通过大量试验对聚酰胺胺型树枝状大分子(PAMAM-NH2)进行体外活性研究，提供一种聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的新用途。本发明创造性地分别用ESBLs-EC菌悬液、ESBLs-EC和MRSA混合菌悬液，通过腹腔注射构建两种BALB/c脓毒血症感染模型，第一次证实10+10 mg/kg和20 mg/kg G2. 0PAMAM-NH2可显著提高BALB/c小鼠的生存率，延长小鼠生存时间，改善小鼠生存质量。令人振奋的是，在两种脓毒血症模型中，同时观察到10+10 mg/kg G2. 0 PAMAM-NH2组治疗效果明显优于20 mg/kg组，表明多次低剂量给药优于单次高剂量给药，且提前给药可明显预防感染。这可能与药物在体内的吸收、代谢、分布和消除有夫。另外，本发明人通过腹腔注射G2. 0观察BALB/c小鼠急性毒性反应，并第一次证实G2. 0 PAMAM-NH2的半数致死剂量为84. 04 mg/kg,小鼠最大耐受量在30-47 mg/kg，至少是体内给药剂量(10-20 mg/kg)的I. 5-3倍。因此，根据上述研究结果，发明人提供了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0-4. 0代聚酰胺胺型 树枝状大分子。优选地，所述脓毒血症是感染耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSA或/和产超广谱^ -内酰胺酶的大肠杆菌ESBLs-EC后引起的脓毒血症。进ー步优选地，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0代聚酰胺胺型树枝状大分子。本发明所涉及的聚酰胺胺型树枝状大分子用于预防或治疗脓毒血症具有如下优势
(I)药效显著。具体表现在ESBLs-EC所致的BALB/c小鼠败血症模型实验中，10+10mg/kg和20 mg/kg组G2. 0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间，提高生存率，降低小鼠血液CFU计数，明显减轻小鼠肺脏和肝脏损伤，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药。ESBLs-EC和MRSA所致的BALB/c小鼠败血症模型实验中，10+10 mg/kg和20 mg/kg组G2.0 PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间,提高生存率，且前者给药方式显著优于后者，提示多次低剂量给药效果好于单次高剂量给药，且提前给药可预防感染。(2)毒性低。体内急性毒性评价结果表明，G2. 0 PAMAM-NH2体内生物相容性较好，腹腔注射对BALB/c小鼠半数致死剂量为84. 04 mg/kg,高剂量对小鼠的脏器损伤主要表现为不同程度微血栓的形成。
图I : BALB/c小鼠肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和心脏的HE染色结果图(放大倍数，X200);其中(A-E)为正常对照组；(A，-E，)腹腔注射 G2. 0 PAMAM-NH2180 mg/kg I h后小鼠脏器HE染色组；(A”-E”)为腹腔注射G2.0 PAMAM-NH2 400 mg/kg I h后小鼠脏器HE染色组。图2 : G2.0 PAMAM-NH2体内抗感染治疗效果图；其中(A)BALB/c小鼠腹腔注射ESBLs-EC (7. 12X105 CFU)后，分别给予腹腔注射G2. 0 PAMAM-NH2 10 mg/kg (#),20 mg/kg (▲)，or 10+10 mg/kg ( )(感染前 12 h 和感染后 0. 5 h 分别给予 10 mg/kg),对照组给予腹腔注射氨苄西林20 mg/kg (*)，模型组给予不含药物的稀释液(■) ;(B)感染7天后BALB/c小鼠的生存率· *P<S). 05,林P<Q. 01与模型组相比;#■· 05, ##P<Q. 01与氨苄西林组相比(η = 12只/组)。图3: BALB/c小鼠血液中ESBLs-EC的平板克隆计数图；BALB/c小鼠腹腔注射ESBLs-EC后12 h，尾静脉取血倍比稀释，涂布于琼脂平板，37° C培养24 h后计数CFU. “一”表示每组CFU的平均数(n=6只/组)，*/Y0. 05，**/Y0. 01与模型组相比。图4 BALB/c小鼠肺脏的HE染色结果图(放大倍数，X 200);其中(A)正常对照组；(B)模型组；(C) 20 mg/kg 氨苄西林组；(D) 10 mg/kg G2. O PAMAM-NH2; (E) 20 mg/kg G2. O PAMAM-NH2; (F) 10+10 mg/kg G2. O PAMAM-NH2 (感染前 12 h 和感染后 O. 5 h 分别给予10 mg/kg)ο图5 BALB/c小鼠肝脏的HE染色结果图(放大倍数，X200);其中(A)正常对照组；(B)模型组；(C) 20 mg/kg 氨苄西林组；(D) 10 mg/kg G2. O PAMAM-NH2 ； (E) 20 mg/kgG2. O PAMAM-NH2 ； (F) 10+10 mg/kg G2. O PAMAM-NH2 (感染前 12 h 和感染后 O. 5 h 分别给 予 10 mg/kg)ο图6 G2. O PAMAM-NH2体内抗感染治疗效果图。其中(A) BALB/c小鼠腹腔注射ESBLs-EC (8. 02X IO5CFU)和 MRSA (6. 56X IO8CFU)后，分别给予腹腔注射 G2. O PAMAM-NH2
10mg/kg (·)，20 mg/kg (▲)，or 10+10 mg/kg ( )(感染前 12 h 和感染后 0· 5h分别给予10 mg/kg);对照组给予腹腔注射氨苄西林20 mg/kg (*);模型组给予不含药物的稀释液(■ ). (B)感染7天后BALB/c小鼠的生存率(n = 10只/组).*P<S). 05，**P<^. 01与模型组相比；#Ρ<ν· 05与氨苄西林组相比。
具体实施例方式
本发明创造性地通过试验对聚酰胺胺型树枝状大分子(PAMAM-NH2)进行体内活性研究，为PAMAM-NH2开发成新一代的临床抗菌药物奠定了基础。以下以G2. O PAMAM-NH2为例，研究其毒性及其治疗小鼠脓毒血症模型的疗效。实施例I : G2. O PAMAM-NH2的毒性研究及其治疗小鼠脓毒血症模型的试验研究 I，材料和方法
1.1，实验菌株
ESBL-EC和MRSA菌株(见表I)用于本部分实验。表I试验所用的2株耐药菌株
中文名称I英文名称I英文缩貧
耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 methicillinresistantS ai/rei/sXJ75302MRSA
产 ESBLs 的大肠杆菌|ESBLs-producing^ coJiATCC35218|ESBLs-ECI. 2，实验动物
无特殊病原体的BALB/c，雌雄各半，18-22 g，购自第四军医大学实验动物管理中心。本研究所有动物实验均符合第四军医大学动物管理中心和伦理委员会相关规定。1.3，试剂和药品
G2. O PAMAM-NH2 (10. 04% w/w水溶液)购自美国Dendritech公司；营养肉汤培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；牛血清白蛋白(BSA);购自美国Gibico公司；乙酸、无水乙醇、甘油、石蜡、二甲基亚砜、二甲苯和甲醛等分析纯试剂购自天津试剂公司。抗生素氨苄西林购自中国药品生物制品检定所。I. 4，主要溶液配方
营养肉汤培养基1. 9 g营养肉汤干粉，加入100 mL冷蒸懼水混勻,静置10 min,微火煮沸(隔石棉铁丝网或磁力加热搅拌器)，待干粉完全溶解后，高压灭菌121°C，20 min。PBS 缓冲液准确称量KCl O. 2 g, KH2PO4 O. 24 g, NaCl 8. O g, Na2HPO4 ·2Η20 I. 56g,加入100 mL去离子水充分溶解后，调pH到7. 4，定容100 mL后分装，高压灭菌121°C，20 min,即为O. IM PBS母液。将其用无菌水稀释10倍，即为O. OlM PBS溶液，现用现配。2，方法
2.1，小鼠急性毒性实验 观察受试药品依次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况，详细记录小鼠的中毒表现，并采用改良寇氏法(Karber氏法)计算半数致死量(LD5tl)或最大耐受量，用以评价药物的安全性。2. I. I动物准备BALB/c小鼠，雌雄各半，18_20 g，饲养于代谢笼内，给予自由饮水，普通颗粒饲料喂养。动物实验室环境湿度50%土 10%，早6点到晚6点进行12 h照明，其余时间为黑暗，温度23 ± 2 °C，适应饲养2 d后，随机分组。2. I. 2，预实验取健康BALB/c小鼠，每组5只，通过腹腔注射给药，观察小鼠死亡情况至少7天，找到100% (LD100)及0% (LD0)小鼠死亡的剂量。2. I. 3，LD50测定根据预实验结果确定剂量和分组数，按照公式2_1计算从高到低相邻两个剂量组的等比系数r，
权利要求
1.聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0-4. 0代聚酰胺胺型树枝状大分子。
2.根据权利要求I所述聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，其特征在于所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2. 0代聚酰胺胺型树枝状大分子。全文摘要
本发明公开了聚酰胺胺型树枝状大分子在制备预防或治疗脓毒血症的药物中的应用，所述的聚酰胺胺型树枝状大分子为2.0-4.0代聚酰胺胺型树枝状大分子。本发明所涉及的聚酰胺胺型树枝状大分子用于预防或治疗脓毒血症具有药效显著、毒性低的优势，可显著延长患者的生存时间，提高生存率，减轻脏器损伤。
文档编号A61P29/00GK102743411SQ20121025905
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者侯征, 周颖, 罗晓星, 薛小燕, 达飞, 陈晓晴 申请人:中国人民解放军第四军医大学