专利名称：一种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及ー种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。
背景技术：
鸭病毒性肝炎(Duck virus Hepatitis,简称DVH)是雏鸭的ー种急性致死性传染病。该病发生于孵化雏鸭的季节，一旦发生，在雏鸭群中传播很快，发病率可达100%。其临 床表现主要是角弓反张，病变主要为肝脏肿大并有出血斑点。本病最早发生于美国，其后在英国、加拿大、德国、意大利、印度等国陆续流行。我国自1958年在上海首次分离到鸭肝炎病毒DHV以来，相继在全国许多省市流行发生，造成巨大的经济损失，已成为影响养鸭业健康发展的重要威胁。鸭肝炎病毒有3个血清型，即I、II、III，DVH病毒I型属于小RNA病毒科，呈球形或类球形，直径在20-40NM，无囊膜，无血凝性，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔増殖。病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活，目前普遍存在的鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒I型引起的。DVH病毒II型属于星状病毒，DVH-III属于小RNA病毒。DVH病毒三种血清型之间无交叉保护作用。鸭病毒性肝炎病毒与鸭こ型肝炎病毒无任何相关性。近年来鸭病毒性肝炎已在我国蔓延，严重阻碍了我国养鸭业的健康发展，出现了使用I型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗或高免卵黄抗体预防或治疗无效的鸭群爆发疑似鸭肝炎的现象，怀疑为I型鸭肝炎变异株或新型鸭肝炎。用弱毒疫苗免疫雏鸭，受雏鸭本身免疫机能和母源抗体的影响，造成了鸭病毒性肝炎的局部暴发，给养殖业造成了巨大的损失。
发明内容
本发明的目的还在于提供ー种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。本发明的目的还在于提供ー种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备方法。为了实现以上目的，本发明鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备步骤为以I型鸭病毒性肝炎制备为例，(I)鸭病毒性肝炎病毒尿囊液的制备将鸭病毒性肝炎病毒接种9日龄的鸡胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中进行孵化至第5 7天，如果出现死亡、发育不良时，立刻进行尿囊液的收获，置于_80°C冰箱进行保存；(2)培养病毒将步骤(I)中的鸭病毒性肝炎病毒尿囊液接种单层鸭胚成纤维细胞，37°C培养，每隔10 12h观察细胞，如果细胞病变达到80%时，收获细胞，-20°C和室温反复冻融3次,5000r/min离心20 40min,取上清液,弃沉淀,上清液在14000r/min离心
I.5 2. 5h，病毒含量达到IO7EID5tlA). ImL吋，收集鸭病毒性肝炎病毒；(3)脂类混合物的制备将磷脂酰こ醇胺和胆固醇加至浓度为20%的mega- ο中，使溶解完全，稀释至8 12mg/mL，分装，2 8°C保存备用；(4)皂苷QuilA溶液的制备将O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL, pH为6. 8的PBS缓冲液中，终浓度lmg/mL ；(5)鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备pH为7. 2的PBS缓冲液稀释病毒液到蛋白浓度为10mg/mL，加入浓度为20%的mega-ΙΟ至其终浓度为2%，室温作用2 3h，将病毒液铺到蔗糖垫上，上层为PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖垫，14000r/min离心2 3h，收集样品层和10%的蔗糖层，加入皂苷QuilA和脂类混合物，其中皂苷质量含量为O. I O. 2%,脂类混合物在复合物中的浓度为50 IOOuL/mL,将此溶液加入透析袋中进行48 54h的透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。本发明复合物毒副作用小，免疫抗体效价高。
具体实施例方式下面结合一些具体实施方式
对本发明进ー步详细介绍。 实施例I(I)鸭病毒性肝炎病毒尿囊液的制备将鸭病毒性肝炎病毒接种9日龄的鸡胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中进行孵化至第5天时，观察鸡胚是否出现死亡或者发育不良或水肿。如果出现死亡或者发育不良和水肿时，立刻进行尿囊液的收获。收集的尿囊液放在_80°C冰箱进行保存。如果第7天没有出现观察鸡胚是否出现死亡或者发育不良则不能再收集,弃去全部鸡胚；(2)培养病毒将准备好的鸭病毒性肝炎病毒尿囊液接种单层鸭胚成纤维细胞，37°C培养，每隔12h进行观察细胞，如果细胞病变达到80%时，收获细胞，-20°C和室温反复冻融3次,5000r/min离心30min,取上清液,弃沉淀,上清液在14000r/min离心2h,取少量样品进行负染电镜观察。病毒含量达到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步实验；(3)脂类混合物贮存液的制备将磷脂酰こ醇胺和胆固醇加至浓度为20%的mega-10中，使溶解完全,稀释至终浓度为8mg/mL,分装,8°C保存备用；(4)皂苷QuilA溶液的制备将O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH为6. 8的PBS缓冲液中，终浓度lmg/mL ；(5)鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备用pH为7. 2的PBS缓冲液将病毒液稀释到蛋白浓度为10mg/mL，加入浓度为20的％mega-10至其终浓度为2%，室温作用3h，将病毒液铺到蔗糖垫上，上层为PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖垫，14000r/min离心2h，收集样品层和10%的蔗糖层，加入O. 1%量的皂苷QuilA和脂类混合物50uL/mL，将此溶液加入透析袋中进行48h的透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。实施例2(I)鸭病毒性肝炎病毒尿囊液的制备将鸭病毒性肝炎病毒接种9日龄的鸡胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中进行孵化至第6天时，观察鸡胚是否出现死亡或者发育不良或水肿。如果出现死亡或者发育不良和水肿时，立刻进行尿囊液的收获。收集的尿囊液放在_80°C冰箱进行保存；(2)培养病毒将准备好的鸭病毒性肝炎病毒尿囊液接种单层鸭胚成纤维细胞，37°C培养，每隔IOh进行观察细胞，如果细胞病变达到80%时，收获细胞，-20°C和室温反复冻融3次,5000r/min离心40min,取上清液,弃沉淀,上清液在14000r/min离心I. 5h,取少量样品进行负染电镜观察。病毒含量用。病毒含量达到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步实验;(3)脂类混合物贮存液的制备将磷脂酰こ醇胺和胆固醇加至浓度为20%的mega-10中，使溶解完全,稀释至终浓度为10mg/mL分装,5°C保存备用；(4)皂苷QuilA溶液的制备将O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH为6. 8的PBS缓冲液中，终浓度lmg/mL ；(5)鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备用pH为7. 2的PBS缓冲液将病毒液稀释到蛋白浓度为10mg/mL，加入20%mega-10至终浓度为2%，室温作用2. 5h，将病毒液铺到蔗糖垫上，上层为PBS配制的10%蔗糖(含有O. 5%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖垫，14000r/min离心2. 5h，收集样品层和10%的蔗糖层，加入O. 2%量的皂苷QuilA和脂类混合物lOOuL/mL，将此溶液加入透析袋中进行50h的透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。·实施例3(I)鸭病毒性肝炎病毒尿囊液的制备将鸭病毒性肝炎病毒接种9日龄的鸡胚尿囊腔中増殖，放在孵化箱中进行孵化至第7天时，观察鸡胚是否出现死亡或者发育不良或水肿。如果出现死亡或者发育不良和水肿时，立刻进行尿囊液的收获。收集的尿囊液放在_80°C冰箱进行保存；(2)培养病毒将准备好的鸭病毒性肝炎病毒尿囊液接种单层鸭胚成纤维细胞，37°C培养，每隔Ilh进行观察细胞，如果细胞病变达到80%时，收获细胞，-20°C和室温反复冻融3次,5000r/min离心20min,取上清液,弃沉淀,上清液在14000r/min离心2. 5h,取少量样品进行负染电镜观察。病毒含量达到IO7EID5tlA). ImL才能被用做下步实验；(3)脂类混合物贮存液的制备将磷脂酰こ醇胺和胆固醇加至浓度为20%的mega-ΙΟ中，使溶解完全，稀释至终浓度为12mg/mL，分装，2°C保存备用；(4)皂苷QuilA溶液的制备将O. Olg皂苷QuilA溶于IOmL pH为6. 8的PBS缓冲液中，终浓度lmg/mL ；(5)鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备用pH为7. 2的PBS缓冲液将病毒液稀释到蛋白浓度为10mg/mL，加入20%mega-10至终浓度为2%，室温作用2h，将病毒液铺到蔗糖垫上，上层为PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖垫，14000r/min离心3h，收集样品层和10%的蔗糖层，加入O. 15%量的皂苷QuilA和脂类混合物80uL/mL，将此溶液加入透析袋中进行54h的透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。
权利要求
1.ー种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物，其特征在于该复合物由鸭病毒性肝炎病毒与皂苷QuilA、脂类混合物在蔗糖垫上制备而成。
2.如权利要求I所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物，其特征在于皂苷QuilA的质量含量为O. I O. 2%ο
3.如权利要求I所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物，其特征在于脂类混合物由磷脂酰こ醇胺、胆固醇和浓度为20%的mega-ΙΟ混合而成。
4.如权利要求3所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物，其特征在于脂类混合物的浓度为 50 100uL/mL。
5.一种如权利要求I所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备方法，其特征在于制备步骤包括 (O鸭病毒性肝炎病毒尿囊液的制备将鸭病毒性肝炎病毒接种9日龄的鸡胚尿囊 腔中増殖，放在孵化箱中进行孵化至第5 7天，如果出现死亡或者发育不良吋，立刻进行尿囊液的收获，置于_80°C冰箱进行保存；如果鸡胚超过第7天没有出现死亡或者发育不良应立刻弃去鸡胚； (2)培养病毒将步骤(I)中的鸭病毒性肝炎病毒尿囊液接种单层鸭胚成纤维细胞，37°C培养，每隔10 12h观察细胞，如果细胞病变达到80%时，收获细胞，-20°C和室温反复冻融3次,5000r/min离心20 40min,取上清液,弃沉淀,上清液在14000r/min离心I. 5 2.5h，获得鸭病毒性肝炎病毒； (3)脂类混合物的制备将磷脂酰こ醇胺和胆固醇加至浓度为20%的mega-ΙΟ中，使溶解完全，稀释至8 12mg/mL,分装,2 8°C保存备用； (4)皂苷QuilA溶液的制备将O.Olg皂苷QuilA溶于IOmL PBS缓冲液中，终浓度Img/mL ； (5)鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备磷酸盐缓冲液PBS稀释病毒液到蛋白浓度为10mg/mL，加入浓度为20%的mega-ΙΟ至其终浓度为2%，室温作用2 3h，将病毒液铺到蔗糖垫上，上层为PBS配制的10%蔗糖(含有O. 4%mega-10)，最下面是用PBS配制的30%蔗糖垫，14000r/min离心2 3h,收集样品层和10%的鹿糖层，加入阜苷QuilA和脂类混合物，其中皂苷质量含量为O. I O. 2%,脂类混合物在复合物中的浓度为50 100uL/mL，将此溶液加入透析袋中进行48 54h的透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。
6.如权利要求5所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备方法，其特征在于步骤(2)获得的鸭病毒性肝炎病毒含量彡IO7EID5tlA). lmL。
7.如权利要求5所述的鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物的制备方法，其特征在于步骤(4)和步骤(5)中磷酸盐缓冲液PBS pH分别为6. 8和7. 2。
全文摘要
本发明公开了一种鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物，具体是将病毒性肝炎病毒接种鸡胚，收集尿囊液，并在单层鸭胚成纤维细胞中培养，获得的鸭病毒性肝炎病毒含量≥107EID50/0.1mL，然后将此病毒液于蔗糖垫上，离心，收集样品层和10%的蔗糖层，加入皂苷QuilA和脂类混合物，进行透析，即制得鸭病毒性肝炎免疫刺激复合物。本发明复合物免疫活性高，毒副作用小。
文档编号A61K39/29GK102836427SQ20121030992
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者吴红云, 韩改会, 徐进 申请人:郑州后羿制药有限公司