专利名称：透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法
技术领域：
本发明属于生物活性材料领域，涉及软骨组织修复、填充及组织工程修复材料，具体涉及ー种透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法。
背景技术：
关节软骨是人体中较为特殊的ー种组织，它没有血管、神经和淋巴细胞，因而自修复能力很差。目前临床上传统的治疗方法主要有微骨折术、软骨下骨钻孔术、软骨下磨削术、自体软骨移植和自体细胞移植术等，但是这些方法存在许多不足，且会给病人带来二次创伤。目前还没有ー种方法能够成功的替代损伤部位并达到软骨再生的目的。软骨组织工程是目前研究最热的ー种方法，是将细胞、环境因子、支架材料三者结合，体外模拟细胞生存的最佳微环境，使细胞活性和表型均能与体内情况相似，从而达到修复软骨组织的目的。 在软骨修复中，软骨细胞与基质之间的相互作用至关重要，良好的水凝胶支架材料应提供与天然软骨组织相似的结构和性能。软骨细胞外基质主要由II型胶原蛋白和多糖组成。胶原呈网络结构分布于整个软骨基质中，其主要功能是为软骨细胞提供张カ和承受力，为软骨细胞的粘附提供基础，并參与软骨细胞表型分化的调节。在这类软骨组织修复材料中，水凝胶组织工程支架由于与软骨细胞外基质具有相似的特性而受到了广泛的关注。目前制备水凝胶的方法有物理交联法和化学交联法物理交联法利用分子间氢键作用，离子静电作用或是亲疏水作用等，由于分子间作用力不强，导致物理交联法制备的水凝胶不稳定，容易水解或是熔融；化学交联法制备的水凝胶结构性能稳定，机械强度较好，但是大部分化学反应需要添加各种有毒的弓I发剂和交联剂。针对这些缺点，近几年出现了利用快速有效无毒的Diels-Alder点击化学反应制备水凝胶软骨组织工程支架的方法。目前，用于软骨修复水凝胶的材料包括天然生物材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸(简称HA)、明胶(简称G)等，和合成高分子材料，如PLGA、PLA、PCL等两大类。合成高分子水凝胶力学性能优异，但是由于缺乏细胞结合位点和生物相容性而限制其在软骨修复上的应用；对于天然生物材料，一般较难形成水凝胶体系，且存在降解速率快和力学性能不能满足需求等缺点。将天然材料与合成材料进行复合可以在改善力学性能的同时提高材料的生物相容性，但是与天然的软骨细胞外基质相比相差甚远。还有ー类通过对胶原进行修饰和改性制备水凝胶修复材料的方法，但是胶原分子量大，不容易与其他物质相互键合，除了六氟异丙醇几乎不溶于任何溶剤，而六氟异丙醇毒性強，不适合运用在生物医学材料领域。因此要得到胶原溶液很困难，对胶原进行修饰和改性更是难上加难，致使其并不适合作为ー种水凝胶材料。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的缺点，提供ー种透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法，并将其应用于软骨关节修复。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案
透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法，包括如下步骤
(1)在透明质酸的2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中，加入4-(4,6-ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化剂后搅拌0. 5^1h,再逐滴加入糠胺，反应24 48h，透析3飞天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体；
(2)在明胶水溶液中加入碳ニ亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌均匀后，加入呋喃甲酸，反应24 48h，透析3飞天，冷冻干燥得到改性明胶固体；
(3)将步骤(I)中得到的改性透明质酸固体和步骤(2)中得到的改性明胶固体共同溶解于2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中得到混合溶液； (4)将双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶解于2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中得到双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶液；
(5)将步骤(4)得到的双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶液加入步骤(3)得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在37飞(TC水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态；
(6)将步骤(5)得到的水凝胶浸泡在硫酸软骨素钠盐的2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中，加入碳ニ亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应24 48h，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架。步骤(I)中，所述透明质酸与2-(N_吗啡啉)こ磺酸缓冲液的质量体积比为
0.2^0. 8% ;所述透明质酸、糠胺与4-(4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的摩尔比为1:2: (2 6)。步骤(2)中，所述明胶水溶液的浓度为0. 5^1. 5% w/v ;所述碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:2，且碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总质量为明胶质量的4/5 ;所述呋喃甲酸与明胶的质量比为(广3) :4。步骤(I)和步骤(2)中，所述透析的截留分子量为14000 ;所述冷冻干燥的步骤为先于-2(T-70°C冷冻24 48h成冰状，然后继续冻干48 72h。步骤(3)中，所述混合溶液中改性透明质酸固体的浓度为f 2% w/v,改性明胶固体的浓度为0. 5 I. 5% w/vo所述双端基马来酰亚胺聚こ烯醇的质量与改性透明质酸固体和改性明胶固体的质量之和的比值为1:4。步骤(6)中，所述硫酸软骨素钠盐与2-(N_吗啡啉)こ磺酸缓冲液的质量体积比为r3% ;所述碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:2，且碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总质量为硫酸软骨素钠盐质量的4/5。所述2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液的浓度为100mmol/L，pH=5. 5。本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果
(1)本发明采用Diels-Alder点击化学反应制备复合水凝胶仿生支架，凝胶化时间短，反应条件温和选择性高，且无副产物，无需加入任何交联剂和引发剂，保证了水凝胶仿生支架的无毒性和细胞相容性；
(2)本发明通过控制反应基团的摩尔比，可以制备不同交联密度且力学性能和降解性能可调控的复合水凝胶仿生支架；(3)本发明通过控制交联密度，制备的复合水凝胶仿生支架可以获得不同尺寸的网络结构，从而筛选最适合软骨细胞生长的孔径网络；
(4)本发明选用的透明质酸、明胶和硫酸软骨素(简称CS)作为材料制备水凝胶，从成分上模拟了胶原蛋白和多糖的天然软骨细胞外基质，为软骨细胞的生长和代谢提供了ー个更加相似的微环境。
图I为本发明的透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的扫描电镜图片。图2为本发明实施例I和实施例2制备的两种不同比例骨修复仿生支架的应カ应变曲线图。图3为本发明实施例I和实施例2制备的两种不同比例骨修复仿生支架的降解曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进ー步详细说明，但本发明要求保护的范围不限于此。实施例I
(1)在浓度为0.2%的透明质酸的2-(N-吗啡啉)こ磺酸(简称MES)缓冲液(透明质酸质量为0. 5g)中，加入0. 654g 4- (4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(简称DMTMM)，搅拌0. 5h，再逐滴加入220 u L糠胺，反应24h，透析3天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体；
(2)在浓度为0.5%的明胶水溶液IOOml中加入400mg碳ニ亚胺(简称EDC)和267mgN-羟基琥珀酰亚胺(简称NHS)搅拌均匀后，加入125mg呋喃甲酸，反应24h，透析3天，冷冻干燥得到改性明胶固体；
(3)将步骤(I)中得到的改性透明质酸固体30mg和步骤(2)中得到的改性明胶固体45mg共同溶解于MES缓冲液中得到混合溶液，二者体积浓度分别为1%和I. 5% ；
(4)将37.5mg的双端基马来酰亚胺聚こ烯醇(简称MAL-PEG-MAL)溶解于MES缓冲液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)将步骤(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步骤(3)得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在37°C水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态；
(6)将步骤(5)得到的水凝胶浸泡在浓度为1%的硫酸软骨素钠盐(简称CS)的MES缓冲液中，加入500mg EDC和330mg NHS并放入摇床中反应24h，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架。图I为本发明实施例I制备的透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架冻干后的扫描电镜图谱，可以看出，仿生支架具有相互贯穿的网状结构，网络尺寸为150 250 u mD实施例2
(I)在浓度为0. 4%的透明质酸的MES缓冲液(透明质酸质量为0. 5g)中，加入I. 38gDMTMM,搅拌lh，再逐滴加入220 u L糠胺，反应36h，透析4天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体；
(2)在浓度为1%的明胶水溶液中加入800mgEDC与533mg NHS搅拌均匀后，加入500mg呋喃甲酸，反应36h,透析4天,冷冻干燥得到改性明胶固体；
(3)将步骤(I)中得到的改性透明质酸固体45mg和步骤(2)中得到的改性明胶固体105mg共同溶解于3ml的MES缓冲液中得到混合溶液，二者体积浓度分别为I. 5%和3. 5% ；
(4)将75mg的MAL-PEG-MAL溶解于MES缓冲液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)将步骤(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步骤(3)得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在45°C水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态；
(6)将步骤(5)得到的水凝胶浸泡在浓度为2%的CS的MES缓冲液中，加入IgEDC与660 mg NHS并放入摇床中反应24h，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架。图2为本发明实施例I和实施例2制备的两种不同比例骨修复仿生支架的应カ应变曲线图，可以看出，本发明制备的复合水凝胶仿生支架的压缩模量最大可达1278Pa，明显高于其他方法制备的明胶和透明质酸复合水凝胶的力学性能。图3为本发明实施例I和实施例2制备的两种不同比例骨修复仿生支架的降解曲线图，可以看出，在PBS缓冲液中，本发明制备的不同比例的水凝胶仿生支架在21天内都不发生降解现象；尽管在透明质酸酶溶液中，水凝胶会发生酶解现象，但是与传统的水凝胶相比降解速率明显下降。说明本发明制备的复合水凝胶仿生支架具有良好的抗降解性能。实施例3
(1)在浓度为0.8%的透明质酸的MES缓冲液(透明质酸质量为0. 5g)中，加入2. 02gDMTMM,搅拌lh，再逐滴加入220 u L糠胺，反应48h，透析5天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体；
(2)在浓度为I.5%的明胶水溶液中加入I. 2g EDC与0. 8g NHS搅拌均匀后，加入I. Ig呋喃甲酸，反应48h,透析5天，冷冻干燥得到改性明胶固体；
(3)将步骤(I)中得到的改性透明质酸固体60mg和步骤(2)中得到的改性明胶固体165mg共同溶解于MES中得到混合溶液，二者体积浓度分别为2%和5. 5% ；
(4)将150mg的MAL-PEG-MAL溶解于MES缓冲液中得到MAL-PEG-MAL溶液；
(5)将步骤(4)得到的MAL-PEG-MAL溶液加入步骤(3)得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在50°C水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态；
(6)将步骤(5)得到的水凝胶浸泡在浓度为3%的CS的MES缓冲液中，加入I.5g EDC与Ig NHS并放入摇床中反应24h，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架。
权利要求
1.透明质酸/明胶/硫酸软骨素骨修复仿生支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)在透明质酸的2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中，加入4-(4,6-ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐活化剂后搅拌0. 5^1h,再逐滴加入糠胺，反应24 48h，透析3飞天，冷冻干燥得到改性透明质酸固体； (2)在明胶水溶液中加入碳ニ亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌均匀后，加入呋喃甲酸，反应24 48h，透析3飞天，冷冻干燥得到改性明胶固体； (3)将步骤(I)中得到的改性透明质酸固体和步骤(2)中得到的改性明胶固体共同溶解于2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中得到混合溶液； (4)将双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶解于2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中得到双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶液； (5)将步骤(4)得到的双端基马来酰亚胺聚こ烯醇溶液加入步骤(3)得到的混合溶液中，搅拌均匀后，在37飞(TC水浴中进行点击化学反应直至形成透明的交联水凝胶状态； (6)将步骤(5)得到的水凝胶浸泡在硫酸软骨素钠盐的2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液中，加入碳ニ亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺搅拌反应24 48h后，得到透明质酸/明胶/硫酸软骨素软骨修复仿生支架。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中，所述透明质酸与2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液的质量体积比为0. 2^0. 8% ;所述透明质酸、糠胺与4-(4，6- ニ甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐的摩尔比为1:2: (2飞)。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述明胶水溶液的浓度为0. 5^1. 5% w/v ;所述碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:2，且碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总质量为明胶质量的4/5 ;所述呋喃甲酸与明胶的质量比为(广3) :4。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)和步骤(2)中，所述透析的截留分子量为14000 ;所述冷冻干燥的步骤为先于-2(T-70°C冷冻24 48h成冰状，然后继续冻干48 72h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述混合溶液中改性透明质酸固体的浓度为广2% w/v，改性明胶固体的浓度为0. 5^1. 5% w/v。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述双端基马来酰亚胺聚こ烯醇的质量与改性透明质酸固体和改性明胶固体的质量之和的比值为1:2 2: I。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述硫酸软骨素钠盐与2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液的质量体积比为f 3% ;所述碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为3:2，且碳ニ亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的总质量为硫酸软骨素钠盐质量的4/5。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述2-(N-吗啡啉)こ磺酸缓冲液的浓度为 10Ommol/T,, pH=5. 5。
全文摘要
本发明公开了一种透明质酸/明胶/硫酸软骨素软骨修复仿生支架的制备方法，包括如下步骤在透明质酸的MES缓冲液中，加入活化剂和糠胺，得到改性透明质酸固体，在明胶水溶液中加入EDC/NHS，再加入呋喃甲酸，得到改性明胶固体，将二者溶于MES缓冲液中得到混合溶液；将MAL-PEG-MAL溶于MES缓冲液，再加入混合溶液中，37℃水浴进行点击化学反应形成透明的交联水凝胶；将水凝胶浸泡在硫酸软骨素钠盐的MES缓冲液中，加入EDC/NHS搅拌反应，得到软骨修复仿生支架。本发明制备的仿生支架具有相互贯穿的网状结构，具有优良的生物相容性和生物活性，以及更好的抗压强度、抗溃散性和降解性能，制备工艺简单易操作。
文档编号A61L27/22GK102772823SQ20121025900
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者余凤, 张青, 曹晓东, 曾蕾, 陈晓峰 申请人:华南理工大学