乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用的制作方法

专利名称：乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用的制作方法
乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用。
背景技术：
细胞凋亡对于生物体，尤其是高等有机体是非常重要的一个生理过程。由于细胞凋亡的存在，发育过程中的器官及形态结构的形成，细胞合理数量的动态维持，以及对于不需要的甚至是有害的细胞(如肿瘤)的清除才变得有可能。
细胞凋亡过程中最显著的标志就是染色体断裂以及核酸降解。一般而言，在凋亡细胞中，染色体经过凝集之后，首先染色体被降解为50 300kb长度的DNA大片段，继而在核小体连接处进行有规律断裂，形成180-200bp或200bp整倍数的DNA片段，随后含片段化 DNA的凋亡小体被巨噬细胞或邻近细胞吞噬，最终DNA被彻底降解，从而使细胞彻底失去基因组复制和基因转录的能力，导致凋亡不可逆的进行下去。生物化学与遗传学研究表明，细胞凋亡过程中染色体DNA的降解是一个包括不同活性，不同底物特异性的多种核酸酶共同参与的非常复杂的生物化学过程。凋亡过程中，上述多种核酸酶之间或者与其它辅助因子之间相互配合，一步一步地推进着染色体断裂以及DNA降解的过程。尽管这一过程极其重要，但是它是如何激活的，如何被具体执行的？染色体DNA的降解是凋亡的原因还是结果？ 这些问题至今无法给出答案。另外，尽管体内实验已证实有一部分核酸酶参与了这个过程， 但是参与凋亡过程中染色体DNA降解的酶远不止已发现的这些，还有很多的酶在特定的情况下也参与了凋亡细胞染色体DNA的降解。
目前已认知的，哺乳动物细胞中参与凋亡过程中染色体DNA降解的DNA酶主要为 CAD/DFF40(Caspase activated deoxyribonuclease/40~kDa DNA fragmentation factor) ,AIF (apoptosis inducing factor)以及 Endo G (Endonuclease G)4。这三种酶各自在空间分布以及底物的偏好上有着非常明显的差异。在正常生长的细胞中，CAD/DFF40 主要分布在细胞质内，它与其抑制因子ICAD/DFF45形成复合体而处于沉默状态。当凋亡启动后，在活化的Caspase3/7的作用下，ICAD/DFF45被剪切失活，释放出游离的CAD。CAD进入细胞核，在组蛋白Hl (Histone Hl),高速迁移率族蛋白(high mobility group protein, HMG)以及拓扑异构酶II (Topoisomerase II)等染色体蛋白的帮助下,促进核小体间DNA 剪切，形成3’端带有羟基(3’-0H)的DNA片段。AIF最初被认为是线粒体内的一个氧化还原酶。当细胞受到凋亡刺激后，由于线粒体膜通透性的改变，AIF被释放到线粒体外，并进入细胞核引起染色体凝集和DNA断裂大片段(50kDa)的生成。由于AIF没有传统的核酸酶结构域以及有记载的核酸酶活性，有人认为AIF是通过与某个核酸酶效应分子(nuclease effector)来发挥染色体片段化的功能。与AIF类似，Endo G也是一个在线粒体里被发现的不依赖于Caspase激活的核酸酶。当细胞受到凋亡刺激后，Endo G被释放到线粒体外并进入细胞核，引起染色体凝集DNA的断裂。在DFF45缺失小鼠中，残存的DNA片段化作用是由Endo G所介导。一般认为Endo G在凋亡细胞的DNA清除过程中，扮演的是CAD/DFF40CN 102921000 A书明说2/36 页的辅助角色，此外还参与后续的核小体DNA的清除过程。体外实验发现，与CAD/DFF40相比较，Endo G诱导DNA降解时，需要更高的浓度(比CAD/DFF40高100倍)。推测，单凭Endo G的作用是不够的，还需要其他核酸酶或辅助因子的参与；Endo G和AIF这两种线粒体蛋白可能在Caspase被有限激活或Caspase被损伤时以确保细胞核降解。总之，核酸酶在体内可能协同作用以确保凋亡细胞中DNA的有效降解。虽然针对这三种酶的基因敲除能有效抑制凋亡DNA清除的进程，但是并不能完全阻止它的发生。比如CAD/DFF40缺失的哺乳动物细胞中，还是能够观察到染色体DNA的断裂和片段化，说明了还有别的核酸酶参与了这个过程。
本发明人已经发现，采用多种方法诱导多种类型细胞凋亡时，都能观察到乙酰胆碱酯酶(AChE)表达上升这一现象。但是AChE在细胞凋亡过程中究竟发挥了什么功能尚不清楚。因此，有必要深入地研究AChE在细胞凋亡过程中的作用，以期基于此开发调节细胞事件(如细胞凋亡)的新途径。发明内容
本发明的目的在于提供乙酰胆碱酯酶作为核酸酶的应用。
在本发明的第一方面，提供乙酰胆碱酯酶或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性或调节细胞凋亡的组合物(如药物)。
在一个优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶用于作为核酸酶。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、1 型乙酰胆碱酯酶(AChER)或H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶选自(a)如SEQID NO:5氨基酸序列的多肽；(b)如SEQID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；(c)如SEQID N0:5中第2-138位氨基酸序列的多肽(d)如SEQID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽(e)如SEQID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽(f)SEQ ID NO: 5中第2-398位氨基酸序列的多肽；(g)SEQID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽；(h)GenBank登录号NP_033729. I所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的
多肽；
⑴如(a)、(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478 位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；
(j)将(a)-⑴任一(即选自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或⑴任一) 的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；
(k)具有(a)多肽功能的(a) _(j)任一(即选自(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、 (h)、(i)或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID NO:5的序列相同性高于20%;更佳地高于30% ;更佳地高于40% ;更佳地高于50% ;更佳地高于60% ;更佳地高于70% ；7更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% 或99% );或
(I)具有(a)多肽功能的包含(a)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，(i)或(j)项中，不包括仅含有SEQ ID NO:5中第2_72位氨基酸序列的多肽或其截短体。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的激动剂选自引导乙酰胆碱酯酶或其编码基因进入细胞核的试剂(如入核引导物)，镁离子，钙离子或可以形成镁离子和/或钙离子的物质。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶激动剂是促进乙酰胆碱酯酶损伤核酸或促进乙酰胆碱酯酶诱导细胞凋亡的激动剂。
在另一优选例中，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸(如肿瘤细胞基因组DNA，病毒基因组DNA或RNA),或所述的细胞是肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备抑制肿瘤的组合物。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备保护核酸和/或抑制细胞凋亡的组合物。
在另一优选例中，所述的抑制剂选自核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶、蛋白结合分子、EDTA。
在另一优选例中，所述的核酸抑制物选自SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2所示的干扰分子。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂是抑制乙酰胆碱酯酶的调节核酸稳定性或调节细胞凋亡相关活性的抑制剂。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶分子量较佳地小于SOkD ;更佳地小于 70KD ;更佳地小于60KD。
在本发明的另一方面，提供一种分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，其选自
(b)如SEQ ID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽；
(c)如SEQ ID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽；
(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；
(e)如SEQ ID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；
(f)SEQ ID NO:5中第2-398位氨基酸序列的多肽；
(g)SEQ ID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽；
(h) GenBank登录号NP_033729. I所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的多肽；
⑴如(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；
(j)将(b)-(i)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或⑴任一)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID N0:5多CN 102921000 A书明说4/36 页肽功能的多肽；
(k)具有 SEQ ID NO: 5 多肽功能的(b)-(j)任一(即选自(b)、(C)、(d)、(e)、 (f)> (g)、(h)、(i)或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID NO:5的序列相同性高于20% ;更佳地高于30% ;更佳地高于40% ;更佳地高于50% ;更佳地高于60% ;更佳地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98%或99% );或
(I)具有SEQ ID N0:5多肽功能的包含(b)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，(i)、(j)或(k)项中，不包括仅含有如SEQ ID NO:5中第2-72 位氨基酸序列的多肽或其截短体。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体不包括全长的乙酰胆碱酯酶(如SEQ ID NO: 5序列的乙酰胆碱酯酶)。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组
(I)编码所述多肽的多核苷酸；
(2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列选自(但不限于)
⑴如SEQ ID NO:4中第4-414位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5 第2-138位氨基酸序列的多肽)；
(ii)如SEQ ID NO:4中第第4_573位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO: 5第2-191位氨基酸序列的多肽);
(iii)如SEQ ID NO:4中第第4-741位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-247位氨基酸序列的多肽);
(iv)如SEQ ID NO:4中第第4-1194位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO:5第2-398位氨基酸序列的多肽);或
(V)如SEQ ID NO: 4中第94-1734位核苷酸序列的多核苷酸；(对应于SEQ ID NO: 5 第32-578位氨基酸序列的多肽)。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体的制备方法，该方法包含
(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体。
在本发明的另一方面，提供所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体、所述的多核苷酸、所述的载体或所述的宿主细胞的用途，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性或调节细胞凋亡的组合物或用于制备抗肿瘤的药物。
在本发明的另一方面，提供一种保护核酸和/或抑制细胞凋亡的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其具有SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的物质，其包9括
(I)乙酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂；和
(2)引导乙酰胆碱酯酶，或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂进入细胞核的入核引导物。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、1 型乙酰胆碱酯酶(AChER)或H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。
在另一优选例中，所述的物质还包括
(3)细胞或组织靶向性物质；和/或
(4)蛋白质转导结构域多肽。
在另一优选例中，所述的细胞靶向性物质选自(但不限于)识别特定细胞的表面分子的结合分子(如抗体(较佳地为单抗)、配体、化学小分子或多肽)。
在另一优选例中，蛋白质转导结构域多肽选自(但不限于)TAT、Antp、VP22或低分子质量鱼精蛋白(LMWP)。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶共价或非共价连接蛋白质转导结构域多肽。
在另一优选例中，所述的物质中，⑴、(2)、(3)和或⑷通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋的方式相互结合。
在另一优选例中，所述的入核引导物选自(但不限于)核定位信号或核转运蛋白 (karyopherin)或它们的核心片段(保留有核定位或核转运功能)，留体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。
在一个选择方式中，入核引导物为核定位信号序列或具有核定位功能的核定位信号序列的片段，核定位信号序列包括Simian Virus40 (SV40) large T NLS, M9NLS, c-myc NLS,nucleoplasmin NLS，Xenopus N1NLS，FGF3NLS，and PARP NLS，antennapedia peptide， TAT peptide, c-myc peptide，VirD2peptide，nucleoplasmin peptide,aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)peptide, a polyoma large T antigen nuclear localization signal sequence， an adenovirus Ela nuclear localization signal sequence， and an adenovirus Elb nuclear localization signal sequence， the adenoviral NLS,the HIV-I Tat protein NLS,the lymphoid enhancer factor I NLS,an IBD-oligolysine peptide， a dual function CD46targeting peptide/adenoviral NLS, H2B，v-Jun, Dorsal, NIN2，SWI5, RB，PTHrP，HnRNP，Pho4，rpL23a, rpL25, Protamine (鱼精蛋白)NLS，MTAI, CBP80，Rev, STAR NLS, hTAP，Mata2NL。
在一个选择方式中，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒选自(但不限于)JC病毒，JC 病毒VPl蛋白，JC病毒样颗粒(VLP)，鸡贫血病毒，鸡贫血病毒VP3、Apoptin。
在一个选择方式中，阳离子聚合物选自(但不限于)β_羧基酰胺化的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)和聚L-赖氨酸(PLL)。
在一个选择方式中，入核引导物包括(但不限于)Auger_emitting radionuclides such as(99m)Tc， persulfated molecular umbrella， glucose-derived carbon nanospheres, estradiol-pheophorbide。
在另一优选例中，所述的核定位信号序列如SEQ ID N0:3。CN 102921000 A书明说6/36 页
在另一优选例中，所述的物质是融合蛋白，其包括乙酰胆碱酯酶和入核引导物。
在一个选择方式中，所述的融合蛋白由乙酰胆碱酯酶和入核引导物组成。
在一个选择方式中，乙酰胆碱酯酶和入核引导物之间带有或不带有连接序列(如连接肽)。
在另一优选例中，所述的融合蛋白含有乙酰胆碱酯酶(具有核心序列)以及核定位信号(具有核心序列)。
在另一优选例中，所述的核定位信号序列选自SEQ ID N0:6中第1_19位或第 2-19位或第3-10位所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的核定位信号可以是单个重复单位的核定位信号，或可以是多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)串联的重复单位的核定位信号。
在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其编码前面任一所述的物质(融合蛋白)。
在本发明的另一方面，提供一种表达构建物(如质粒载体、病毒载体)，其含有编码所述物质(融合蛋白)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达构建物中，还包括与编码所述的融合蛋白的多核苷酸操作性连接的特异性启动子，所述的特异性启动子选自细胞(如癌细胞)特异性启动子、组织特异性启动子、或细胞核特异性启动子。
在另一优选例中，所述的启动子为肿瘤细胞特异性启动子，选自(但不限于) 癌胚抗原(CEA)启动子，甲胎蛋白(AFP)启动子，survivin(SUR)，人端粒酶逆转录酶(hTERT) 基因启动子，分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(secretory leukoprotease inhibitor, SLPI) 启动子，鳞状细胞癌抗原2 (squamous cell carcinoma antigen2, SCCA2)启动子,前列腺癌特异性启动子 PSAe (AREc)-PSMAe-TARPp [P (A) PTp],前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA),酷氨酸激酶的基因启动子,酪氨酸蛋白酶I (tyrosinase protein I)基因的5’区特异启动子，上皮粘蛋白(MUC)-I基因启动子，肿瘤耐药基因启动子，组织特异性启动子 0SP-1 (ova-specificpromoter-l), PSMA 启动子,乳腺癌特异性基因 1(BCSG1, breast cancer-specific genel)启动子，多药耐药基因启动子。
在本发明的另一方面，提供所述的物质、编码所述物质的多核苷酸或含有所述多核苷酸的表达构建物的用途，用于(进入到细胞核，)损伤核酸和/或促进细胞凋亡；或用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。
在另一优选例中，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸，或所述的细胞是肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述的物质用于制备抗肿瘤的药物。
在本发明的另一方面，提供一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括 所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体，或所述的物质，或所述的编码所述物质的多核苷酸，或含有所述多核苷酸的表达构建物；以及
药学上或生理学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物抑制肿瘤或病毒。
在另一优选例中，所述的损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物是抗肿瘤的药11物。
一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括乙酰胆碱酯酶，所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体，或所述的物质，或所述的多核苷酸，或所述的表达构建物；及
镁离子和/或钙离子。
在另一优选例中，所述的组合物的pH值是5-10。
在另一优选例中，所述的组合物的pH值是7-10。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物，其pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8，更佳地，pH约为7-8。
在本发明的另一方面，提供一种损伤(如剪切)核酸的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括将乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂或表达乙酰胆碱酯酶或其激动剂的载体，或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或所述的载体与核酸相接触。
在本发明的另一方面，提供一种促进细胞凋亡的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括
以乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂，或表达乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)的载体，或所述的物质，或所述的编码所述物质的多核苷酸，或所述的含有多核苷酸的表达构建物处理细胞；或
使细胞表达乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或其激动剂，或所述的物质；或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体；或
引导乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)或所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体进入到细胞核内。
在本发明的另一方面，提供一种保护核酸或抑制细胞凋亡的方法(较佳地为非治疗性的方法)，包括
以乙酰胆碱酯酶(包括其片段或变异体)的抑制剂(特别是针对核酸酶活性位点 (如SEQ ID NO:5中第2-138位)设计的抑制药物)处理细胞；
使细胞表达乙酰胆碱酯酶的抑制剂；或
阻止乙酰胆碱酯酶进入到细胞核内。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括
(I)用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；和
(2)检测所述体系中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性；
其中，若所述候选物质可提闻(优选显者提闻，如提闻20 %以上，较佳的提闻 50%;更佳的提高80%以上)乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若所述候选物质可降低(优选显著降低，如降低20%以上，较佳的降低50% ;更佳的降低80%以上)乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
在另一优选例中，所述的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系是细胞，步骤⑵还包括
观察乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因的入核情况，若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例提高(优选显著提高，如提高20%以上，较佳的提高50% ;更佳的提高80%以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例下降 (优选显著下降，如下降20%以上，较佳的下降50% ;更佳的下降80%以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质；或者，
步骤⑵还包括
观察细胞核内DNA断裂情况，若DNA断裂增加(优选显著增加，如增加20%以上， 较佳的增加50% ;更佳的增加80%以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若DNA断裂减少(优选显著减少，如减少20%以上，较佳的减少50% ;更佳的减少80%以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(I)包括在测试组中，将候选物质加入到表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；和/或
步骤(2)包括检测测试组的体系中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；
如果测试组中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核在统计学上提闻(优选显者提闻，如提闻20%以上，较佳的提闻50%;更佳的提闻80%以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；如果测试组中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达、活性或入核在统计学上降低(优选显著降低转录、表达或活性， 如降低20%以上，较佳的降低50%;更佳的降低80%以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)针对乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物；或表达乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的重组质粒；或乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体与入核引导物的融合蛋白或其编码基因等。
在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(如表达乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于核酸稳定性或细胞凋亡有用的物质。
在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括
(I)在测试组中，用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞；和
(2)检测所述测试组的细胞内DNA断裂情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞；
其中，若与对照组相比，所述测试组细胞中DNA断裂显著增加(优选显著增加，如增加20%以上，较佳的增加50%;更佳的增加80%以上)，则表明该候选物质是抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物。
在另一优选例中，所述的细胞是固定化的细胞；和/或所述的细胞是细胞膜经穿透处理的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞固定化或穿透处理不引起DNA的断裂。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于核酸稳定性或细胞凋亡有用的物质。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体是不包括酯酶活性位点 (如人源乙酰胆碱酯酶的第234位或附近位点、第365位或附近位点和/或第478位或附近位点)的乙酰胆碱酯酶的片段。
在另一优选例中，所述的乙酰胆碱酯酶是乙酰胆碱酯酶的N端片段，例如第 32-138 位、第 2-138 位、第 33-138 位、第 2-191 位等。
在本发明的另一方面，提供一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括
(I’)用候选物质处理体系(如体外的体系，溶液体系)，所述体系中含有乙酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶的片段或变异体以及核酸(如DNA，或含有DNA的质粒)；和
(2’ )检测所述体系中核酸断裂情况，若核酸断裂增加(优选显著增加，如增加 20%以上，较佳的增加50% ;更佳的增加80%以上)，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若核酸断裂减少(优选显著减少，如减少20%以上，较佳的减少 50% ;更佳的减少80%以上)，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
在另一优选例中，步骤(Γ )中，包括在测试组中，用候选物质处理所述体系；步骤(2’)中，包括检测所述测试组的核酸断裂情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体以及核酸的体系；若核酸断裂增加，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若核酸断裂减少，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图I、不同方法诱导凋亡的不同细胞中AChE表达。
A、4种不同来源的细胞系在Etoposide (50 μ g/ml)或A23187 (4 μ Μ)处理18h后， 细胞裂解物通过抗AChE和anti-PARP抗体进行免疫印迹分析，以肌动蛋白(Actin)的表达为参照。
B、HeLa细胞用H2O2处理15h或不处理，对细胞进行免疫荧光染色并观察AChE蛋白与活化的 Caspase-3 (cleaved caspase3),用 Hoechst 染料染核。
C、分别瞬转SiRNAl和siRNA2于HeLa细胞细胞，24小时后以H2O2处理15h，测定裂解物中AChE表达情况。以瞬转无关siRNA (Scramble,为合成公司提供的随机合成物)的细胞作为对照。
D、HeLa 细胞分别转染 siRNAl、siRNA2、Scramble 或共转 siRNAl + AChE 表达质粒(编码人S-AChE蛋白的质粒)24小时后，FACS分析HeLa细胞凋亡情况，计算DNA片段数量。数据为3次重复实验的平均值土标准差。**P〈0.01。
E、D 的代表性 Histogram。
图2、AChE在正常或凋亡细胞中的亚细胞分布。
A、正常生长或以H2O2 (50 μ M)处理15h的HeLa细胞的共聚焦显微镜影像，正常生长或以血清饥饿处理15h的PC-12细胞的共聚焦显微镜影像。为了显示细节，白箭头所示的位置被放大于每个图的右侧。
B、A中所述的各种处理的细胞进行核_质分离，之后进行免疫印迹分析。细胞核 (N)和细胞质(C)片段分别利用抗Histone H3抗体和抗a-tubulin抗体鉴定。
C、转染AChE-GFP编码质粒和Histone H2b_RFP编码质粒共转HeLa细胞内，之后以 100 μ M H2O2诱导细胞凋亡，利用活体细胞实时成像系统跟踪拍摄在细胞凋亡启动后AChE 的位置变化情况。
图3、AChE在核中表达启动HeLa细胞凋亡，AChE裂解超螺旋结构(super coiled, SC)质粒DNA为缺刻(Nick)及线性结构(Linear)的DNA。
A、核定位信号(NLS)将AChE从细胞质引入到细胞核中。编码GFP、AChE-GFP 和NLS-AChE-GFP的质粒瞬转入HeLa细胞后，在激光共聚焦显微镜下观察。GFP和 NLS-AChE-GFP在细胞质和核中都有定位，而AChE-GFP仅分布于细胞质。
B、A中每组细胞的FACS筛选富集。GFP阳性细胞被转于96孔板，在图示时间点进行MTT试验。进行2次独立实验，数据以平均值土标准差表示。
C、转染编码 GFP、Histone H2b_GFP、AChE-GFP 和 NLS-AChE-GFP 的质粒的 HeLa 细胞的TUNEL染色。GFP和Histone-GFP被用作核内定位蛋白对照。
D、pEGFP-Cl质粒DNA与人或小鼠AChE蛋白(0,0. 5，I和2μ g)共同孵育6h后进行1%琼脂糖电泳的结果。用EcoR I指示线性DNA。MK表示分子量标记。
E、随着pEGFP-Cl质粒DNA(150ng)与人或小鼠AChE蛋白(I μ g)孵育时间的增加， 质粒分解情况。以上实验被重复三次。
图4、AChE的核酸酶活性鉴定。
A、纯化的人(Homo)和小鼠(Mus)AChE蛋白的银染分析。
B、纯化的人和小鼠AChE蛋白的免疫印迹。
C、去除小鼠AChE蛋白阻止了体外DNA剪切。偶联AChE抗体或兔IgG的蛋白G 玻璃珠加入到体外DNA剪切系统中，30分钟后离心取上清，加入底物pEGFP-Cl质粒DNA在 37°C孵育6h。兔IgG用作标准特异性对照(iso-specific control)。该结果代表3次独立实验的结果。
D、pEGFP_Cl质粒DNA与小鼠AChE蛋白和DNase I共同孵育后的电泳结果。 G-Actin是DNase I抑制剂，在加入底物pEGFP-Cl质粒DNA之前加入。
E、人工合成人(Homo)AChE 的第 32-72AA 片段(T41)和第 32-138AA 片段(T107)， 将肽段按照不同的剂量与小鼠基因组DNA共同孵育6h，随后进行DNA凝胶电泳。
F、人工合成人(Homo)AChE 的第 32-72AA 片段(T41)和第 32-138AA 片段(T107)， 将该肽段与小鼠基因组DNA共同孵育不同时间，随后进行DNA凝胶电泳。
G、商品化的分离自鳗鱼(Eel)的AChE按照不同剂量与质粒DNA共同孵育，同时以购自不同公司的两种牛血清白蛋白(BSA1，BSA2)作为对照，孵育5h后进行DNA凝胶电泳。
H、商品化的分离自鳗鱼(Eel)的AChE与质粒DNA共同孵育不同时间，同时以购自不同公司的两种牛血清白蛋白(BSA1，BSA2)作为对照，随后进行DNA凝胶电泳。
图5、AChE的DNA酶活性的生物化学条件分析。
A、在 2. 5mM CaCl2、5mM MgCl2、0. 5mM EGTA、0. 5mM EDTA 或它们的组合存在下，质粒 DNA(pEGFP-Cl质粒)与人AChE蛋白孵育6h。
B,pH值对于AChE核酸酶活性的影响。质粒DNA与人AChE蛋白在不同pH条件下孵育3h。
图6、AChE核酸酶活性不受AChE酯酶活性抑制的影响，及AChE蛋白的DNA结合位点的结构分析。
A、通过 Ellman’ s 方法确定 AChE 活性。三种 AChE 抑制剂(10 μ M Huperzine A, I μ M Tacrine和5 μ g/ml Donepenzile)被加入以测定是否存在抑制。以iso_0MPA(BChE 的抑制剂，购自Sigma公司)作为阴性对照。
B、质粒DNA与小鼠AChE蛋白共孵育，同时加入或不加入AChE抑制剂。AChE抑制剂在加入底物质粒DNA之前的30min加入。(-)代表不加AChE，(+)代表加AChE。
图7、NLS-AChES 基因(NLS-AChES)诱导结肠癌 SW620 细胞凋亡(X 100)。
A.流式筛选72h后，倒置荧光显微镜示NLS-AChES转染阳性细胞率及细胞形态学变化。
B. MTT检测流式筛选72h后NLS-AChES促细胞死亡率(n=2，p<0. 001)。
图8、NLS-AChES基因显著诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。
A.荧光倒置相差显微镜示流式细胞仪筛选细胞阳性率及NLS-AChES基因诱导细胞呈现凋亡形态学特征(X200)。
B. Tunnel染色示NLS-AChES基因诱导细胞死亡方式为凋亡。
C. MTT检测流式筛选后24h-72h内，与EGFP基因及AChES基因相比，NLS-AChES基因促使细胞死亡，表明AChES蛋白入核后发挥促凋亡功能(n=2)。
图9、NLS-AChES基因显著诱导肝癌BEL7404细胞凋亡
A.荧光倒置相差显微镜示流式细胞仪筛选细胞阳性率及NLS-AChES基因诱导细胞呈现凋亡形态学特征(X200)。
B. Tunnel染色示NLS-AChES基因诱导细胞死亡方式为凋亡。
C. MTT检测流式筛选后24h-72h内，与EGFP基因及AChES基因相比，NLS-AChES基因促使细胞死亡，表明AChES蛋白入核后发挥促凋亡功能(n=2)。
图10、免疫组化检测示临床肝癌组织样本中AChE蛋白表达下调。
A.左图，组织芯片AChE蛋白免疫组化结果(X40)；
右图，左图的分析统计结果
B.癌旁与相应癌组织样本的放大图(X600)。
图11、NLS-AChES基因抑制BEL-7404肝癌细胞在裸鼠皮下成瘤。
A.荧光体视显微镜检测流式筛选后24hr、72hr时，转染pEGFP或pEGFP_NLS_AChES 质粒的BEL-7404细胞在裸鼠皮下的存在情况。
B.流式筛选后的细胞种植于裸鼠皮下，28天内肿瘤体积的变化曲线。
C.第28天时，裸鼠照片示长瘤情况。
第一排，种植pEGFP细胞，明显成瘤(右起第3、第4只，瘤太大以至于磨破)；
第二排，种植pEGFP-NLS-AChES细胞，均未成瘤。
D. 28天从pEGFP组体内取出的瘤体。
E.石蜡切片HE染色显示瘤体组织细胞特征(左图X 100 ;右图X600)。
图12、鉴定AChE蛋白分子中发挥促凋亡功能的片段。
A. AChE蛋白分子的缺失突变示意图。
B.将A所示各突变质粒分别转染HeLa细胞，经流式细胞仪分选出转染阳性细胞， 将之种植于96孔板，72小时时荧光倒置相差显微镜示细胞形态学变化情况(X200)。可见，2-138AA片段及较之更长的片段均使细胞呈现死亡特征；而2-72AA片段则对细胞生存无明显影响。
C.对B中的细胞进行MTT检测，并绘制细胞生长曲线。2-138AA片段具备AChE全长的促凋亡功能，而2-72AA片段完全丧失这一功能。
图13、AChE乙酰胆碱酯酶活性位点与AChE蛋白的促细胞凋亡功能无关。
A. pEGFP-NLS-AChE (S234A，E365A，H478A)酯酶活性位点突变质粒转入宫颈癌HeLa细胞之后，荧光显微镜观察细胞形态学变化发现，与空质粒对照(pEGFP)相比， pEGFP-NLS-AChE(S234A, E365A, H478A)质粒显著促使细胞死亡。
B. MTT 检测结果表明，pEGFP-NLS-AChE(S234A, E365A，H478A)质粒诱导细胞死亡程度与野生型质粒pEGFP-NLS-AChE相似。此数据表明，AChE乙酰胆碱酯酶活性位点与AChE 蛋白的促细胞凋亡功能无关。
图14、给予HeLa细胞中，AChE蛋白组与BSA对照组相比的细胞内DNA断裂情况， 可见AChE蛋白组的细胞内DNA发生显著的断裂。
具体实施方式
本发明人经过对乙酰胆碱酯酶(AChE)的深入研究，揭示了 AChE在调节核酸稳定性、调节细胞凋亡方面的新用途。基于以上新发现，可开发一系列具有应用价值的制剂，如促进或抑制细胞凋亡的试剂、抑制肿瘤的试剂、保护核酸不受损伤的试剂等。并且，也可以 AChE作为靶标，筛选一系列可通过调节AChE的表达或活性而发挥调节核酸稳定性或细胞凋亡的试剂。本发明还首次揭示了 AChE与入核引导物组合后可成为肿瘤的新型“杀手”。
术语
如本文所用，所述的“核酸酶”是指对于核酸有损伤作用的酶，所述的损伤例如剪切、降解。所述的核酸酶作用于核酸链的中间或首尾，使核酸断裂、刻缺或形成线性。所述的“核酸酶”较佳地为脱氧核糖核酸酶。
如本文所用，所述的“核酸”包括脱氧核糖核酸、核糖核酸，其是以A、T (或U)、C或 G为基本的组成单位。所述的核酸包括了未经修饰的或部分位点经过修饰的形式。
如本文所用，所述的“入核引导物”是指一种靶向性物质，其对于细胞核具有靶向作用，可通过与被引导物(如AChE)共价连接(如融合)、偶联、附着、包裹或包埋等方式相互结合，之后将被引导物(如AChE)引入到细胞核内的物质的总称。
如本文所用，所述的“肿瘤”为各种良性或恶性肿瘤，鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、目艮部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。
如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、 “基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由…… 构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
当用于描述序列时，所述的“含有”、“具有”或“包括”X多肽的氨基酸序列(或Y 核苷酸序列)限定了有限的情况，除了核心的“X多肽的氨基酸序列(或Y核苷酸序列)” 以外，其两端或其中一端仅可以增加有限多的氨基酸(或核苷酸)，如增加1-600个，较佳地增加1-500个，更佳地增加1-400个，更佳地增加1-300个，更佳地增加1-200个，更佳地增加1-100个，更佳地增加1-50个，更佳地增加1-30个，更佳地增加1-20个，更佳地增加 1-10个，更佳地增加1-5个氨基酸。或如增加1-1800个，较佳地增加1-1500个，更佳地增加1-1200个，更佳地增加1-900个，更佳地增加1-600个，更佳地增加I-300个，更佳地增加 1-150个，更佳地增加1-90个，更佳地增加1-60个，更佳地增加1-30个，更佳地增加1-15 个核苷酸，更佳 地增加1-5个核苷酸。
如本文所用，所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA 序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
如本文所用，所述的“蛋白质转导结构域多肽”是指一种具有蛋白递送功能的蛋白，其能够与目的蛋白连接或偶联，并将目的蛋白递送到细胞内。
如本文所用，所述的“蛋白质转导(protein transduction) ”是指目的蛋白(如乙酰胆碱酯酶)用重组技术或化学偶联等蛋白质转导(protein transduction)是指革巴蛋白用重组技术或化学偶联等方法连接到蛋白质转导结构域上(protein transduction domains, PTDs),然后通过例如PTD的作用可以直接将祀蛋白递送到细胞内的方法。已经发现的蛋白质转导结构域包括TAT、Antp和VP22等(Beerens A M J, Al Hadithy A F Y, Rots M G，et al. Protein transduction domain and their utility in gene therapy. Curr Gene Ther，2003，3 (5):486 494)。
如本文所用，所述的“核定位信号”是指一种具有细胞核定位功能的多肽，其能够与目的蛋白连接或偶联，并将目的蛋白递送到细胞核。所述的“核定位信号”可以采用本领域已知的可引导蛋白进入到核内的任何分子，只要其具有细胞核定位的作用。其中一类的核定位信号包含核心序列，所述的核心序列由含3-4个赖氨酸或者精氨酸的多肽(如六肽) 构成，基本结构为Lys-Arg/Lys-X-Arg/Lys,不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸；核心NLS 的旁侧可以为脯氨酸或甘氨酸。所述的“核定位信号”可以是仅含有核心序列的蛋白、也可以还包含其它序列的更长序列的蛋白。
乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶(AChE)为一种现有技术中为本领域技术人员熟知的酶，其以往被人们熟知的功能是作为胆碱能神经突触和神经-肌肉接头处水解神经递质乙酰胆碱的重要分子，此外还参与一些“非经典功能”，如可能在神经突生成，细胞增殖，细胞黏附，突触发生，淀粉样纤维聚集，造血以及血小板生成过程中起作用。而本发明第一次揭示了其在调节核酸稳定性方面具有作用，也即可以作为一种核酸酶。
本发明人在广泛研究中意外发现，AChE除了水解ACh的活性外，还具有核酸酶活性，其参与了细胞凋亡过程中染色体DNA的降解的过程。细胞启动凋亡信号后，AChE的表达量上升并从细胞质向细胞核内转移。体外实验发现，分离纯化的人源和鼠源AChE蛋白都具有将超螺旋结构的质粒DNA剪切成缺刻和线性结构DNA的能力。更重要的是，在肿瘤细胞的细胞核内表达AChE引起细胞死亡。
在本发明中，所述的AChE蛋白(多肽)可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物。此外，所述的AChE蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组AChE蛋白。较佳地，可采用重组的AChE蛋白。
根据本发明的内容，不论是包括人类和小鼠在内的哺乳动物来源的AChE，还是鱼类(鳗鱼)来源的AChE，都能够引起基因组DNA和质粒DNA的降解，即都具有核酸酶的活性。因此应理解，任何来源的适合的AChE都可用于本发明，并都落在本发明的权利要求范围内，而不仅仅限于个别物种来源的AChE。
任何适合的AChE蛋白均可用于本发明。所述的AChE蛋白包括全长的AChE蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。例如，所述的AChE蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 5 (或GenBank登录号P22303. I，或GenBank登录号NP_033729. I，或其他已知的不同动植物来源的AChE蛋白)所示的序列基本上相同。
作为本发明的优选方式，所述的AChE蛋白的生物活性片段选自(b)如SEQ ID NO: 5中第32-138位氨基酸序列的多肽；(c)如SEQ ID NO: 5中第2-138位氨基酸序列的多肽；(d)如SEQ ID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽；(e)如SEQ ID N0:5中第2-247位氨基酸序列的多肽；(f)SEQ ID NO: 5中第2-398位氨基酸序列的多肽；(g) SEQ ID NO: 5中第32-578位氨基酸序列的多肽；(h) GenBank登录号NP_033729. I所示的氨基酸序列中第 32-579位氨基酸序列的多肽；⑴如(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、 365位和/或478位发生变异(如S234A、E365A、H478A)的多肽；(j)将(b)-(i)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或⑴任一)的多肽的氨基酸序列经过一个或多个 (如1-20个，较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1_3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO: 5多肽功能的多肽；(k)具有SEQ ID NO: 5 多肽功能的(b)-(j)任一(即选自(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、⑴或(j)任一)多肽的片段(较佳地，其与SEQ ID N0:5的序列相同性高于20%;更佳地高于30%;更佳地高于40% ;更佳地高于50% ;更佳地高于60% ;更佳地高于70% ;更佳地高于80% ;更佳地高于85% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98 %或99% ) ； (I)具有SEQ ID N0:5多肽功能的包含(b)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。上述AChE蛋白的生物活性片段保留了全长AChE蛋白的生物活性，并且乙酰胆碱酯酶活性位点突变体也完全保留了其野生型蛋白的促凋亡生物学功能。
AChE蛋白的氨基酸序列的N端第1_31位为信号肽序列，这是现有技术已知的，如参见 J Neural Transm(2009)116:1435-1442 ；Pro-apoptotic protein-proteininteractions of the extended N-AChE terminus 或 THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY ；Vol. 279，No. 28，Issue of July9, pp. 29740-29751，2004 中所报导的。信号肽发挥了蛋白引导的作用，而通常并不是发挥蛋白活性的必要结构。因此，结合本发明的结果可以确定，AChE蛋白的第32-138位是可以发挥核酸酶的作用的。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的AChE蛋白或其生物活性片段的氨基酸序列也包括在本发明中。AChE蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.Co. P224。
任何一种AChE蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，AChE蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的AChE蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长AChE蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长AChE蛋白的60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %、或 100 %的活性。
本发明也可采用经修饰或改良的AChE蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的AChE蛋白。所述经过修饰或改良的AChE 蛋白可以是一种AChE蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的AChE蛋白可以是与天然存在的AChE蛋白具有较小的共同点，但也能发挥核酸酶的作用，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响AChE蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
AChE蛋白已经公知在许多动植物中以高度的保守性存在，例如在人和小鼠中， AChE蛋白的序列相同性(同源性)达到88%。因此，可以理解，来源于不同动植物的AChE 均包含于本发明中。较佳地，它们是与SEQ ID NO:5或其生物活性片段所示氨基酸序列相比，序列相同性高于60 %的，更佳地是高于70 %，更佳地是高于80 %，更佳地是高于85 %， 更佳地是高于88 %，更佳地是高于90 %，更佳地是高于95 %，更佳地是高于98 %。
在哺乳动物中，AChE蛋白为一个基因所编码，但由于其C端剪接形式不同而存在三种亚型，分别为S型乙酰胆碱酯酶(AChES)、R型乙酰胆碱酯酶(AChER)和H型乙酰胆碱酯酶(AChEH)。此三种亚型均保持了 AChE本身所固有的经典功能，即在神经元突触以及周围神经系统的神经肌肉接头处水解乙酰胆碱，终止神经冲动传递等。AChER和AChHl也具有与AChES相同的第1-547位序列(含有核酸酶功能位点)，因此，它们均被包含在本发明中。
一旦分离获得了所述蛋白的序列，就可以用重组法来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，对于较短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列，人工合成的方法可简便且快速地得到所需要的蛋白。
本发明还包括了编码所述的AChE蛋白的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。编码AChE蛋白的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的AChE蛋白的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到所要的蛋白。
基于本发明人的新发现，本发明提供了 AChE蛋白或其生物活性片段的用途，包括但不限于用于作为核酸酶(可进行体外非治疗性地应用)，用于制备调节核酸(如DNA)稳定性的组合物，用于制备调节细胞凋亡的组合物，用于抑制肿瘤，用于筛选抑制调节核酸稳定性的物质，或用于筛选调节细胞凋亡的物质，等等。
AChE蛋白或其激动剂对于损伤核酸和/或促进细胞凋亡有显著的作用，这是非常具有应用价值的。肿瘤是一种恶性细胞过度增殖导致的疾病，可以利用AChE蛋白或其激动剂(特别是可引导AChE入核的物质)来损害肿瘤细胞的核酸，从而达到有效杀灭肿瘤细胞的效果。本发明的实施例已经证明，AChE与核定位信号的融合蛋白具有极其优异的杀灭肿瘤效果。
所述的AChE蛋白本身可以直接用于促进细胞凋亡，AChE蛋白通常为分子量小于约70kD的蛋白；而其片段则分子量更小。本领域已知，蛋白入核是通过扩散或转运，是否能够入核与蛋白分子的大小相关，分子量较小或直径小于IOnm的蛋白可以通过扩散穿过核孔复合体(NPC)进入到核内(参见 Virol Sin. 20IOApr ；25(2) : 79-85. Epub2010Apr9 ；The nucleocytoplasmic transport ofviral proteins),从而发挥 DNA 降解作用。此外，也可以将AChE蛋白与入核物质相互结合，以更高效地进入到细胞核内。
调节剂
如本文所用，所述的AChE的激动剂包括了稳定剂、促进剂、上调剂等。任何可提高 AChE蛋白的活性、维持AChE蛋白的稳定性、促进AChE蛋白的表达、延长AChE蛋白有效作用时间、促进AChE的基因转录和翻译以及的物质均可用于本发明，作为可用于损伤核酸和 /或促进细胞凋亡的有效物质。AChE的激动剂还包括一些可以引导AChE进入到细胞核内的入核引导物，或者为AChE提供较好的作用环境的离子，如镁离子。
如本文所用，所述的AChE的拮抗剂包括了抑制剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可降低AChE蛋白的活性、降低AChE蛋白的稳定性、抑制AChE蛋白的表达、减少AChE蛋白有效作用时间或抑制AChE的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于保护核酸和/ 或抑制细胞凋亡的有效物质。一些对于保护核酸和/或抑制细胞凋亡有效的物质，可用于预防、缓解或治疗阿尔茨海默症(AD)、帕金森(PD)等退行性疾病。
基于本发明的新发现以及结合现有常识，本领域技术人员可以制备或设计出AChE 的激动剂或抑制剂，这些激动剂或抑制剂也包括在本发明中。
作为本发明的优选方式，所述的AChE的激动剂包括(但不限于)表达乙酰胆碱酯酶的质粒，引导乙酰胆碱酯酶或其编码基因进入细胞核的试剂(如入核引导物)，镁离子，钙离子或可以形成镁离子和/或钙离子的物质。
所述的AChE的激动剂通过影响AChE而实现对核酸对损伤作用或促进细胞凋亡。 从而可用于制备损伤核酸或促进细胞凋亡的药物，特别是抗肿瘤药物。
所述的AChE的拮抗剂可以是核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，蛋白水解酶、 蛋白结合分子、EDTA，其能够下调乙酰胆碱酯酶蛋白或其编码基因的表达。作为本发明的优选方式，所述的AChE的拮抗剂是基于AChE的基因序列设计的核酸抑制物，如小干扰分子。较佳地，所述的小干扰分子具有SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2所示的序列。根据特定的靶序列来设计干扰分子是本领域技术人员已知的，目前用于构建干扰分子的质粒完全可以通过商购途径获得。所述的干扰RNA分子可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。根据已知的蛋白，筛选可以抑制其活性的抗体(单抗或多抗)也是本领域常规的技术。
所述的AChE的抑制剂通过影响AChE而实现对核酸的保护作用或抑制细胞凋亡。 尤其是当细胞凋亡发生时，AChE会进入到核内，这时候利用AChE的抑制剂处理可以阻止 AChE的入核，或抑制AChE的表达或活性，从而起到抑制细胞凋亡的作用。对于一些由于 AChE入核导致细胞凋亡的有益细胞，可采用AChE的抑制剂加以保护，减缓其凋亡的进程或抑制其凋亡。
入核物质
核酸通常存在于细胞核内，因此，一些可以引导AChE或其激动剂或拮抗剂进入到核内的物质是对于调节核酸稳定性或调节细胞凋亡有用的物质。因此，本发明还提供了一种包括(I) AChE或其激动剂或拮抗剂；和(2)引导AChE或其激动剂或拮抗剂进入细胞核的入核引导物的物质。(I)和(2)通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附或附着、包埋或包裹的等方式相互结合。
入核引导物可以采用本领域已知的可引导蛋白或其编码基因进入到核内的任何分子，只要其具有靶向细胞核的作用。例如所述的入核引导物可以是(但不限于)核定位信号(NLS),核转运蛋白(karyopherin)或它们的核心片段(保留有核定位或核转运功能)，留体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。
入核弓丨导物包括SimianVirus40 (SV40) large T NLS, M9NLS, c-myc NLS, nucleoplasmin NLS, Xenopus NI NLS, FGF3NLS, and PARP NLS, antennapedia peptide, TAT peptide, c-myc peptide, VirD2peptide,nucleoplasmin peptide,aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(ARNT)peptide, a polyoma large T antigen nuclear localization signal sequence, an adenovirus Ela nuclear localization signal sequence, and an adenovirus Elb nuclear localization signal sequence, the adenoviral NLS,the HIV-I Tat protein NLS,the lymphoid enhancer factor I NLS,an IBD-oligolysine peptide, a dual function CD46targeting peptide/adenoviral NLS, H2B, v-Jun, Dorsal, NIN2, Sff 15, RB, PTHrP, HnRNP，Pho4, rpL23a, rpL25, Protamine (鱼精蛋白)NLS，MTA1，CBP80, Rev, STAR NLS，hTAP, Mata2 NL。
在一个选择方式中，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒选自(但不限于)JC病毒，JC 病毒VPl蛋白，JC病毒样颗粒(VLP)，鸡贫血病毒，鸡贫血病毒VP3、Apoptin。
所述的入核引导物可以是肿瘤细胞特异性的，例如病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒。 更具体地如JC病毒(JCV)，能形成病毒样颗粒(VLP)，可在内部包裹荧光染料Cy3或药物， 直接转运进入细胞核；或如JC病毒(JCV)的VPl蛋白，能将目的蛋白转运进入细胞核，可将之与AChE制备融合蛋白(参见中华微生物学和免疫学杂志，2005年02期，JC病毒样颗粒可直接转运进入细胞核)。另外的入核引导物如来自于鸡Anemia病毒的病毒蛋白3 (viral protein3 (VP3 or Apoptin) from Chicken Anemia Virus),该蛋白的 C 末端具有肿瘤细胞特异性的核定位信号(tNTS)，可以有效地定位到肿瘤或转移肿瘤细胞的细胞核(参见DrugResist Updat.2006Feb-Apr;9(1-2):40-50. Epub2006Aprl8 ；Tumor-specific nuclear targeting !promises for anti-cancer therapy )。另外的入核引导物是阳离子聚合物， 如羧基酰胺化的阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)和聚L-赖氨酸(PLL)，其是从负电向正电翻转的新型细胞核靶向的药物载体，用于将药物直接输送到癌细胞的细胞核中，其可包埋抗肿瘤药物如AChE并有效地将药物输送到细胞核中(参见高分子通报，Polymer Bulletin,编辑部邮箱2010年12期电荷翻转型药物载体用于肿瘤细胞核靶向药物输送的研究)。
所述的入核引导物也可以是一些肿瘤细胞非特异性的物质，例如Auger-发射放射性核素(radionuclides),如("nOTc,参见 J Biol Inorg Chem. 2011Jun25. [Epub ahead of print] ；Nuclear targeting with cell-specific multifunctional tricarbonyl M(I)(M is Re, (99m)Tc)complexes:synthesis, characterization, and cell studies。或例如过硫酸分子伞(persulfated molecular umbrella),参见 Bioconjug Chem. 2008Aug;19(8):1510-3. Epub2008Aug6. Cellular entry and nuclear targeting by a highly anionic molecular umbrella。或例如葡萄糖来源的碳纳米球(glucose-derived carbon nanospheres),参见 Nano Lett.20080ct;8(10):3182-8. Epub2008Sepl9. Intrinsically fluorescent carbon nanospheres as a nuclear targeting vector delivery of membrane-impermeable molecule to modulate gene expression in vivo。 或例如雌二醇-脱续叶绿酸(estradiol-pheophorbide)，参见 Photochem Photobiol Sci. 2006Nov;5(II):996-9. Epub20060ct9.Synthesis of estradiol-pheophorbide a conjugates:evidence of nuclear targeting, DNA damage and improved photodynamic activity in human breast cancer and vascular endothelial cells。
作为本发明的优选方式，所述的AChE或其激动剂或拮抗剂(或其与入核引导物的复合体)还可与细胞或组织靶向性物质通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、 包裹或包埋等方式相互结合。所述的细胞或组织靶向性物质包括识别特定细胞的表面分子的结合分子(如抗体(较佳地为单抗)、配体、化学小分子或多肽)，留体激素。例如，当所述的细胞为乳腺癌细胞时，所述的结合分子是抗Her2的抗体；当所述的细胞为前列腺癌时，所述的结合分子是LHRH多肽。
作为本发明的优选方式，所述的AChE或其激动剂或拮抗剂(或其与入核引导物的复合体)还可与蛋白质转导结构域多肽通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋等方式相互结合。已经发现的蛋白质转导结构域包括TAT、Antp和VP22等 (Beerens A M J, Al Hadithy A F Y, Rots M G, et al.Protein transduction domain and their utility in gene therapy. Curr Gene Ther, 2003，3 (5) : 486 494)。从鱼精蛋白自然衍生出的无毒肽称为低分子质量鱼精蛋白(low mo Iecu Iar w e igh t pro tam ine, LMWP)。它具有较高的Arg含量，并具有类似TAT(目前已知非常重要的蛋白转导域多肽) 的重要序列。因此，LMWP具备穿透生物膜的能力，使原本不能透过生物膜的蛋白大分子等进入细胞并保持蛋白的功能。例如，一种蛋白质转导结构域多肽参见中国生物工程杂志；2004 年5月第24卷第5期“多肽TAT与核定位信号介导的蛋白质入核递送”中所报导的。又例如， 一种蛋白质转导结构域多肽参见 Proc Natl Acad Sci U S A. 2002Apr2; 99 (7) :4489-94. Epub2002Marl9. Ability of the hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promotecellular uptake of recombinant Cre recombinase:a tool for efficient genetic engineering of mammalian genomes所报导的，通过将目的蛋白(如AChE)连接到蛋白质转导结构域上(protein transduction domains, PTDs),然后通过PTD的作用可以直接将革巴蛋白递送到细胞内的方法。
作为本发明的优选方式，所述的对于调节核酸稳定性或调节细胞凋亡有用的物质是一种AChE与入核信号分子的融合蛋白；较佳地是AChE与核定位信号(NLS)的融合蛋白。
本发明所述的核定位信号(NLS)可以是包含核心序列(Lys-Arg/Lys-X-Arg/ Lys)，不含酸性氨基酸和大分子的氨基酸的核定位信号，参见HaimN，Craik C，Hiraoka Y. Homeodomain of yeast rep ressor al2pha2contains a nuclear localization signal. Proc Natl Acad Sci USA, 1990,87:695426958。
融合蛋白的制备是本领域技术人员已知的，所述的AChE与入核信号分子之间可以包括或不包括多肽连接子(连接肽)。较佳地，所述的融合蛋白是SEQ ID N0:5或其中第1-547位氨基酸序列与SEQ ID NO:3的核苷酸序列所编码的氨基酸序列相融合而成，两者之间可包括一些连接肽序列。较佳地，所述的融合蛋白具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列。
编码所述的融合蛋白的核酸也包含在本发明内，该核酸可以是天然的AChE或NLS 的核酸序列连接而成；也可以是它们的变异体或简并体。包含编码所述融合蛋白的核酸分子的载体也包含在本发明内。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于所述融合蛋白的表达。包含编码所述融合蛋白的核酸的宿主细胞也包含在本发明内。
本发明的AChE与入核引导物的结合体或编码AChE与入核引导物的结合体的构建物在引入到细胞内后，可发挥出乎意料的促进细胞(包括肿瘤细胞)凋亡的效果，这对于消除有害细胞(如肿瘤细胞)是非常有用的。因此，AChE与入核引导物的结合体是一种极其优异的抗肿瘤分子。
本发明在实施例中首次证实，编码AChE与入核信号分子的融合蛋白的NLS-AChES 基因导入多种肿瘤细胞之后，显著诱导细胞凋亡，凋亡率约100% ;此外，NLS-AChES基因完全抑制人肿瘤细胞在裸鼠皮下的成瘤能力。上述实验数据证明，NLS-AChES基因是一种新型抑癌基因。无论在诱导细胞凋亡方面，还是在它所作用的细胞类型普遍性方面，NLS-AChES 融合基因都具P53基因无可比拟的优越性。NLS-AChES融合基因是一种更为有效的“肿瘤杀手”基因，是抗肿瘤基因治疗药物的新型先导性基因，可望为癌症患者的康复带来新曙光。
基于上述实验的反复验证，本发明人断定=NLS-AChES融合基因在肿瘤细胞中过表达后能高效促进细胞凋亡；通过含肿瘤组织特异性启动子的载体靶向性启动该基因表达，可特异性导致体内恶性肿瘤细胞高效性死亡。一些肿瘤组织特异性启动子例如如表I 所示。
表I
权利要求
1.乙酰胆碱酯酶或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的组合物。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶的激动剂选自引导乙酰胆碱酯酶或其编码基因进入细胞核的试剂，镁离子，钙离子或可以形成镁离子和/或钙离子的物质。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸，或所述的细胞是肿瘤细胞。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶或其激动剂用于制备抑制肿瘤的组合物。
6.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂用于制备保护核酸和/或抑制细胞凋亡的组合物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂选自核酸抑制物，蛋白抑制齐U，抗体，配体，蛋白水解酶、蛋白结合分子、EDTA。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的核酸抑制物选自SEQID NO: I或SEQID NO:2所示的干扰分子。
9.一种分离的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，其选自 (b)如SEQID NO:5中第32-138位氨基酸序列的多肽； (c)如SEQID NO:5中第2-138位氨基酸序列的多肽； (d)如SEQID NO:5中第2-191位氨基酸序列的多肽； (e)如SEQID NO:5中第2-247位氨基酸序列的多肽； (f)SEQ ID NO: 5中第2-398位氨基酸序列的多肽； (g)SEQID NO:5中第32-578位氨基酸序列的多肽； (h)GenBank登录号NP_033729.I所示的氨基酸序列中第32-579位氨基酸序列的多肽； (i)如(e)-(g)任一所述多肽的氨基酸序列，其中第234位、365位和/或478位发生变异的多肽； (j)将(b)-(i)任一的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:5多肽功能的多肽； (k)具有SEQ ID N0:5多肽功能的(b)-(j)任一多肽的片段；或 (I)具有SEQ ID N0:5多肽功能的包含(b)-(k)任一多肽的氨基酸序列的多肽。
10.一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (1)编码如权利要求9所述多肽的多核苷酸； (2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列选自 ⑴如SEQ ID N0:4中第4-414位核苷酸序列的多核苷酸; ( )如SEQ ID NO:4中第第4-573位核苷酸序列的多核苷酸； (iii)如SEQ ID NO:4中第第4-741位核苷酸序列的多核苷酸；(iv)如SEQ ID NO:4中第第4-1194位核苷酸序列的多核苷酸；或 (V)如SEQ ID N0:4中第94-1734位核苷酸序列的多核苷酸。
12.—种载体，其特征在于，它含有权利要求10或11所述的多核苷酸。
13.—种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求12所述的载体；或其基因组中整合有权利要求11或12所述的多核苷酸。
14.一种权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体的制备方法，其特征在于，该方法包含 (a)在适合表达的条件下，培养权利要求13所述的宿主细胞； (b)从培养物中分离出权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体。
15.权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体、权利要求10或11所述的多核苷酸、权利要求12所述的载体或权利要求13所述的宿主细胞的用途，用于制备调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的组合物或用于制备抗肿瘤的药物。
16.一种保护核酸和/或抑制细胞凋亡的乙酰胆碱酯酶抑制剂，其具有SEQ ID NO: I或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
17.一种调节核酸稳定性或调节细胞凋亡的物质，其包括 (1)乙酰胆碱酯酶或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂；和 (2)引导乙酰胆碱酯酶，或乙酰胆碱酯酶的激动剂或拮抗剂进入细胞核的入核引导物。
18.如权利要求17所述的物质，其特征在于，还包括 (3)细胞或组织靶向性物质；和/或 (4)蛋白质转导结构域多肽。
19.如权利要求17或18所述的物质，其特征在于，(I)、(2)、(3)和或(4)通过共价连接、偶联、分子力作用、电荷吸附、附着、包裹或包埋的方式相互结合。
20.如权利要求17或18所述的物质，其特征在于，所述的入核引导物选自核定位信号或核转运蛋白或它们的核心片段，留体激素，病毒、病毒蛋白或病毒样颗粒，阳离子聚合物，放射性核素，纳米球。
21.如权利要求17或18所述的物质，其特征在于，所述的物质是融合蛋白，其包括乙酰胆碱酯酶和入核引导物。
22.如权利要求21所述的物质，其特征在于，所述的融合蛋白含有 乙酰胆碱酯酶以及核定位信号。
23.—种多核苷酸,其编码权利要求21-22任一所述的物质。
24.—种表达构建物,其含有权利要求23所述的多核苷酸。
25.如权利要求24所述的表达构建物，其特征在于，其中还包括与编码所述的融合蛋白的多核苷酸操作性连接的特异性启动子，所述的特异性启动子选自细胞特异性启动子、组织特异性启动子、或细胞核特异性启动子。
26.权利要求17-22任一所述的物质、权利要求23所述的多核苷酸或权利要求24或25所述的表达构建物的用途，用于损伤核酸和/或促进细胞凋亡；或用于制备损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物。
27.如权利要求26所述的用途，其特征在于，所述的核酸是肿瘤或病毒相关核酸，或所述的细胞是肿瘤细胞。
28.如权利要求27所述的用途，其特征在于，所述的物质用于制备抗肿瘤的药物。
29.一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括 权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求12所述的载体，或权利要求17-22任一所述的物质，或权利要求23所述的多核苷酸，或权利要求24或25所述的表达构建物；以及 药学上或生理学上可接受的载体。
30.一种损伤核酸和/或促进细胞凋亡的组合物，其包括 乙酰胆碱酯酶，权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求12所述的载体，或权利要求17-22任一所述的物质，或权利要求23所述的多核苷酸，或权利要求24或25所述的表达构建物；及 镁离子和/或钙离子。
31.如权利要求29或30所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的pH值是5-10。
32.—种损伤核酸的方法，包括将乙酰胆碱酯酶或其激动剂或表达乙酰胆碱酯酶或其激动剂的载体，或权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求12所述的载体与核酸相接触。
33.一种促进细胞凋亡的方法，包括 以乙酰胆碱酯酶或其激动剂，或表达乙酰胆碱酯酶的载体，或权利要求17-22任一所述的物质，或权利要求23所述的多核苷酸，或权利要求24或25所述的表达构建物，或权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或权利要求12所述的载体处理细胞；或 使细胞表达乙酰胆碱酯酶或其激动剂，或权利要求16-21任一所述的物质；或权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体，或 引导乙酰胆碱酯酶或权利要求9所述的乙酰胆碱酯酶的片段或变异体进入到细胞核内。
34.一种保护核酸或抑制细胞凋亡的方法，包括 以乙酰胆碱酯酶的抑制剂处理细胞； 使细胞表达乙酰胆碱酯酶的抑制剂；或 阻止乙酰胆碱酯酶进入到细胞核内。
35.一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括 (1)用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系；和 (2)检测所述体系中乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性； 其中，若所述候选物质可提高乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若所述候选物质可降低乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的转录、表达或活性，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的体系是细胞，步骤(2)还包括 观察乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因的入核情况，若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例提高，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体或其编码基因在细胞核内的比例下降，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质；或者， 步骤⑵还包括 观察细胞核内DNA断裂情况，若DNA断裂增加，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若DNA断裂减少，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
37.一种筛选抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括 (1)在测试组中，用候选物质处理表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞；和 (2)检测所述测试组的细胞内DNA断裂情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达或含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体的细胞； 其中，若与对照组相比，所述测试组细胞中DNA断裂显著增加，则表明该候选物质是抑制细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述的细胞是固定化的细胞；和/或所述的细胞是细胞膜经穿透处理的细胞。
39.如权利要求35-38任一所述的方法，其特征在于，所述的乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体是不包括酯酶活性位点的乙酰胆碱酯酶的片段。
40.一种筛选调节细胞凋亡或核酸稳定性的潜在药物的方法，包括 (Γ )用候选物质处理体系，所述体系中含有乙酰胆碱酯酶或其片段或变异体以及核酸；和 (2’ )检测所述体系中核酸断裂情况，若核酸断裂增加，则表明该候选物质是损伤核酸或促进细胞凋亡的潜在物质；若核酸断裂减少，则表明该候选物质是保护核酸或抑制细胞凋亡的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及乙酰胆碱酯酶(AChE)作为核酸酶的应用。首次公开了AChE在调节核酸稳定性、调节细胞凋亡方面的新用途，可基于此开发一系列具有应用价值的制剂，如促进或抑制细胞凋亡的试剂、抑制肿瘤的试剂、保护核酸不受损伤的试剂等；并且还首次公开了AChE与入核引导物组合后可成为肿瘤的新型“杀手”。
文档编号A61K45/00GK102921000SQ201210279908
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月8日 优先权日2011年8月8日
发明者张学军, 谢敬, 杜爱英, 郭凯杰, 吴军 申请人:中国科学院上海生命科学研究院