植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用的制作方法

植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用。具体地，本发明公开了一种分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物及其用途，所述的植物功能性microRNA是来源于某一植物的内源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能。
【专利说明】植物微小核糖核酸的提取、制备及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域。具体地，本发明涉及提取植物HIiCT0RNA的方法及其应用。【背景技术】
[0002]微小核糖核酸(microRNA、miRNA或miR)是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们广泛存在于动植物细胞中，在进化上高度保守。MicroRNA通过识别靶信使RNA(mRNA)的3’端非翻译序列，与之不完全互补，从而抑制相应蛋白质的翻译。作为mRNA强有力的调节因子，microRNA与生理活动密切相关，涉及生物个体发育、组织分化、细胞调亡及能量代谢等生命活动；同时，microRNA也与许多疾病的发生和发展存在紧密联系。
[0003]目前，对植物microRNA研究都集中在microRNA对植物本身的调控作用，包括对植物生长发育、信号转导和逆境胁迫活动的作用。对研究成果的应用则集中于对植物物种的改良，如调节农作物在其食用部分对营养元素的表达。
[0004]专利PCT/CN2010/000677公开了源自水稻的MIR164对植株根系的调控作用，提出构建包括MIR164序列的核酸片段，并将其转入水稻植株，从而获得根系比普通水稻强大的转基因水稻。专利PCT/IB2010/055600公开了上调包括MIR156的若干microRNAs可提高植物对环境胁迫因素的耐受能力，进而提高植物的生物质、活力和产量。
[0005]目前，现有的研究仅限于植物HiiCT0RNA对植物本身生理活动的调控作用，但植物microRNA对动物的生理活动的调控作用以及对植物microRNA的提取还有待研究。

【发明内容】

[0006]本发明的目的之一是提供一种具有调控非植物靶基因的功能的植物microRNA或含有所述microRNA的植物提提取物及其制法和用途。
[0007]本发明的另一目的是提供一种鉴定植物功能性microRNA的方法。
[0008]在本发明第一方面中，提供了一种分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，所述的植物功能性microRNA是来源于某一植物的内源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能。
[0009]在另一优选例中，所述的调控包括抑制(下调)靶基因的表达、促进(上调)靶基因的表达。
[0010]在另一优选例中，所述的非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
[0011]在另一优选例中，所述的植物包括:药用植物、果蔬植物、观赏植物；更佳地包括:金银花、菘蓝、草大青、马蓝、胡杨、豇豆、棉花、大白菜或马铃薯。
[0012]优选地，所述植物为金银花、菘蓝、草大青、马蓝或胡杨；更优选地，所述植物为金银花。[0013]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA种类(如丰度列前20位，更佳地前10位的microRNA种类)。
[0014]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA包括选自下组的一种或多种:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440, MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIRl56 j\ MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914(表 I)。
[0015]在另一优选例中，所述的植物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
[0016]在另一优选例中，所述的植物提取物包括植物的枝、叶、根、花、果和/或茎的提取物。
[0017]在本发明第二方面中，提供了一种如本发明第一方面所述的分离的植物功能性mi croRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物的用途,它(a)用于制备调控非植物革巴基因的组合物；或(b)用于制备治疗非植物靶基因相关疾病的药物。
[0018]在另一优选例中 ，所述非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
[0019]在另一优选例中，所述的非植物靶基因是病原体(包括细菌、病毒、衣原体等)的基因。
[0020]在另一优选例中，所述非植物靶基因相关疾病包括:肿瘤(如肝癌、肺癌);急慢性传染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如结核、细菌性肺炎等的细菌性疾病，以及病原微生物导致的急慢性传染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、如心脑血管疾病的循环系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病)。[0021 ] 在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA包括MIR2911。更佳地，所述的药物用于治疗病毒性感冒。
[0022]在本发明第三方面中，提供了一种组合物，其包含(a)药学上可接受的载体或食品学上可接受的载体以及(b)本发明第一方面所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
[0023]在另一优选例中，所述的组合物由或基本上由组分(a)和(b)构成。
[0024]在另一优选例中，组分(b)的含量为组合物总重量0.01_99wt%，较佳地0.l-90wt% (按 microRNA 计)。
[0025]在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物。
[0026]在另一优选例中，所述组合物的制备方法包括步骤:将所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物与药学上或食品学上可接受的载体混合，从而形成所述的组合物。
[0027]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA来自以下植物:药用植物、果蔬植物、观赏植物，并且调控选自下组的非植物靶基因:细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
[0028]在另一优选例中,所述的植物功能性microRNA来自金银花、蒋蓝、草大青、马蓝或胡杨。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0029]在本发明第四方面中，提供了一种体外非治疗性调控非植物靶基因表达的方法，其中，非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因，所述方法包括步骤:在本发明第一方面所述的分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培养含所述靶基因的生物材料，从而调控所述非植物靶基因的表达。
[0030]在另一优选例中，所述的靶基因是病原体(包括细菌、病毒、衣原体等)的基因。[0031 ] 在另一优选例中，所述的生物材料包括病毒、细胞、组织。
[0032]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA来自以下植物:药用植物、果蔬植物、观赏植物。
[0033]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA来自金银花、菘蓝、草大青、马蓝或胡杨。更佳地，植物功能性microRNA包括MIR2911。
[0034]在本发明第五方面中，提供了一种植物功能性microRNA的鉴定方法，其中所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能，所述方法包括步骤:
[0035](I)提供某一植物的提取物；
[0036](2)检测所述提取物中植物内源性microRNA的种类或水平；
[0037](3)将被检测到的植物microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析，从而鉴定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。
[0038]在另一优选例中，所述的非植物靶基因包括基因数据库中的基因。
[0039]在另一优选例中，所述非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
[0040]在另一优选例中，所述的非植物靶基因是病原体基因。
[0041]在另一优选例中，所述的植物包括药用植物，果蔬植物。
[0042]在另一优选例中，在步骤(3)中挑选提取物中丰度列前20位(更佳地前10位)的microRNA种类进行比对和分析。
[0043]在另一优选例中，在步骤(3)中挑选比值Lm/La≥130% (较佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA种类进行对比和分析，其中Lm为某一植物microRA在提取物中的丰度(或水平)，La为所述植物总microRNA的平均丰度(或水平)。
[0044]在本发明第六方面中，提供了一种由本发明第五方面所述的方法所鉴定出的植物功能性microRNA分子。
[0045]在另一优选例中，所述microRNA分子包括MIR2911。
[0046]在本发明第七方面中，提供了一种制备组合物的方法，包括步骤:
[0047]人工合成本发明第六方面所述的植物功能性microRNA分子；以及
[0048]将所述的植物功能性microRNA分子与药学上或食品学上可接受的载体混合，从而形成组合物。
[0049]在本发明第八方面中，提供了一种microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制备治疗病毒性感冒的药物。
[0050]在另一优选例中，所述的提取物(未浓缩或浓缩)中含0.01_100nM(较佳地0.1-20ηΜ)的 MIR2911。
[0051]在本发明第九方面中，提供了一种预防或治疗疾病的方法，其中所述疾病是与非植物靶基因相关的疾病，所述方法包括步骤:给需要的对象施用本发明第一方面所述分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本发明第三方面所述的组合物，从而预防或治疗所述的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能。
[0052]在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物(如人)。
[0053]在另一优选例中，所述的非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
[0054]在另一优选例中，所述的非植物靶基因是病原体基因。
[0055]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】

【附图说明】
[0056]图1显示植物microRNA在金银花水提液中Solexa测序结果。
[0057]图2A是小鼠灌胃金银花水提液后，金银花microRNA在不同时间点血清中表达量的Real-time PCR结果。检测时间点为Oh (O小时)、2h(2小时)、4h(4小时)、6h(6小时)。
[0058]图2B是小鼠灌胃金银花水提液后，金银花microRNA在不同时间点肝脏和肺中表达量的Real-time PCR结果。检测时间点为Oh (O小时)、5h (5小时)、IOh (10小时)、15h (15小时)、20h(20小时)、25h(25小时)。
[0059]图3显示MIR2911预测祀基因的序列分析结果。mfe表示候选祀基因的最低折叠自由能，mfe绝对值越大，候选靶基因与Peu-MIR2911序列匹配度越高。
[0060]图4显示荧光素酶检测预测靶基因的结果。预测基因包括ADV基因、HPIV基因、HlNl基因、H5N1基因。
[0061]图5A是利用Real-time PCR技术检测病毒基因ADV5在MDCK细胞中的含量。
[0062]图5B是利用Real-time PCR技术检测病毒基因HlNl在MDCK细胞中的含量。
[0063]图5C是利用Real-time PCR技术检测病毒基因H5N1在MDCK细胞中的含量。
[0064]图5A、图5B和图5C中，“未感染”代表未侵染流感病毒的细胞；“感染未处理”代表侵染流感病毒且未用任何药物处理的细胞；“MIR2911”代表侵染流感病毒且用MIR2911处理的细胞；“NC”代表侵染流感病毒且用MIR2911的无义序列RNA处理的细胞；“达菲”代表侵染流感病毒且用达菲(奥塞米韦，特异性流感病毒神经氨酸酶抑制药)处理的细胞。
[0065]图6显示MIR2911在转染MIR2911的HEK 293T细胞分泌的载有MIR2911的细胞微粒子中的Real-time PCR结果。以未转染MIR2911的HEK 293T细胞分泌的细胞微粒子作为对照MV。[0066]图7A是流感病毒ADV在载有MIR2911的细胞微粒子处理的HEK 293T细胞中的表达量。[0067]图7B是流感病毒HlNl在载有MIR2911的细胞微粒子处理的HEK 293T细胞中的表达量。[0068]图7A和图7B中，以感染流感病毒后不作处理作为空白对照和未载有MIR2911的细胞微粒子处理的ffiK 293T细胞作为阴性对照。[0069]图8A显示小鼠饮用金银花水提液、金银花水提液+anti_MIR2911 ( 口服组)、灌肺金银花水提液+ant1-MIR2911(灌肺组)后，感冒病毒ADV在肺表达的Real-time PCR结果。[0070]图SB显示小鼠饮用金银花水提液、金银花水提液+anti_MIR2911 ( 口服组)、灌肺金银花水提液+ant1-MIR2911 (灌肺组)后，感冒病毒HlNl在肺表达的Real-time PCR结果。[0071]图9显示服用金银花水提液后，人血液中MIR2911的Real-time PCR结果。[0072]检测时间点为0h(0小时)、lh(l小时)、2h(2小时)、3h(3小时)、4h(4小时)、5h(5小时)、6h (6小时)。
【具体实施方式】[0073]本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现一种稳定存在于植物提取物中的可分离的植物内源性microRNA或含有所述microRNA的植物提取物,可用于调控动物体内所述内源性miCToRNA靶基因的表达，进而用于调控动物的生理病理活动。因此，可用于指导制备药物或功能性食物等。在此基础上，发明人完成了本发明。[0074]如本文所用，“osa”表示水稻；“peu”表示胡杨。[0075]分离的植物功能性microRNA[0076]本发明所述的植物功能性microRNA为所述植物内源性的microRNA,可稳定存在于该植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中。优选为所述的植物功能性microRNA是所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中富含的microRNA种类(如丰度列前20位，更佳地前10位的microRNA种类)。此外，本发明的microRNA包括各种形式，例如pr1-microRNA、pre-mi croRNA 以及 microRNA 成熟体。[0077]所述植物功能性microRNA的例子包括(但并不限于)选自表1的一种或多种microRNA,尤其是选自下组的一种或多种:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916。[0078]在另一优选例中，所述的植物包括药用植物、果蔬植物、观赏植物；较佳地包括金银花、菘蓝、草大青、马蓝、胡杨、豇豆、棉花、大白菜或马铃薯；更佳地，所述植物为金银花、菘蓝、草大青、马蓝或胡杨；最佳地，所述植物为金银花。[0079]本发明所述含所述植物功能性microRNA的提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物，例如植物的枝、叶、根、花、果和/或茎的提取物。[0080]提取方法(植物提取物的制法)[0081]本发明所述的植物microRNA的提取方法主要采用溶剂提取法，即采用溶剂从植物中提取其microRNA。其中，所述的溶剂包括水、亲水性溶剂、或其组合。所述组合包括:在水中添加适量的亲水性溶剂或在亲水性溶剂中添加适量的水。应理解，溶剂中还可添加适量的辅助试剂，如pH调节剂(如酸或碱)等。
[0082]提取可以在任何适宜的温度(如常温~溶剂回流的温度)下进行，优选采用浸溃法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续提取法等。
[0083]在提取过程中，可对植物进行预处理，例如将植物粉碎或进行酶处理(如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、葡聚糖酶、以及夏合酶)等；也可对提取的混合物进行后处理，如将植物用水进行提取后，可在提取后的混合物中加入亲水性溶剂(如乙醇等)，使得混合物经陈化沉淀。
[0084]提取后得到的液体物可直接使用，也可进行过滤、浓缩、干燥(如冻干)等处理后制得固体物，然后再使用。
[0085]优选地，本发明所述的植物microRNA的提取方法为水提法。
[0086]例如包括步骤:取适量金银花，粉碎后，在一定温度(如室温~回流)下，将金银花粉末置于水浴中，加热若干次(如I~5次)，每次保温一段时间(如0.1~10小时)，收集液体，备用。
[0087]或包括步骤:取适量金银花，粉碎后，在一定温度(如室温~回流)下，将金银花粉末置于水浴中，加热若干次(如I~5次)，每次保温一段时间(如0.1~10小时)，将提取液浓缩至一定体积后，加入适量乙醇，沉淀出大部分的粘液质，过滤，收集滤液，备用。
[0088]检测
[0089]对植物进行提取后，收集植物提取物,检测提取物中植物microRNA的种类及其含量。所用的测试方法可以是本领域常规方法，例如(但不限于)=Solexa测序技术，Real-time PCR、RT-PCR、微·阵列芯片、原位杂交、Northern Blotting、恒温滚环扩增、基于共轭聚合物的microRNA检测等。
[0090]所述Solexa测序技术方法,优选包括步骤:
[0091 ] 收集金银花组织或汤药样本；
[0092]通过Trizol试剂提取样本总RNA ；
[0093]进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子；
[0094]将接头引物(adaptor primer)酶联在小RNA分子的3’与5，端；
[0095]纯化的DNA直接用于集群生成,利用Illumina Genome Analyzer进行测序分析。
[0096]Real-time PCR方法,优选包括步骤:
[0097]提取样本中总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；
[0098]用植物mi croRNA设计引物；
[0099]加入TaqMan探针或者荧光染料进行PCR反应；
[0100]检测样本中植物microRNA的量的变化。
[0101]鉴定
[0102]本发明提供了一种植物功能性microRNA鉴定方法，其中所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能，包括步骤:
[0103](I)提供某一植物(包括药用植物，果蔬植物)的提取物；
[0104](2)检测所述提取物中植物内源性microRNA的种类或水平；
[0105](3)将被检测到的植物microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析，从而鉴定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性mi croRNA。[0106]在另一优选例中，所述的非植物靶基因包括基因数据库中的基因。优选地，所述非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因；或所述的非植物靶基因是病原体基因。
[0107]在另一优选例中，在步骤(3)中挑选提取物中丰度列前20位(更佳地前10位)的microRNA种类进行比对和分析。
[0108]在另一优选例中，在步骤(3)中挑选比值Lm/La≥130% (较佳地≥150% ;更佳地≥200%)的植物microRNA种类进行对比和分析，其中Lm为某一植物microRNA在提取物中的丰度(或水平)，La为所述植物总microRNA的平均丰度(或水平)。
[0109]由所述方法鉴定出的植物功能性microRNA分子包括MIR2911。
[0110]用途 [0111]本发明所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物具有如下多个应用:
[0112]一、指导功能性组合物的开发或制造
[0113]本发明所述组合物的活性成分为所述植物功能性microRNA或包含所述植物功能性microRNA的植物提取物。其中，所述的植物功能性microRNA (如MIR2911等)具有调控非植物靶基因的功能。可用于(a)制备调控非植物靶基因的组合物；或(b)制备治疗非植物靶基因相关疾病的药物。其中，所述的调控包括抑制(下调)靶基因的表达、促进(上调)靶基因的表达。
[0114]在另一优选例中，所述非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因；或所述的非植物靶基因是病原体(包括细菌、病毒、衣原体等)的基因。
[0115]在另一优选例中，所述非植物靶基因相关疾病包括:肿瘤(如肝癌、肺癌)；急慢性传染病(如病毒性流感、病毒性肝炎、艾滋病、SARS等的病毒性疾病，如结核、细菌性肺炎等的细菌性疾病，以及病原微生物导致的急慢性传染病)；其它急慢性疾病(如呼吸系统疾病、免疫系统疾病、血液与造血系统疾病、如心脑血管疾病的循环系统疾病、内分泌系统代谢性疾病、消化系统疾病、神经系统疾病、泌尿系统疾病、生殖系统疾病和运动系统疾病)。
[0116]组合物
[0117]本发明所述组合物(包括药物组合物、食品组合物或保健品组合物)可包含:(a)药学上可接受的载体或食品学上可接受的载体；以及(b)活性成分。
[0118]优选地，所述的组合物由或基本上由组分(a)和(b)构成。
[0119]在另一优选例中，组分(b)的含量为组合物总重量0.01_99wt%，较佳地0.l-90wt% (按 microRNA 计)。
[0120]所述组合物的制备方法包括步骤:将所述的植物功能性microRNA或含所述功能性microRNA的植物提取物与药学上或食品学上可接受的载体混合，从而形成所述的组合物。
[0121]现以药物组合物为例，对组合物作进一步说明:本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的活性成分及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有l-2000mg活性成分/剂，更佳地，含有10-200mg活性成分/剂。或者含有0.01~100微摩尔活性成分/剂，较佳地为0.1~10微摩尔/剂；较佳地，所述的“一剂”为一口服液。[0122]“药学上可以接受的载体”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温? )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
[0123]本发明组合物的给药方式包括:口服、呼吸道、注射、透皮、粘膜或腔道给药。
[0124]本发明组合物的剂型包括:片剂、胶囊剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液、混悬液、乳剂、混悬剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、挥发性液体、注射液、粉针剂、外用溶液剂、洗剂、浇淋剂、搽剂、巴布膏剂、膏药、橡胶膏剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、滴眼剂、滴鼻剂、眼用软膏剂、含漱剂、舌下片剂或栓剂。 [0125]优选地，本发明提供了一种microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，用于制备治疗病毒性感冒的药物。较佳地，所述的提取物(未浓缩或浓缩)中含0.01-1OOnM (较佳地 0.1_20ηΜ)的 MIR2911。
[0126]二、指导人工合成植物功能性microRNA
[0127]通过本发明所述的方法鉴定出植物中(尤其是植物提取中)存在的植物功能性microRNA,可直接指导技术人员对所述microRNA进行人工合成,从而提高所述的microRNA的生产。并将合成的植物功能性microRNA分子与药学上或食品学上可接受的载体混合，从而形成组合物。
[0128]三、体外非治疗性调控非植物靶基因表达
[0129]在本发明所述的分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下，培养含非植物靶基因(如细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因)的生物材料(包括病毒、细胞、组织)，从而实现体外调控所述非植物靶基因的表达
[0130]在另一优选例中，所述的靶基因是病原体(包括细菌、病毒、衣原体等)的基因。
[0131]在另一优选例中，所述的植物功能性microRNA来自以下植物:药用植物、果蔬植物、观赏植物；较佳地，来自金银花、菘蓝、草大青、马蓝或胡杨；更佳地，所述植物功能性microRNA 包括 MIR2911。
[0132]四、疾病预防或治疗方法
[0133]给需要的对象(如哺乳动物或人))施用本发明所述分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物、或本发明所述的组合物，从而实现预防或治疗与非植物靶基因相关的疾病，其中所述的植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因(包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因)的功能。
[0134]在另一优选例中，所述的非植物靶基因是病原体基因。
[0135]发明人通过对植物功能性microRNA及其进入动物体内后的存在形式、递送途径和功能等一系列研究，1.形成了一套高效、稳定地提取植物功能性micix)RNA的方法，提供了一种包含植物功能性microRNA的植物提取物。2.发现了通过多种途径(如摄食或静脉注射等)，植物(如金银花等)功能性microRNA可进入动物体并在血液中富集,并调节非植物靶基因，进而参与动物体(如人)的生理病理活动。3.形成了一套鉴定植物功能性microRNA的方法,可用于指导选择性合成植物功能性microRNA的方法,有利于加快该microRNA的生产；还可用于指导筛选富含植物功能性microRNA的药材,有利于鉴别药材的优劣。4.形成了一套指导制造功能性食物或药物的方法:4.1所述方法利用分离的植物功能性mi croRNA或包含植物功能性mi croRNA的植物提取物或筛选出的富含功能性mi croRNA的植物，可用于制造功能性食物或药物等组合物；4.2所述方法通过提取植物microRNA并鉴定出植物功能性microRNA，并进行所述植物功能性microRNA的人工合成，然后将人工合成的microRNA用于制造功能性食物或药物。
[0136]本发明主要优点包括:
[0137]1.提供了一种分离的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物及其用途。所述microRNA为可调控非植物靶基因的表达，具有多种用途(如可作为中草药有效成分的标准，有利于指导功能性组合物的开发和制造等)。
[0138]2.提供了一种以分离的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物为活性成分的组合物。所述活性成分的作用机理明确，效果显著，有利于对中医药的科学机制的探索，且制法简单、成本低廉，适合工业化生产。
[0139]3.提供了一种鉴定植物功能性microRNA的方法。
[0140]下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0141]实施例1使用Solexa`测序技术检测稳定存在于金银花水提液中的植物microRNA
[0142]首先，利用水提法提取金银花microRNA。取适量(50克)干燥金银花药材，在500ml (金银花质量与水体积比为1:10)水的100°C水浴下加热0.5小时，提取液在60°C下减压浓缩至原体积的1/10。收集浓缩及未浓缩金银花水提液，用于后续实验。
[0143]然后，使用Solexa测序技术检测稳定存在于经上述步骤制备出的金银花水提液中的植物microRNA, Solexa上样量为IOyg RNA。经测定,未浓缩水提液中总microRNA的浓度约为InM，浓缩水提液中总microRNA浓度约为ΙΟηΜ。
[0144]检测结果显示，金银花水提液中稳定存在多种植物miCToRNA，能被检测到的包括表1中所列出的85种microRNA,其序列详见表1。其中MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916 含量较高，MIR2911 的含量最高。具体结果见图1。表1中其他75种miRNA在提取物中检测出拷贝数均较低(都在2-1000 之间)。
[0145]表1.稳定存在于金银花中且可检测的microRNAs
[0146]
【权利要求】
1.一种分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物,其特征在于，所述的植物功能性microRNA是来源于某一植物的内源性microRNA且存在于所述植物的水溶性和/或脂溶性的提取物中，而且所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能。
2.如权利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因。
3.如权利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植物包括:药用植物、果蔬植物、观赏植物。
4.如权利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性mi croRNA的提取物，其特征在于，所述的植物功能性microRNA包括选自下组的一种或多种:MIR156h、MIR166f、MIR396a、MIR166a、MIR168a、MIR1440、MIR2910、MIR2911、MIR2915、MIR2916、MIR818d、MIR159e、MIR159c、MIR156j、MIR1432、MIR166k、MIR167b、MIR396c、MIR156e、MIR169k、MIR167c、MIR160d、MIR399a、MIR156d、MIR160e、MIR169n、MIR1661、MIR159f、MIR166c、MIR159b、MIR166j、MIR1671、MIR169c、MIR164c、MIR167j、MIR167g、MIR160c、MIR399e、MIR399b、MIR529b、MIR164e、MIR166d、MIR166h、MIR164b、MIR156f、MIR164a、MIR1691、MIR166m、MIR164f、MIR156k、MIR166g、MIR 166b、MIR160b、MIR166e、MIR159d、MIR818e、MIR172a、MIR156b、MIR399g、MIR169b、MIR399f、MIR167a、MIR394、MIR156a、MIR1661、MIR167f、MIR319a、MIR156g、MIR166n、MIR399c、MIR160a、MIR159a.1、MIR156c、MIR319b、MIR169o、MIR167h、MIR1561、MIR167d、MIR169a、MIR172d、MIR818b、MIR164d、MIR167e、MIR396b、MIR2914。
5.如权利要求1所述的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物，其特征在于，所述的植 物提取物包括植物的水溶性和/或脂溶性的提取物。
6.一种权利要求1所述的分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物的用途，其特征在于，(a)用于制备调控非植物靶基因的组合物；或(b)用于制备治疗非植物靶基因相关疾病的药物。
7.一种组合物，其特征在于，包含(a)药学上可接受的载体或食品学上可接受的载体以及(b)权利要求1所述的植物功能性microRNA和/或含所述植物功能性microRNA的植物提取物。
8.—种体外非治疗性调控非植物靶基因表达的方法，其中，非植物靶基因包括细菌基因、病毒基因、衣原体基因、酵母基因、动物基因，其特征在于，包括步骤:在权利要求1所述的分离的植物功能性microRNA或含所述植物功能性microRNA的提取物存在下,培养含所述靶基因的生物材料，从而调控所述非植物靶基因的表达。
9.一种植物功能性microRNA的鉴定方法，其中所述植物功能性microRNA具有调控非植物靶基因的功能，其特征在于，包括步骤: (1)提供某一植物的提取物； (2)检测所述提取物中植物内源性miCToRNA的种类或水平； (3)将被检测到的植物microRNA的序列与非植物靶基因进行比对和分析，从而鉴定出具有调控非植物靶基因的功能的植物功能性microRNA。
10.一种由权利要求9所述的方法所鉴定出的植物功能性microRNA分子。
11.一种制备组合物的方法，其特征在于，包括步骤: 人工合成权利要求10所述的植物功能性microRNA分子；以及将所述的植物功能性microRNA分子与药学上或食品学上可接受的载体混合，从而形成组合物。
12.—种microRNA分子MIR2911或含MIR2911的提取物的用途，其特征在于，用于制备治疗病毒性感冒的药物。
【文档编号】A61P25/00GK103589721SQ201210291378
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月15日 优先权日:2012年8月15日
【发明者】张辰宇, 张峻峰, 曾科, 董磊 申请人:北京命码生科科技有限公司